一种新型肠粘膜抗氧化活性肽及其制备方法与流程

本发明涉及一种新型肠粘膜抗氧化活性肽及其制备方法，属于动物副产资源综合利用领域。

背景技术：

抗氧化肽作为生物活性肽的一种，是研究最多的生物活性肽，它具有清除自由基和抑制活性氧形成等功能。抗氧化肽能够影响其他的生物活性，与一些生理调节功能，如免疫调节、降胆固醇、抗肿瘤等有一定关系。许多研究发现，食物源蛋白质中存在具有抗氧化活性的肽序列，其活性高于蛋白质和氨基酸，通过酶工程技术可以将其释放出来。食物源抗氧化肽因其无毒，高效、安全和结构特殊等特点成为开发天然抗氧化剂的一种潜在基料。

我国是世界上最大的天然猪肠衣生产国，其年产量约占世界天然肠衣产量的80%，年出口天然肠衣60多万桶，出口金额约10亿美元。但在肠衣加工过程中产生的大量加工副产物肠粘膜随污水直接排放，易产生腥臭，污染环境。而猪肠粘膜蛋白是一种营养性动物蛋白原料，由猪肠粘膜水解制得，不仅富含蛋白质、脂肪、纤维和钙等矿物质元素，还有多种氨基酸、多肽类和核苷酸类物质，如果随污水直接排放，会造成大量的蛋白资源浪费。因此利用天然肠衣加工副产物肠粘膜制备活性多肽，提高动物副产物的再生利用价值，不仅可以实现动物副产物资源的循环利用，提升蛋白质资源的利用率，又可以从源头减少环境污染，促进天然肠衣的可持续发展。

目前，有关酶解法制备肠粘膜多肽工艺优化方面和酶解液中是否存在生物活性肽的研究鲜有报道。本发明产品分子量分布范围在1000-1250da，能够清除自由基，是一种安全的可作为抗氧化剂的肠粘膜抗氧化活性肽。

技术实现要素：

本发明的目的就是针对上述现有问题，提供一种新型肠粘膜抗氧化活性肽及其制备方法，并且可以将该抗氧化肽应用于食品添加剂的研制与开发。

本发明的目的是这样实现的，一种新型肠粘膜抗氧化活性肽，其特征在于，抗氧化活性肽氨基酸序列为：

asp-gly-leu-lys-his-leu-asp-asn-leu-lys和asn-asp-trp-glu-asp-his-leu-ala-val-lys。

所述抗氧化活性肽来源于肠粘膜蛋白。

一种制备肠粘膜抗氧化活性肽的方法，其特征在于，从天然肠衣加工副产物-肠粘膜蛋白通过如下方法制得：

（1）肠粘膜经过滤除杂，于烘箱中烘干，常温冷却后4℃保存；称取5g肠粘膜溶于25ml磷酸缓冲液（ph6.5），得到第一溶液；第一溶液用匀浆机充分混匀，条件：10000r/min，每次10s，重复1-2次；

（2）在经步骤（1）充分混匀的第一溶液中添加木瓜蛋白酶，酶加量4000~5000u/g，40~50℃水解5~7h，沸水浴灭酶活5~10min，得到酶解液；然后将酶解液用高速冷冻离心机离心，条件：4000g，15min，4℃；取上清液冷冻干燥，得到肠粘膜蛋白的酶解产物，即冻干粉，将冻干粉保存在干燥皿中；

（3）冻干粉利用超滤用去离子水配制浓度为50mg/ml的多肽溶液，选用截留分子量别分为3.0kda的超滤膜，3000g离心10min，对多肽溶液进行分级分离，收集组分rsh-ι（mw>3.0kda）、rsh-ii（mw<3.0kda），冷冻干燥后检测各组分抗氧化能力，将抗氧化活性高的组分进行下一步分离纯化；

（4）凝胶过滤色谱将预处理过的sephadexg-25装于规格为16×600mm的层析柱中，采用去离子水平衡，流速为1.0ml/min；将超滤分离得到的抗氧化活性最强的组分溶于去离子水中配置成50mg/ml的溶液，上柱，用去离子水进行洗脱，并用分步收集器收集洗脱液（6ml/管），于280nm处检测并收集组分峰，冷冻干燥即得所述肠粘膜抗氧化肽。

本发明的有益效果：本发明提供的一种新型肠粘膜抗氧化活性肽及其制备方法，所述抗氧化肽首次从天然肠衣加工副产物-肠粘膜中分离鉴定得到，该多肽具有较多的疏水性氨基酸和较强的抗氧化活性，对dpph自由基具有强的清除作用，具有很好的还原力；表明其在抗氧化活性开发和应用方面有重要价值。该多肽是小分子多肽，稳定性强，结构易于调控，具有较好的应用潜力。制备方法简单，易于大规模生产等优点。本发明对提高天然肠衣产品的工业附加值，减少环境污染，推动肠衣加工副产物资源的综合利用，具有重要的社会效益，经济效益或生态效益。

附图说明

图1为肠粘膜酶解物超滤分离组分的抗氧化活性。

图2为肠粘膜酶解物sephadexg-25凝胶过滤色谱图。

图3为凝胶色谱分离纯化后各组分抗氧化活性。

图4为肠粘膜抗氧化肽ms图谱（a1）。

图5为肠粘膜抗氧化肽ms图谱（a2）。

图6为纯化肽和合成肽的抗氧化活性比较。

图6中，合成肽1（1152.64da），合成肽2（1226.58da）。图中小写字母a表示不同组分dpph自由基清除率之间不存在显著性差异；小写字母b表示不同组分还原力之间不存在显著性差异（p>0.05）。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细地说明。

实施例1

本发明所述抗氧化肽的制备方法如下：

肠粘膜蛋白的提取：新鲜肠粘膜经过滤除杂，于烘箱中烘干，常温冷却后4℃保存；称取5g肠粘膜溶于25ml磷酸缓冲液（ph6.5）；溶液用匀浆机充分混匀，条件：10000r/min，每次10s，重复1-2次；配制料液比1:4肠粘膜溶液，10000rpm匀浆10s，加入木瓜蛋白酶，酶加量为5000u/g蛋白，酶解温度50℃，酶解时间6h，沸水浴灭活5min，4000r/min离心15min，收集上清液冷冻干燥备用。

超滤分离肠粘膜抗氧化肽：按上述方法获得肠粘膜蛋白酶解物冻干粉，用去离子水配制浓度为50mg/ml的多肽溶液，选用截留分子量别分为3.0kda的超滤膜，3000g离心10min，对多肽溶液进行分级分离，收集组分rsh-ι（mw>3.0kda）、rsh-ii（mw<3.0kda），冷冻干燥后检测各组分抗氧化能力。

凝胶色谱分离纯化：将预处理过的sephadexg-25装于规格为16×600mm的层析柱中，采用去离子水平衡，流速为1.0ml/min。将超滤分离得到的抗氧化活性最强的rsh-ii组分溶于去离子水中配置成50mg/ml的溶液，上柱，用去离子水进行洗脱，并用分步收集器收集洗脱液（6ml/管），于280nm处检测并收集洗脱峰峰a1和a2，冷冻干燥，-80℃低温保存备用。

氨基酸序列测定：采用毛细管高效液相色谱联用q-exactivems对肠粘膜抗氧化肽进行结构鉴定，得到该抗氧化肽的氨基酸序列为asp-gly-leu-lys-his-leu-asp-asn-leu-lys（1152.64da）和asn-asp-trp-glu-asp-his-leu-ala-val-lys（1226.58da）。

实施例2对实施例1中得到的天然抗氧化肽活性进行研究：

1.多肽人工合成步骤：

（1）挂树脂：将2gctcresin加入到125ml反应柱中，再加入50mldcm溶胀30min，加入fmoc-lys（boc）-oh(2eq)及dipea(4eq)，反应2.5h，再加入2mlmeoh封端30min，抽干溶剂，依次用dcm洗涤（50ml*3）、dmf洗涤（50ml*3）。

（2）脱保护：加入50ml20%哌啶/dmf,反应30min，用dmf洗涤（50ml*5）。

（3）缩合氨基酸：加入fmoc-leu（2eq）、hbtu(2eq)、dipea(4eq)，再加入50mldmf,反应1.5h，用dmf洗涤（50ml*5）。

（4）肽链增长：依次重复步骤二和步骤三，直到连完最后一个氨基酸fmoc-asp（otbu）-oh,依次用dmf洗涤（50ml*5），dcm洗涤(50ml*2)，meoh洗涤(50ml*2)，抽干。

（5）裂解：抽干后的树脂加入5倍体积的tfa:tis:h2o(95:2.5:2.5)，反应2.5h，反应完慢慢加入到10倍反应液体积的冰乙醚中，离心，弃去上清液，固体用乙醚洗涤3次，得粗品肽。

（6）hplc纯化

2.多肽的抗氧化能力测定：

（1）dpph自由基清除能力：用去离子水将肠粘膜多肽粉配制成质量浓度为5、10、15、20、25mg/ml的溶液。取1ml不同质量浓度的多肽液与1ml0.2mml/ldpph自由基溶液[95%（体积分数）乙醇溶解]充分混匀，室温避光放置30min。517nm波长处检测混合溶液的吸光值记为a样品，1ml95%乙醇与1ml去离子水充分混合为空白组，吸光值记为a0；1mldpph自由基溶液与1ml95%乙醇充分混合为对照组，吸光值记为a对照。肠粘膜多肽对dpph自由基清除率的计算公式为：dpph自由基清除率=[1-（a样品-a0）/（a对照-a0）]×100%。

（2）还原能力：用去离子水将肠粘膜多肽粉配制成质量浓度为5、10、15、20、25mg/ml的溶液。取200μl多肽液，加入200μl0.2mol/l、ph6.6的磷酸盐缓冲液，再加入50μl质量分数1%的铁氰化钾溶液。50℃保温20min，加入100μl质量分数10%的三氯乙酸溶液，充分混匀后1000g离心10min，取上清液200μl，依次加入200μl去离子水和20μl质量分数0.1%的氯化铁，混匀并在室温下反应10min，700nm波长处检测反应物的吸光值，吸光值越大表示还原能力越强。

序列表

<110>扬州大学

<120>一种新型肠粘膜抗氧化活性肽及其制备方法

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>10

<212>prt

<213>猪物种(susscrofa)

<400>1

aspglyleulyshisleuaspasnleulys

1510

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<211>10

<212>prt

<213>猪物种(susscrofa)

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