用于检测马、驴、马骡以及驴骡源性成分的引物组及检测试剂盒的制作方法

本发明实施例涉及生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测马、驴、马骡以及驴骡源性成分的引物组及检测试剂盒。

背景技术：

目前，马、驴为同源物种，基因组信息相似程度高，二者可杂交产生骡，马骡、驴骡的相似度特别高，仅凭肉眼观察经常会出错；其次，对于来源于马、驴、马骡、驴骡的组织样品用一般的方法很难分辨，尤其是来源与马、驴、马骡、驴骡中原料制品，例如，阿胶等产品，该产品是由驴的皮张经过煎煮、浓缩而制成，其具有改善睡眠、健脑益智等功能。但是，该产品中，不良商家通过掺入马皮、马骡或者驴骡的皮，而制得的产品会危害食用者的身体健康。而现有技术中，大多采用基因组测序方法去鉴定马、驴、马骡、驴骡源性成分，其工作繁琐，耗时长。

技术实现要素：

为此，本发明实施例提供一种用于检测马、驴、马骡以及驴骡源性成分的引物组及检测试剂盒，以解决现有技术中检测的马、驴、马骡以及驴骡源性成分繁琐、耗时长的问题。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

用于检测马、驴、马骡以及驴骡源性成分的引物组，所述引物组包括核苷酸序列如seqidno:1和seqidno:2所示的第一特异引物对，核苷酸序列如seqidno:3和seqidno:4所示的第二特异引物对。

优选的，所述引物组还包括用于区分所述源性成分来源的马、驴、马骡以及驴骡的性别的第三特异引物对，所述第三特异引物对的核苷酸序列如seqidno:5和seqidno:6所示。

优选的，所述第二特异引物对是针对所述马和驴的线粒体基因的引物对。

本发明实施例还提供含所述的引物组的多重pcr检测试剂盒。

优选的，所述检测试剂盒还包括空白对照组，所述空白对照组为水。

优选的，所述试剂盒的检测样本为动物血液、毛发、皮肤、内脏中提取的dna。

优选的，所述检测试剂中，所述pcr反应体系为：greentaqmix10ul，dna模板2.4ul，上游引物0.5ul，下游引物0.5ul，ddh2o6.6ul。

优选的，所述检测试剂盒和还包括来源马、驴、马骡或者驴骡的样品的阳性对照品。

本发明实施例具有如下优点：

本发明实施例的用于检测马、驴、马骡以及驴骡源性成分的引物组及其检测试剂盒，在检测马、驴、马骡以及驴骡源性成分过程中，其耗时短，工作量小，节约成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

图1为本发明实施例1提供的第一特异性引物对检测马、驴、马骡和驴骡的pcr扩增产物的dna片段的电泳图；

图2为本发明实施例2提供的第二特异引物对检测马、驴、马骡和驴骡的pcr扩增产物的dna片段的电泳图；

图3为本发明实施例3提供的第三特异引物对检测马、驴、马骡和驴骡的pcr扩增产物的dna片段的电泳图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本发明实施例中，在常染色体找到马、驴同源基因之间存在小片段的缺失，在其缺失区域两端设计第一特异性引物对，为了增加差异，在设计引物的时候，进行了碱基替换，来增加引物对的特异性，该第一特异性引物对的核苷酸序列为如seqidno:1上游引物和seqidno:2所示的下游引物。该马的同源基因cngb3cyclicnucleotidegatedchannelsubunitbeta3，具体的，马[equuscaballus(horse)]geneid:100055470，locationchromosome9,nc_009152.3(2298952..2413636)；驴[equusasinus(ass)]geneid:106829842locationnw_014637333.1(39847..171617)。通过第一特异引物对扩增的驴同源基因的核苷酸序列如seqidno:7所示，通过第一特异引物对扩增的扩增的马同源基因的核苷酸序列如seqidno:8所示。

本发明实施例中，用于检测样品中的dna的提取过程为，血液dna的提取使用takaraminibestuniversalgenomicdnaexitractonkitver.5.0(takara,9765)试剂盒并按照说明逐步操作。

一、细胞的裂解：取100ul全血于1.5ml离心管，加100ul无菌无酶水，加入180μl的buffergb、20μl的proteinasek和10μl的rnasea(10mg/ml)，充分吸打混匀，于56℃水浴温浴10分钟。向裂解液中加入200μl100％乙醇，充分吸打混匀。

二、将spincolumn安置于collectiontube上，溶液移至spincolumn中，12,000rpm离心2分钟，弃滤液。

三、将500μl的bufferwa加入至spincolumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。

四、将700μl的bufferwb加入至spincolumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。

五、重复操作步骤四。

六、将spincolumn安置于collectiontube上，12,000rpm离心2分钟。

七、将spincolumn安置于新的1.5ml的离心管上，在spincolumn膜的中央处加入50～200μl的灭菌水或elutionbuffer，室温静置5分钟。

八、12,000rpm离心2分钟洗脱dna，获得用于pcr检测的dna样品。

其中，pcr的扩增体系为：使用greentaqmix(vazyme,p131)，20ul反应体系，含greentaqmix10ul，dna模板2.4ul，上游引物0.5ul，下游引物0.5ul，ddh2o6.6ul。

pcr扩增反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃彻底延伸1min。将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示，其中，样品原料取自6匹马(horse)，6匹驴(dongkey)，3匹马骡(母马×公驴)(mule)和3匹驴骡(母驴×公马)(hinny)，当样品原料来源是马时，pcr扩增产物为474bpdna片段，当样品来源是驴时，pcr扩增产物为711bpdna片段，当样品来源是马骡或驴骡时，pcr扩增产物为474bp和711bp两条dna片段。通过第一特异引物对可以将马、驴和骡源性成分进行区分。

实施例2

本发明实施例中，在鉴定区分马骡、驴骡时，使用马和驴的线粒体基因，在ncbi下载了马和驴的线粒体mitochondrialdna(mtdna)全长，其中，马horse：accessionnc_001640locusnc_00164016660bp；驴dokey：accessionnc_001788locusnc_00178816670bp，利用bioedit软件进行比对，找到线粒体基因中，差异很大的dna区段，利用该dna区段，设计核苷酸序列如seqidno:3和seqidno:4所示的第二特异引物对。为了增加差异，在设计引物的时候，进行了碱基替换，来增加引物对的特异性，扩增pcr产物的核苷酸序列如seqidno:9所示。样品pcr的模板的提取过程中，血液dna的提取使用takaraminibestuniversalgenomicdnaexitractonkitver.5.0(takara,9765)试剂盒并按照说明逐步操作。

其中，pcr扩增体系为：使用greentaqmix(vazyme,p131)，20ul反应体系，含greentaqmix10ul，dna模板2.4ul，上游引物0.5ul，下游引物0.5ul，ddh2o6.6ul。

pcr扩增反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃彻底延伸1min。将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图2所示，其中，样品原料取自6匹马(horse)，6匹驴(dongkey)，3匹马骡(母马×公驴)(mule)和3匹驴骡(母驴×公马)(hinny)，当样品原料来源是马或者是马骡时，pcr扩增产物在琼脂糖凝胶电泳上显示为148bpdna片段；当样品来源是驴或者驴骡时，没有pcr扩增产物。通过第二特异引物对可以进一步的对来源于马骡和驴骡来源原料进行区分。

实施例3

本发明实施例中，sry(哺乳动物早期性腺体具有双向分化的潜能，在性别决定过程中，根据体细胞是否表达sry(sex-determiningregionoftheychromosome)基因，最终决定未分化的性腺发育为卵巢或者睾丸基因，选用y染色体上的特有基因进行设计第三特异引物对，为了增加差异，在设计引物的时候，进行了碱基替换，来增加引物对的特异性，其核苷酸序列如seqidno:5和seqidno:6所示，扩增pcr产物的核苷酸序列如seqidno:10所示。

其中，pcr扩增体系为：使用greentaqmix(vazyme,p131)，20ul反应体系，含greentaqmix10ul，dna模板2.4ul，上游引物0.5ul，下游引物0.5ul，ddh2o6.6ul。

pcr扩增反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃彻底延伸1min。将pcr产物琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图3所示，其中，样品原料取自6匹马(horse)，6匹驴(dongkey)，3匹马骡(母马×公驴)(mule)和3匹驴骡(母驴×公马)(hinny)，当样品来源为性别为雄性(♂)时，有pcr产物，凝胶成像有亮带，有大小为145bpdna片段；当样本性别为雌性(♀)时，无pcr产物，凝胶成像无亮带。通过第三特异引物对可以将源性成分的马、驴、马骡以及驴骡的性别进行区分。

本发明实施例中，还提供一种用于检测马、驴、马骡以及驴骡源性成分的试剂盒，该试剂盒包括第一特异引物对、第二特异引物对以及第三特异引物对。同时，该检测试剂盒中还可设置有来源马、驴、马骡或者驴骡的样品的阳性对照品，利用该试剂盒检测的过程中，设置空白对照组，该空白对照组为水。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>内蒙古农业大学

<120>用于检测马、驴、马骡以及驴骡源性成分的引物组及检测试剂盒

<130>gg19699302a

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

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<211>23

<212>dna

<213>artificialsequence

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ccggattcctatgtcataacagg23

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<400>7

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<210>8

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<400>8

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tctgtgttcggtctcctcacatttatctattctggatatttcaccctaatagaatcatac420

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<210>9

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