一种JAK1插入突变基因及其检测方法与流程

本发明涉及医学分子生物学领域，具体涉及一种第238094-238095位点发生c.[238094-238095insttat]插入突变的jak1突变基因及其应用。
背景技术：
：结直肠癌是中国人高发的癌种之一，其恶性程度高且易发生转移，具有很高的致死率。据who最新发布的《2018年全球癌症年报》显示，结直肠癌的发病率和死亡率均高居中国人常见癌症的第4位。临床上对于结直肠癌多采用以手术为主、放化疗为辅的综合治疗，但效果并不理想，其致死原因主要是根治术后的转移和复发。肝脏是结直肠癌血行转移的主要靶器官，结直肠癌肝转移是结直肠癌患者最主要的死亡原因：15%-25%的结直肠癌患者在确诊时即合并肝转移，另有15%-25%的患者会在结直肠癌根治术后发生肝转移，其中绝大多数（80%-90%）的肝转移灶无法获得根治性切除；而未经治疗的结直肠癌肝转移患者中位生存期只有6.9个月，肝转移灶无法切除患者的5年存活率小于5%。结直肠癌肝转移是结直肠癌治疗的重点和难点，关键在于如何及早发现肝转移，才能实现及早预防和治疗。研究发现，淋巴结转移情况、术前癌胚抗原水平和患者发病年龄这3个因素对结直肠癌患者是否发生肝转移影响最明显，具有提示肝转移风险的价值。然而这几项危险因素要么敏感性不足，要么特异性不够，要么时效性比较差，并不能从实质上有效而准确地预测结直肠癌患者的肝转移风险。癌症本质上是一种基因病，其发生发展都是由特定基因群变异所驱动的，具有特定的基因指征。因此必须从基因水平上进行探究才能揭示结直肠癌肝转移的机制，从中找出相应的分子标志物，从而预测或及早发现结直肠癌患者的肝转移，这对于及时采取必要的临床干预措施以切实提高结直肠癌患者的生存率具有重要的意义和价值，例如早发现就可以增大患者行肝转移灶根治性切除的机会。本发明研究时首先收集福建省内特定的结直肠癌家庭，对相关家庭成员进行全外显子组测序，通过分析比对首次发现了在男性结直肠癌肝转移患者中存在着jak1基因的两种特定突变即c.[106282-106290delcgccgcgac]缺失突变和c.[238094-238095insttat]插入突变，进一步通过突变片段的pcr扩增和sanger测序在男性结直肠癌患者人群中进行了验证。jak1基因编码的jak1(januskinase1)激酶是蛋白酪氨酸激酶家族jaks中的重要成员，而jaks是许多细胞因子、生长因子及干扰素的重要信号传感器，涉及到多条从膜到核的重要信号通路（如jak/stat通路等）,广泛参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等过程，其特定突变将会导致细胞失控。本发明提供的jak1突变基因尚未见报道，并且其对于男性结直肠癌患者肝转移的临床意义和价值尚未被揭示。技术实现要素：本发明首次提供了特定的人jak1突变基因，其可以做为男性结直肠癌肝转移的分子标志物，同时提供了基于pcr扩增和sanger测序的jak1突变基因检测方法，这些可以应用到男性结直肠癌患者肝转移的解析中，也可以为结直肠癌肝转移的机理解析提供线索。本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：本发明的目的（1）在于提供一种人jak1突变基因，参照ncbi登录号为ng_023402.2的野生型jak1基因序列，jak1突变基因是由于野生型jak1基因发生c.[106282-106290delcgccgcgac]突变而形成的，即野生型jak1基因第106282-106290位点的cgccgcgac这9核苷酸短片段发生了缺失。jak1突变基因突变处前后50bp的序列（含突变共100bp）即jak1突变基因第106232-106331位点的序列如seqidno：1所示，其余序列详见ncbi登录号为ng_023402.2的野生型jak1基因参考序列，具体来说：jak1突变基因前106281位点序列同野生型jak1基因（ncbi登录号为ng_023402.2）相同位点序列一样；而jak1突变基因从第106281+n（n为1-135234范围内包含1和135234的整数）位点起，其序列同野生型jak1基因的第106290+n位点序列一样。jak1基因发生c.[106282-106290delcgccgcgac]突变的男性结直肠癌患者肝转移风险高，因此该突变基因可以做为男性结直肠癌患者肝转移的分子标志物，被应用于构建男性结直肠癌患者肝转移分析的检测试剂盒和检测方法。本发明的目的（2）在于提供一种人jak1突变基因，参照ncbi登录号为ng_023402.2的野生型jak1基因序列，jak1突变基因是由野生型jak1基因发生c.[238094-238095insttat]突变而形成的，即野生型jak1基因第238094-238095位点之间插入了ttat这4核苷酸短片段。jak1突变基因突变处前后50bp的序列即jak1突变基因第238045-238148位点（含突变共104bp）的序列如seqidno：2所示，其余序列详见ncbi登录号为ng_023402.2的野生型jak1基因参考序列，具体来说：jak1突变基因前238094位点序列同野生型jak1基因（ncbi登录号为ng_023402.2）相同位点序列一样，jak1突变基因第238095-238098位点序列为插入突变序列ttat；而jak1突变基因从第238098+n（n为1-3430范围内包含1和3430的整数）位点起，其序列同野生型jak1基因的第238094+n位点序列一样。jak1基因发生c.[238094-238095insttat]突变的男性结直肠癌患者肝转移风险高，因此该突变基因可以做为男性结直肠癌患者肝转移的分子标志物，被应用于构建男性结直肠癌患者肝转移分析的检测试剂盒和检测方法。本发明的目的（3）在于提供男性结直肠癌患者中特定jak1突变基因的检测分析方法，该方法包括如下主要步骤：（1）提取男性结直肠癌患者样本dna获取男性结直肠癌患者的癌灶组织或血液样本，癌灶组织可以是手术或活检穿刺获取的样本，血液样本可以是便于获取的外周静脉血，选用相应的试剂盒提取癌灶组织样本中的基因组dna或血液样本中的细胞外游离dna。（2）扩增jak1基因突变所在片段以步骤（1）中提取的dna为模板，对于jak1基因的c.[106282-106290delcgccgcgac]突变片段，采用如seqidno：3和seqidno：4序列所示的pcr引物进行扩增，按照常规pcr扩增体系，扩增条件为：95℃预变性3min；94℃变性15s，52℃退火20s，72℃延伸30s，循环30次；72℃终延伸5min；对于jak1基因的c.[238094-238095insttat]突变片段，采用如seqidno：5和seqidno：6序列所示的pcr引物进行扩增，按照常规pcr扩增体系，扩增条件为：95℃预变性3min；94℃变性15s，54℃退火20s，72℃延伸40s，循环30次；72℃终延伸5min；（3）jak1突变基因扩增片段测序分析将步骤（2）中扩增的jak1基因突变片段送基因公司进行sanger测序，参照ncbi登录号为ng_023402.2野生型jak1基因参考序列分析样本jak1基因的特定突变信息，以此应用于男性结直肠癌患者肝转移的分析中。若男性结直肠癌患者样本中检出含有jak1基因的c.[106282-106290delcgccgcgac]突变和/或jak1基因的c.[238094-238095insttat]突变，则表示其为肝转移或肝转移高风险。本发明提供的人jak1突变基因，可以做为结直肠癌肝转移的有效可靠的分子标志物，也可以为结直肠癌肝转移的机理解析提供线索；jak1突变基因及其检测方法可以简便有效地应用于男性结直肠癌患者肝转移的分析预测中，有助于男性结直肠癌患者肝转移的早发现和早干预。附图说明图1是jak1野生型基因（a）和突变基因（b）在c.[106282-106290delcgccgcgac]突变处前后的sanger测序局部图谱。图中方框区域为缺失突变发生区。图2是jak1野生型基因（a）和突变基因（b）在c.[238094-238095insttat]突变处前后的sanger测序局部图谱。图中箭头处为插入突变发生位置。具体实施方式以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。实施例1绝大多数男性结直肠癌肝转移患者中存在jak1特定基因突变收集福建省内特定的结直肠癌家庭，每个家庭中均含有2个临床病理确诊且行切除术的结直肠癌患者（同一家庭患者间均为同胞兄弟姐妹关系，确诊时间间隔经统计在3-32个月之间），其中12个至少含1名男性患者的家庭其患者具体信息如表1所示。在研究结直肠癌转移的分子指征时，优先考虑选择有多名结直肠癌患者的同一家庭，可以排除人群遗传背景的干扰，更容易找出相同和/或差异突变信息。理论上，同一家庭兄弟姐妹中不同结直肠癌患者，其癌灶同源性更高，若是转移到同一脏器则应该有相同的分子指征，若是转移到不同的脏器应该有不同的分子指征，选择同一家庭成员则遗传背景干扰可以消除，便于寻找出这些分子指征。此外，选择同一家庭的同辈兄弟姐妹结直肠癌患者，便于在这些成员均在世的情况下收集分析样本。在表1中12个家庭相关结直肠癌患者充分知情同意和满足临床诊治的情况下取其术后组织样本。采用德国qiagen公司的组织基因组提取试剂盒（qiaampfastdnatissuekit和qiaampdnaffpetissuekit）按照说明书方法提取待测患者组织样本基因组dna。基因组dna经检测合格后送贝瑞和康公司进行全外显子组捕获测序和分析。捕获测序建库采用的是美国agilent公司的sureselecthumanallexonv6+utr试剂盒，采用美国illumina公司的hiseq2500测序仪进行测序，平均测序深度达到200×。测序原始数据首先经过质控并去除低质量reads等标准前期处理，再以hg19基因组为参考，使用bwa和gatk等软件识别和注释snv、indel、cnv等变异位点信息；最后利用dbsnp数据库，千人基因组数据库和外显子组测序项目数据库esp6500等数据库过滤无效和多态性信息确定突变位点信息，结合临床信息分选重要的突变再进行sanger测序验证。12个结直肠癌家庭的jak1基因突变情况如表1所示。结果显示在12个家庭共24名结直肠癌患者中：（1）14名男性结直肠癌肝转移患者中的13名（92.9%）均含有jak1基因的特定突变且其突变含量比例（测序有效突变reads中含有的jak1基因特定突变的reads数目百分比）均超过3%（3.5%-23%），其中家庭#1的患者1和2、家庭#2的患者1和2、家庭#6的患者2、家庭#7的患者1、家庭#11的患者2共7名男性结直肠癌肝转移患者含有的均是jak1基因的c.[106282-106290delcgccgcgac]突变，家庭#3的患者1和2、家庭#4的患者1、家庭#5的患者2、家庭#8的患者2、家庭#9的患者1共6名男性结直肠癌肝转移患者含有的均是jak1基因的c.[238094-238095insttat]突变。（2）4名女性结直肠癌患者中均未检测出jak1基因突变。（3）7名结直肠癌非肝转移患者中均未检测出jak1基因突变。由此可知，jak1特定基因突变即c.[106282-106290delcgccgcgac]或c.[238094-238095insttat]只在男性结直肠癌肝转移患者样本中被检出，并且在绝大多数（13例/14例=92.9%）男性结直肠癌肝转移患者样本中都有，进一步的需要在大量结直肠癌患者群体中进行验证。表112个结直肠癌家庭信息及jak1基因突变情况家庭编号患者1突变及其比例患者2突变及其比例#1男，56岁，肝转移c.[106282-106290delcgccgcgac]，5.6%男，58岁，肝转移c.[106282-106290delcgccgcgac]，15.1%#2男，43岁，肝转移c.[106282-106290delcgccgcgac]，17.6%男，43岁，肝转移c.[106282-106290delcgccgcgac]，18.1%#3男，67岁，肝转移c.[238094-238095insttat]，23.0%男，68岁，肝转移c.[238094-238095insttat]，3.6%#4男，65岁，肝转移c.[238094-238095insttat]，7.0%女，66岁，肝转移-#5女，58岁，肝转移-男，59岁，肝转移c.[238094-238095insttat]，9.4%#6女，63岁，肺转移-男，64岁，肝转移c.[106282-106290delcgccgcgac]，6.9%#7男，60岁，肝转移c.[106282-106290delcgccgcgac]，10.3%男，65岁，肺转移-#8男，46岁，肺转移-男，48岁，肝转移c.[238094-238095insttat]，4.8%#9男，58岁，肝转移c.[238094-238095insttat]，3.5%男，62岁，骨转移-#10男，51岁，肺转移-男，54岁，肺转移-#11男，60岁，肝转移-男，62岁，肺转移c.[106282-106290delcgccgcgac]，8.0%#12男，57岁，肝转移-女，58岁，肝转移-注：“-”表示未检出。实施例2在结直肠癌患者群体中探究jak1特定基因突变情况由实施例1为了进一步探究直肠癌患者群体中jak1特定基因突变即c.[106282-106290delcgccgcgac]和c.[238094-238095insttat]突变的分布规律，设计针对这两种特定突变的pcr引物并收集127例福建省内经临床病理确诊的结直肠癌患者术后组织样本，参照实施例1中方法提取样本基因组dna，以提取的基因组dna为模板，按照常规pcr体系和表2中条件扩增突变所在片段（每份样本均同时单独采用seqidno：3和seqidno：4引物对以及seqidno：5和seqidno：6进行扩增），电泳检测后将pcr产物送上海生工生物工程有限公司进行sanger测序。127例结直肠癌患者的jak1特定基因突变的sanger测序结果如表3所示，结果显示在47例男性结直肠癌肝转移患者中有高达45例（95.7%）均检出含有jak1的特定基因突变即c.[106282-106290delcgccgcgac]（突变位点处的sanger测序图谱如图1所示）或c.[238094-238095insttat]（突变位点处的sanger测序图谱如图2所示），而非男性以及非肝转移结直肠癌患者中均没有检出jak1基因的特定突变。表2突变片段扩增体系和条件突变类型扩增引物扩增条件c.[106282-106290delcgccgcgac]seqidno：3和seqidno：495℃预变性3min；94℃变性15s，52℃退火20s，72℃延伸30s，循环30次；72℃终延伸5min。c.[238094-238095insttat]seqidno：5和seqidno：695℃预变性3min；94℃变性15s，54℃退火20s，72℃延伸40s，循环30次；72℃终延伸5min。表3结直肠癌患者群体中jak1特定基因突变分布情况结直肠癌患者类型总数目c.[106282-106290delcgccgcgac]c.[238094-238095insttat]男性肝转移472420男性非肝转移2000女性肝转移3800女性非肝转移2200汇总统计1272420进一步的，从127例结直肠癌患者中选择男性肝转移患者、男性非肝转移患者、女性肝转移患者和女性非肝转移患者各5例，送基因公司设计引物集进行jak1全基因的pcr捕获测序，结果显示女性患者和非肝转移患者除了不存在两种jak1特定基因突变外，也不含任何其它位点和类型的jak1基因其它突变；而男性肝转移患者含有的jak1基因突变主要是c.[106282-106290delcgccgcgac]和c.[238094-238095insttat]这两种。由此表明，男性结直肠肝转移患者普遍存在着jak1基因的两种特定突变中的一种即c.[106282-106290delcgccgcgac]或c.[238094-238095insttat]，两者比例合计超过90%。因此jak1基因的这两种特定突变可以做为男性结直肠癌患者肝转移的分子标志物，进一步的需要探究其是否具备预测男性结直肠癌患者肝转移的能力。实施例3jak1特定基因突变可预测男性结直肠癌患者的肝转移收集福建省内30例经临床病理确诊的男性结直肠癌患者（可行切除术和无法行切除术的均可），需要满足首诊结直肠癌且初诊时未发现转移同时未合并其它肿瘤，在入院治疗前采集其外周静脉血2ml，每隔3个月左右在其检查治疗需要采血时额外多抽取2ml外周静脉血，直至患者出现临床影像和病理确诊的转移灶为止。最终的有效患者有25例，另外5例在研究期间出现死亡或失访。采用qiagen公司的细胞外游离核酸提取试剂盒（circulatingnucleicacidkit）提取这25例有效患者所有血液样本中的游离核酸。以提取的血液游离核酸为模板，参照实施例2中表2的体系和条件扩增jak1基因的两种特定突变片段，电泳检测后将pcr产物送上海生工生物工程有限公司进行sanger测序，结果如表4所示。结果显示25例男性结直肠癌患者之后转移的癌灶有15例是肝，6例是非肝（包括肺、骨和脑）,4例未发生转移，其中6例非肝转移患者和4例未发生转移患者均未检出jak1基因的两种特定突变。15例肝转移的患者无一例外均含有jak1基因两种特定突变中的一种，其中9例含有的是jak1基因的c.[106282-106290delcgccgcgac]突变，另外6例则含有jak1基因的c.[238094-238095insttat]突变。而这15例男性结直肠癌患者均是分子检测出jak1基因的特定突变要早于临床影像学和/或病理学发现和确诊出肝转移灶。相比于临床影像学和/或病理学的肝转移灶发现和诊断结果，对于含有jak1基因的c.[106282-106290delcgccgcgac]突变的男性结直肠癌肝转移患者而言，分子的突变检测结果平均提早了5.2个月（位于3个月-9个月范围内），而对于含有jak1基因的c.[238094-238095insttat]突变的患者而言，分子的突变检测结果平均提早了4.1个月（位于3个月-6个月范围内）。由此进一步表明jak1基因的c.[106282-106290delcgccgcgac]突变和c.[238094-238095insttat]突变可以做为男性结直肠癌患者肝转移的分子标志物，血液中检出jak1基因的这两种特定基因突变的男性结直肠癌患者其为肝转移高风险（9例/9例=100%和6例/6例=100%）。分子检测由于早于影像学和病理学结果，特别是结合液体活检和二代基因组测序技术，将使其对于转移的预测、早期发现将更有优势。表425例男性结直肠癌患者转移情况以及其jak1特定基因突变情况转移类型例数含有c.[106282-106290delcgccgcgac]突变例数/例分子检测平均提前时间/月含有c.[238094-238095insttat]突变例数/例分子检测平均提前时间/月肝转移1595.264.1非肝转移60-0-未转移40-0-注：“-”表示未检出。序列表<110>福建晨欣科生物科技有限公司<120>一种jak1插入突变基因及其检测方法<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>100<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>1tatcctggagctgcagacagtgcgggcctgcgcccagtcccggctgtcctccctcctcag60ccctgggcgcgcgcacgctggggccccgcggggctggccg100<210>2<211>104<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>2cccagatctaacatttttactgttgttacttctttctttttacaggtttattattcaact60tatgaggaaatgctgggaattccaaccatccaatcggacaagct104<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gcgtcgctgagcgcaggccg20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4cacttccgtgtgcgcctggg20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5agtctttaaggaaaagtcat20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6agaaggacttgataatctgt20当前第1页12