粘附受体构建体及其在自然杀伤细胞免疫疗法中的用途的制作方法

文档序号：22340621发布日期：2020-09-25 18:12阅读：382来源：国知局

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背景技术：

许多疾病的出现和持续存在的特征是对异常细胞(包括恶性的和病毒感染的细胞)的免疫应答不足。免疫疗法是使用和操纵患者的免疫系统来治疗各种疾病。

技术实现要素：

免疫疗法在疾病的治疗中呈现出新的技术进步，其中免疫细胞被工程改造以表达特定的靶向和/或效应分子，其特异性识别患病的或受损的细胞并与之反应。这代表了有希望的进步，至少部分是由于针对特异性靶向患病的或受损的细胞的潜力，这与更传统的方法(例如化学治疗)相反，所述更传统的方法中所有细胞都受到影响，而期望的结果是足够的健康细胞存活以容许患者生存。一种免疫疗法是在免疫细胞中重组表达粘附受体，以实现靶向识别和破坏目标异常细胞。

为了解决针对特异性靶向和破坏患病的或感染的细胞、使其失效或以其他方式致其惰性的这种需要，本文提供了编码粘附嵌合受体的多核苷酸、氨基酸和载体，这些粘附受体赋予免疫细胞(例如自然杀伤细胞)增强的靶向以及因此的靶向细胞毒性。还提供了产生表达由此类多核苷酸编码的粘附受体的免疫细胞的方法，以及使用所述细胞靶向和破坏患病或受损细胞的方法。

在几个实施例中，提供了编码粘附受体的多核苷酸，所述粘附受体包含胞外受体结构域和跨膜结构域，其中所述跨膜结构域将所述胞外受体结构域锚定在免疫细胞(例如nk细胞)的表面上。

在几个实施例中，胞外受体结构域包含使胞外受体结构域结合靶细胞抗原的肽。在几个实施例中，与靶细胞相比，靶抗原在健康细胞上差异表达，从而赋予表达粘附受体的细胞一定程度的特异性靶向性。因此，具有这种差异(例如，升高)表达的那些细胞被表达粘附受体的免疫细胞(例如nk细胞、t细胞或其组合)优先识别和破坏。在几个实施例中，靶细胞抗原与疾病(例如肿瘤、癌症或肿瘤)相关。表达粘附受体的免疫细胞可以靶向实体癌或悬浮癌。在一些实施例中，靶细胞抗原是肿瘤相关抗原，而在另外的实施例中，靶细胞抗原是肿瘤特异性抗原。本文公开的粘附受体还可用于靶向其他抗原，包括但不限于受病毒、细菌、真菌和/或寄生虫感染影响的细胞。在这种情况下，靶细胞抗原为病毒、细菌、真菌或寄生虫抗原。

靶细胞抗原的非限制性实例包括bcr-abl、cd19、gd2、gd3、her-2、k-ras、mage-1、mage-10、mage-12、mage-2、mage-3、mage-4、mage-6、mage-a1、mage-a2、mage-a3、mage-a6、mage-b1、mage-b2、间皮素、muc1、muc16、muc2、mum-1、mum-2、mum-3、肌球蛋白、ny-eso、p53、prame、psa、psca、psma、rage、ssx-2、存活素、存活素-2b、tgfarii、tgfbrii、vegf-r2和wt1。在一个实施例中，靶细胞抗原是her2。在一个实施例中，靶细胞抗原是psma。在一个实施例中，靶细胞抗原是cd123。在一个实施例中，靶细胞抗原是gd-2。在一个实施例中，靶细胞抗原是gd-3。在一个实施例中，靶细胞抗原是ny-eso。在一个实施例中，靶细胞抗原是cd19。在几个实施例中，粘附受体不靶向cd123或cd19。

取决于实施例，多种不同的部分可用于结合靶细胞抗原。例如，在一个实施例中，结合靶细胞抗原的肽包含单克隆抗体。在几个实施例中，单克隆抗体衍生自杂交瘤。根据实施例，也可使用多克隆抗体。在几个实施例中，也使用重组抗体(例如，工程改造的抗体)。例如，在几个实施例中，所开发的抗体可以被突变以促进其用于治疗哺乳动物(例如人)时的活性或稳定性--换句话说，抗体是人源化的。在另外的实施例中，使用抗体片段，但保留(或甚至增强)与靶细胞抗原的结合。例如，在几个实施例中，采用fab、fab'、f(ab')2、fv或单链fv(scfv)。在一些实施例中，微型抗体(minibodies)，双抗体(diabodies)和/或单结构域抗体也用于使免疫细胞靶向靶细胞。在一些实施例中，粘附受体可以不是工程改造的(例如，对于另一种细胞类型是天然的并且在nk细胞中完整表达)。在几个实施例中，粘附受体不是scfv。在几个实施例中，粘附受体不是特异性结合目的靶标的含从头结合结构域的多肽(dbdpp)。关于dbdpp的另外信息可以例如在国际专利申请pct/us2016/025868和/或pct/us2016/025880中找到，其中每者的全部内容通过引用结合于此。

因此，在几个实施例中，结合靶细胞抗原的肽是单链可变片段(scfv)，并且粘附受体包含抗her2scfv。在一些这样的实施例中，scfv由seqidno:58的核酸序列编码。在一些实施例中，scfv包含seqidno:59的氨基酸序列。在一个实施例中，粘附受体由seqidno:60的核酸序列编码。在一个实施例中，粘附受体包含seqidno:61的氨基酸序列。在另外的实施例中，粘附受体包含抗psmascfv。在一些这样的实施例中，scfv由seqidno:62的核酸序列编码。在一些实施例中，scfv包含seqidno:63的氨基酸序列。在一个实施例中，粘附受体由seqidno:64的核酸序列编码。在一个实施例中，粘附受体包含seqidno:65的氨基酸序列。

虽然在一些实施例中，使用了特定的核苷酸或氨基酸序列，但是本文提供的另外的实施例使用了与这些序列约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％或约99％同源的核苷酸或氨基酸。在一些实施例中，同源性百分比可以变化(例如更低)，然而，所述构建体保留了由本文具体公开的序列编码的或具有本文具体公开的序列的粘附受体的至少一部分功能。

粘附受体的表达赋予表达所述受体的免疫细胞(例如，nk细胞)多种有利的特性。例如，在几个实施例中，与不表达粘附受体的nk细胞相比，表达粘附受体的nk细胞更快地结合靶细胞。在几个实施例中，与不表达粘附受体的nk细胞相比，表达粘附受体的nk细胞具有增强的对肿瘤或感染位点的归巢。在几个实施例中，与不表达粘附受体的nk细胞相比，表达粘附受体的nk细胞对呈递靶细胞抗原的细胞显示出增强的细胞毒性活性。在几个实施例中，与不表达粘附受体的nk细胞相比，表达多核苷酸编码的粘附受体的nk细胞具有降低的脱靶细胞毒性效应。

在几个实施例中，粘附受体的胞外受体结构域任选地还包括与第一肽相比结合不同靶细胞抗原的第二肽。在几个实施例中，胞外受体结构域任选地还包括与第一肽结合相同靶细胞抗原的第二肽。

在一些实施例中，本文提供的多核苷酸编码多于一种粘附受体。例如，在一些实施例中，多核苷酸可以编码第一和第二粘附受体，在一些这样的实施例中，所述第一和第二粘附受体结合不同的靶细胞抗原。然而，在一些实施例中，第一和第二(或多于两个)粘附受体被设计成结合相同的靶细胞抗原。甚至在这样的实施例中，粘附受体可以被配置成结合相同靶细胞抗原的不同表位，这可以有利地增加使免疫细胞靶向靶细胞的效率。在一些实施例中提供了另外的生化相互作用或特性。例如，在一些实施例中，粘附受体被配置成二聚化(同二聚体或异二聚体都是可能的)，这可以增强靶亲和力。在一些实施例中，胞外受体结构域还包括信号肽，以便提供受体结构域的所需膜取向。在一些实施例中，胞外受体结构域还包括铰链区，其可提供减少和/或消除空间位阻，所述空间位阻可降低胞外受体结构域的有效靶向效率。

在一些实施例中，本文提供的多核苷酸也编码嵌合受体。例如，在几个实施例中，提供了编码嵌合受体的多核苷酸，所述嵌合受体包含胞外受体结构域和含跨膜区与胞内信号传导结构域的效应子结构域。在一些实施例中，嵌合受体的胞外受体结构域包含结合自然杀伤细胞组2成员d(nkg2d)的天然配体的肽。在一些实施例中，还提供了编码膜结合白细胞介素15(mbil15)的多核苷酸。在一些实施例中，单个多核苷酸编码粘附受体、嵌合受体和任选的mbil15。在另外的实施例中，采用一个或多个构建体来编码这些不同的元件。在一些实施例中，所述多核苷酸是mrna。在几个实施例中，所述多核苷酸可操作地连接到用于表达所述粘附受体的至少一个调控元件。

除了多核苷酸之外，本文还提供了包含所述多核苷酸的载体，所述载体被配置成递送和促进由所述多核苷酸编码的蛋白质在细胞(例如免疫细胞(例如nk细胞))中的表达。在几个实施例中，载体是逆转录病毒，例如慢病毒或hiv。另外的实施例提供了其他载体，例如腺病毒载体、腺相关病毒载体和甚至非病毒载体(例如脂质体)。

本文还提供了基因工程改造的细胞，例如免疫细胞，其包含本文公开的一种或多种多核苷酸并表达一种或多种粘附受体。根据实施例采用各种免疫细胞。在几个实施例中，使用nk细胞。在一些实施例中，提供了经工程改造以表达粘附受体的自体细胞(例如，nk细胞)。另外的实施例提供了经工程改造以表达本文公开的粘附受体的同种异体细胞(例如，nk细胞)。

本文还提供了通过工程改造表达由本文提供的多肽编码的粘附受体的nk细胞来增强哺乳动物中nk细胞的细胞毒性的方法。另外的实施例涉及通过使工程改造nk细胞还表达包含配体结合结构域和信号传导结构域的嵌合受体和/或表达mbil15来进一步提供增强nk细胞的细胞毒性。根据实施例，增强的nk细胞的细胞毒性可用于治疗、减少或以其他方式改善癌症、感染或其他疾病。

还提供了编码粘附受体的多核苷酸在制备用于增强自然杀伤(nk)细胞的细胞毒性的基于细胞的药物中的用途。如上所述，在药物的产生中，粘附受体包含被配置为结合靶细胞抗原(其中靶细胞抗原在健康细胞和靶细胞之间差异表达)的胞外受体结构域和跨膜结构域(其中跨膜结构域将胞外受体结构域锚定在nk细胞的表面上)。在几个实施例中，靶细胞抗原选自psma、her2、cd123、gd-2、gd-3、ny-eso和cd19。在一些实施例中，结合靶细胞抗原的胞外受体结构域包含抗体、fab或scfv。

以上概述并在下面进一步详细阐述的组合物和相关方法描述了专业人员采取的某些行为；但是，应该理解的是，它们还可以包括另一方对这些行为的指示。因此，例如“施用表达粘附受体的nk细胞群”的行为包括“指示施用表达粘附受体的nk细胞群”。

附图说明

图1描绘质粒图，其说明了根据若干实施例的某些构建体的膜结合抗her2scfv(mbaher2)插入质粒中的点，示出了鼠干细胞病毒(mscv)质粒。描绘了将mbaher2构建体插入载体的ecori和xhoi限制性位点。

图2a-c描绘了与扩增的原代nk细胞表面mbaher2表达相关的流式细胞术数据。描绘了未转导的nk细胞(图2a)，用仅含gfp的载体转导的nk细胞(图2b)和用含抗her2scfv和gfp的载体转导的nk细胞(图2c)的mbaher2表达谱。用别藻蓝蛋白(apc)缀合的抗fab抗体(y轴)检测mbaher2的表达。病毒转导由绿色荧光蛋白(gfp)信号(x轴)指示。

图3a-b描绘了与以下有关的数据：模拟转导的nk细胞和表达mbaher2的nk细胞针对表达高水平(图3a)的her2(her2高/中，skbr3、skov3、lncap、zr751)和低水平(图3b)的her2(her2模糊/阴性，du145、plc/prf/5)的癌细胞系的以2:1效应子:靶(e:t)比的4小时细胞毒性测定。

图4描绘了与表达mbaher2或仅表达gfp的nk细胞针对skov3细胞的长期细胞毒性相关的数据，如由incucyte活体成像系统(伊森公司(essen))测量的。首先将skov3细胞铺板，24小时后以1:1e:t添加nk细胞。显示了一式三份测量的平均值±sd。

图5a-c描绘了mcherry标记的skov3细胞在1:1效应子:靶比下在无nk细胞情况下(图5a)、在仅表达gfp的nk细胞情况下(图5b)、或在表达mbaher2的nk细胞情况下(图5c)培养6天后的图像。

图6a-b描绘了与接种的模拟转导的nk细胞或表达mbaher2的转导的nk细胞对skov3细胞的示踪有关的数据，其中测量了移动的距离(图6a)和速度(图6b)。

图7a-b描绘了通过流式细胞仪与表达mbaher2的nk细胞与skov3细胞的聚集相关的数据(图7a)，以及在(图7a)的q1-ur象限中的聚集的定量(图7b)。

图8a-h描绘了与skov3细胞与用仅含gfp的载体转导的nk细胞(图8a-d)和用含抗her2scfv和gfp的载体转导的nk细胞(图8e-h)的结合相关的数据。通过使nk细胞流经附着的skov细胞并且用免疫荧光共聚焦显微镜观察来收集数据。

图9a-c描绘了与来自图8的数据的6个显微镜视野的具有hoechst染色(图9a)、gfp表达(图9b)和碘化丙锭染色(图9c)的细胞的总细胞数有关的数据。通过使nk细胞流经附着的skov细胞并且用免疫荧光共聚焦显微镜观察来收集数据。

图10描绘质粒图，其说明了根据若干实施例的某些构建体的膜结合的抗psmascfv(mbapsma)插入质粒中的点，示出了鼠干细胞病毒(mscv)质粒。描绘了将mbapsma构建体插入载体的ecori和xhoi限制性位点。

图11a-c通过流式细胞术描绘了mbapsma在扩增的原代nk细胞表面的表达。显示了未转导的nk细胞(图11a)，用仅含gfp的载体转导的nk细胞(图11b)和用含抗psmascfv和gfp的载体转导的nk细胞(图11c)的mbapsma表达谱。用别藻蓝蛋白(apc)缀合的抗fab抗体(y轴)检测mbapsma的表达。病毒转导由绿色荧光蛋白(gfp)信号(x轴)指示。

图12提供了根据本发明的几个实施例的构建体及其部分的非限制性实施例。

图13描绘了与用于评估本文公开的构建体的非限制性实例针对du145细胞的细胞毒性效应的细胞毒性测定有关的数据。

图14描绘了与用于评估本文公开的构建体的非限制性实例针对lncap细胞的细胞毒性效应的细胞毒性测定有关的数据。

图15描述了与使用本文公开的构建体的非限制性实例针对注射的skov3细胞的细胞毒性的体内评估相关的数据。

具体实施方式

概述

许多疾病的异常细胞(包括病毒感染的细胞和恶性细胞)的出现和持续是通过对所述异常细胞的免疫应答不足而达到的。免疫疗法的目标是启动或增强患者的免疫系统应答，例如，增强免疫细胞(例如自然杀伤(nk)细胞)破坏、杀伤或以其他方式抑制受损细胞或患病细胞的能力。一种免疫治疗方法是在免疫细胞中重组表达粘附受体以靶向识别异常细胞(从而使其能够随后被破坏)。通常，如本文所述的粘附受体包含识别靶细胞上配体的胞外受体结构域和锚定跨膜结构域。

本文公开的一些实施例利用具有该一般结构的粘附受体，或具有该一般结构的变体的粘附受体。如下面更详细讨论的，根据实施例，使用截短、突变、额外的接头/间隔子元件、二聚体等产生粘附受体构建体，其在免疫细胞(例如，nk细胞)中表现出所需程度的表达，诱导来自nk细胞的细胞毒性活性，与一定程度的靶标亲合力平衡(这避免对非靶细胞的不利影响)。本文公开的粘附受体在免疫细胞表面上的重组表达可以将免疫细胞的靶向重定向至目标异常细胞，并且在接合后增强免疫活化。

用于免疫疗法的nk细胞

一种免疫疗法包括向患者施用工程改造以表达受体的t细胞以引发阳性免疫应答。然而，该方法的缺点是其需要使用自体细胞来预防患者中移植物抗宿主病的诱导。如本文公开的若干实施例中所提供，包含工程改造的nk细胞的组合物具有若干优点，这些优点通过本文公开的靶向方法和组合物而增强。例如，自体或供体衍生的同种异体细胞可以与nk细胞方法一起使用。另外，根据若干实施例，工程改造的nk细胞不显著增加针对正常细胞的细胞毒性。此外，nk细胞一旦被活化，就具有显著的细胞毒性作用。鉴于此，出人意料的是，本文提供的工程改造的nk细胞能够进一步提高细胞毒性作用，从而提供选择性杀死患病靶细胞的更有效的手段。因此，在几个实施例中，提供了治疗或预防癌症或传染病的方法，其包括施用治疗有效量的表达本文所述的粘附受体的nk细胞。在一个实施例中，施用的nk细胞是自体细胞。在进一步的实施例中，施用的nk细胞是供体衍生的(同种异体的)细胞。

在几个实施例中，表达粘附受体的重组nk细胞的接合和活化(例如，通过结合靶细胞上的配体)导致通过细胞溶解直接杀伤应激细胞和/或异常细胞(例如，肿瘤细胞、病毒感染的细胞等)。因此，在几个实施例中，提供了增强nk细胞细胞毒性的方法，该方法包括施用经工程改造以表达本文所述的粘附受体的nk细胞。在一个实施例中，施用的nk细胞是自体细胞。在进一步的实施例中，所述nk细胞是供体衍生的(同种异体的)细胞。在若干实施例中，工程改造的nk细胞导致应激细胞和/或异常细胞(例如，肿瘤细胞、病毒感染的细胞等)的间接破坏或抑制。

胞外受体结构域

如上所述，在若干实施例中，nk细胞识别并破坏异常细胞(包括肿瘤细胞和病毒感染的细胞)。nk细胞活化的第一阶段是转化的和/或感染的细胞与nk细胞之间的初始粘附，其中各种胞外蛋白(例如选择素和整合素)已被提出将两细胞连接在一起。一旦界面形成，这些先天免疫细胞的细胞毒活性分别受抑制受体和活化受体(位于细胞表面)的信号传导平衡调节。前者结合健康细胞表面上表达的自身分子，而后者结合异常细胞上表达的配体。活化受体相对于抑制受体的接合增加导致nk细胞活化和靶细胞裂解。

nk细胞识别和破坏异常细胞(包括肿瘤细胞和病毒感染细胞)的能力使其成为免疫治疗方法(包括基于嵌合受体的免疫治疗方法)的潜在有用的组成部分。然而，使nk细胞的使用复杂化的是nk细胞向靶细胞的递送不足，nk细胞在靶细胞处积聚的速率慢，nk细胞在接合后对靶细胞的杀伤不足，和/或对健康细胞的脱靶杀伤。根据本文公开的几个实施例，提供了编码粘附受体的多核苷酸，其中表达这种受体的胞外受体结构域结合靶细胞上的抗原。在一些实施例中，粘附受体仅用于靶细胞结合的目的(例如，它不执行信号传导功能)。在一些实施例中，表达本文公开的粘附受体的nk细胞更快速(例如，更迅速，更有效等)接合靶细胞。在一些实施例中，表达本文公开的粘附受体的nk细胞对靶细胞(例如，病变的或受损的细胞)具有更大的细胞毒性。在一些实施例中，表达本文公开的粘附受体的nk细胞杀伤更大部分的靶细胞。在一些实施例中，表达本文公开的粘附受体的nk细胞杀伤较少的健康脱靶细胞。

在一些实施例中，胞外受体结构域结合膜结合抗原，例如细胞(例如靶细胞)细胞外表面的抗原。在一些实施例中，抗原是肿瘤抗原。在一些实施例中，肿瘤抗原是肿瘤特异性抗原(例如，对于肿瘤细胞是特有的并且不出现在体内其他细胞中或其他细胞上的抗原)。在一些实施例中，肿瘤抗原是肿瘤相关抗原(例如，不是肿瘤细胞所特有的并且在不能诱导对抗原的免疫应答的条件下也在正常细胞中或正常细胞上表达的抗原)。在一些实施例中，胞外受体结构域结合与疾病相关的抗原。抗原可与以下相关：疾病，诸如病毒、细菌和/或寄生虫感染；炎症和/或自身免疫性疾病；或赘生物诸如癌症和/或肿瘤。

在一些实施例中，抗原在健康细胞和靶细胞之间差异表达。在一些实施例中，抗原的表达在健康细胞和靶细胞中是相同的，但是表达本文公开的粘附受体的nk细胞对健康细胞的杀伤是最小的，因为健康细胞缺乏nk细胞活化性配体谱。

在一些实施例中，胞外受体结构域包含抗原的内源性受体。在一些实施例中，粘附受体的胞外受体结构域包含单克隆抗体，多克隆抗体，重组抗体，人抗体，人源化抗体或其功能性衍生物、变体或片段，包括但不限于fab、fab'、f(ab')2、fv、单链fv(scfv)、微抗体、双抗体和单结构域抗体，例如骆驼衍生纳米抗体的重链可变结构域(vh)、轻链可变结构域(vl)和可变结构域(vhh)。在一些实施例中，胞外受体结构域包括fab、fab'、f(ab')2、fv和scfv中的至少一种。然而，在一些实施例中，scfv和特异性结合靶细胞上的目的靶标的含有从头结合结构域的多肽(dbdpp)都不被用作粘附受体。

在一些实施例中，胞外受体结构域被配置成结合与例如癌症、感染或其他疾病相关的抗原。例如，在几个实施例中，胞外受体结构域下列抗原中的一种或多种：ny-eso、cd19、cd123、gd-2、gd-3、dectin-1、her2和psma。这些抗原的组合在几个实施例中被以下靶向：表达多种胞外受体结构域或表达胞外受体结构域组合的免疫细胞，或者表达针对不同抗原的多种胞外结构域的免疫细胞群。在一些实施例中，粘附受体不靶向cd19或cd123。

可被胞外受体结构域结合的抗原的非限制性实例包括但不限于1-40-β-淀粉样蛋白、4-1bb、5ac、5t4、707-ap、激酶锚定蛋白4(akap-4)、激活素受体-2b型(acvr2b)、激活素受体样激酶1(alk1)、腺癌抗原、脂肪分化相关蛋白、肾上腺素受体(adrb3)、ags-22m6、α叶酸受体、α-胎蛋白(afp)、aim-2、间变性淋巴瘤激酶(alk)、雄激素受体、血管生成素2、血管生成素3、结合血管生成素的细胞表面受体2(tie2)、炭疽毒素、aoc3(vap-1)、b细胞成熟抗原(bcma)、b7-h3(cd276)、炭疽杆菌、b细胞活化因子(baff)、b-淋巴瘤细胞、骨髓基质细胞抗原2(bst2)、印迹位点调节子的兄弟(brotheroftheregulatorofimprintedsites，boris)、c242抗原、c5、ca-125、癌抗原125(ca-125或muc16)、癌/睾丸抗原1(ny-eso-1)、癌/睾丸抗原2(lage-1a)、碳酸酐酶9(ca-ix)、癌胚抗原(cea)、心肌肌球蛋白、ccctc-结合因子(ctcf)、ccl11(嗜酸性粒细胞趋化因子-1)、ccr4、ccr5、cd11、cd123、cd125、cd140a、cd147(基础免疫球蛋白)、cd15、cd152、cd154(cd40l)、cd171、cd179a、cd18、cd19、cd2、cd20、cd200、cd22、cd221、cd23(ige受体)、cd24、cd25(il-2受体的α链)、cd27、cd274、cd28、cd3、cd3cd30、cd300分子样家族成员f(cd300lf)、cd319、(slamf7)、cd33、cd37、cd38、cd4、cd40、cd40配体、cd41、cd44v7、cd44v8、cd44v6、cd5、cd51、cd52、cd56、cd6、cd70、cd72、cd74、cd79a、cd79b、cd80、cd97、cea相关抗原、cfd、ch4d5、染色体x开放阅读框61(cxorf61)、密封蛋白18.2(cldn18.2)、密封蛋白6(cldn6)、艰难梭菌、聚集因子a、clca2、集落刺激因子1受体(csf1r)、csf2、ctla-4、c-型凝集素结构域家族12成员a(clec12a)、c-型凝集素样分子-1(cll-1或clecl1)、c-x-c趋化因子受体4型、细胞周期蛋白b1、细胞色素p4501b1(cyp1b1)、cyp-b、巨细胞病毒、巨细胞病毒糖蛋白b、达比加特兰(dabigatran)、dll4、dpp4、dr5、大肠杆菌志贺毒素1型、大肠杆菌志贺毒素2型、外-adp-核糖基转移酶4(art4)、含egf样模块粘蛋白样激素受体样2(emr2)、egf样结构域多重7(egfl7)、突变的延伸因子2(elf2m)、内毒素、肝配蛋白a2、肝配蛋白b2、肝配蛋白a型受体2、表皮生长因子受体(egfr)、表皮生长因子受体变体iii(egfrviii)、表皮苷(episialin)、上皮细胞粘附分子(epcam)、上皮糖蛋白2(egp-2)、上皮糖蛋白40(egp-40)、erbb2、erbb3、erbb4、erg(跨膜蛋白酶、丝氨酸2(tmprss2)ets融合基因)、大肠杆菌ets易位变体基因6(位于染色体12p(etv6-aml)上)、呼吸道合胞病毒f蛋白、fap、iga受体fc片段(fcar或cd89)、fc受体样5(fcrl5)、胎儿乙酰胆碱受体、纤维蛋白iiβ链、成纤维细胞活化蛋白α(fap)、纤连蛋白额外结构域-b、fgf-5、fms样酪氨酸激酶3(flt3)、叶酸结合蛋白(fbp)、叶酸水解酶、叶酸受体1、叶酸受体α、叶酸受体β、fos相关抗原1、卷曲受体、岩藻糖gm1、g250、g蛋白偶联受体20(gpr20)、g蛋白偶联受体c类5组成员d(gprc5d)、神经节苷脂g2(gd2)、gd3神经节苷脂、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇聚糖-3(gpc3)、gmcsf受体α-链、gpnmb、gnt-v、生长分化因子8、gucy2c、突变的热休克蛋白70-2(muthsp70-2)、血凝素、甲型肝炎病毒细胞受体1(havcr1)、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎病毒、her1、her2/neu、her3、globoh糖神经酰胺(globoh)的六糖部分、hgf、hhgfr、高分子量黑色素瘤相关抗原(hmw-maa)、组蛋白复合物、hiv-1、hla-dr、hngf、hsp90、hst-2(fgf6)、人乳头瘤病毒e6(hpve6)、人乳头瘤病毒e7(hpve7)、人散射因子受体激酶、人端粒酶逆转录酶(htert)、人tnf、icam-1(cd54)、ice、ifn-α、ifn-β、ifn-γ、ige、igefc区、igf-1、igf-1受体、ighe、il-12、il-13、il-17、il-17a、il-17f、il-1α、il-20、il-22、il-23、il-31、il-31ra、il-4、il-5、il-6、il-6受体、il-9、免疫球蛋白λ样多肽1(igll1)、甲型流感血凝素、胰岛素样生长因子1受体(igf-i受体)、胰岛素样生长因子2(ilgf2)、整合素α4β7、整合素β2、整合素α2、整合素α4、整合素α5β1、整合素α7β7、整合素αiibβ3、整合素αvβ3、干扰素α/β受体、干扰素β诱导蛋白、白细胞介素11受体α(il-11rα)、白细胞介素-13受体亚基α-2(il-13rα2或cd213a2)、肠羧基酯酶、激酶结构域区(kdr)、kir2d、kit(cd117)、l1-细胞粘附分子(l1-cam)、豆荚蛋白、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族a成员2(lilra2)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(lair1)、lewis-y抗原、lfa-1(cd11a)、lingo-1、脂磷壁酸、loxl2、l-选择素(cd62l)、淋巴细胞抗原6复合物、基因座k9(ly6k)、淋巴细胞抗原75(ly75)、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(lck)、淋巴毒素-α(lt-α)或肿瘤坏死因子-β(tnf-β)、巨噬细胞移动抑制因子(mif或mmif)、m-csf、乳腺分化抗原(ny-br-1)、mcp-1、黑色素瘤癌睾丸抗原-1(mad-ct-1)、黑色素瘤癌睾丸抗原-2(mad-ct-2)、黑色素瘤凋亡抑制剂(ml-iap)、黑色素瘤相关抗原1(mage-a1)、间皮素、粘蛋白1、细胞表面相关(muc1)、muc-2、粘蛋白canag、髓鞘相关糖蛋白、肌生长抑制素、n-乙酰氨基葡萄糖转移酶v(na17)、nca-90(粒细胞抗原)、神经生长因子(ngf)、神经细胞凋亡调节蛋白酶1、神经细胞粘附分子(ncam)、神经突起生长抑制剂(例如，nogo-a、nogo-b、nogo-c)、神经纤毛蛋白-1(nrp1)、n-甘氨酰神经氨酸、nkg2d、notch受体、o-乙酰-gd2神经节苷脂(oacgd2)、嗅觉受体51e2(or51e2)、癌胎抗原(h5t4)、由断裂点簇区域(bcr)和abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(abl)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl)、长爪沙鼠(oryctolaguscuniculus)、ox-40、oxldl、p53突变体、配对盒蛋白pax-3(pax3)、配对盒蛋白pax-5(pax5)、泛连接蛋白3(panx3)、磷酸盐-钠共转运体、磷脂酰丝氨酸、胎盘特异性1(plac1)、血小板衍生生长因子受体(pdgf-rα)、血小板衍生生长因子受体(pdgfr-β)、聚唾液酸、前顶体蛋白结合蛋白sp32(oy-tes1)、程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)、原蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/克欣9型(pcsk9)、前列腺酶(prostase)、前列腺癌肿瘤抗原-1(pcta-1或半乳凝素8)、t细胞识别的黑色素瘤抗原1(melana或mart1)、p15、p53、prame、前列腺干细胞抗原(psca)、前列腺特异性膜抗原(psma)、前列腺酸性磷酸酶(pap)、前列腺癌细胞、普罗斯坦(prostein)、蛋白酶丝氨酸21(睾丸素或prss21)、蛋白酶体(前体、巨蛋白因子)亚基类型9(lmp2)、铜绿假单胞菌、狂犬病病毒糖蛋白、rage、ras同系物家族成员c(rhoc)、核因子κ-b配体的受体激活剂(rankl)、晚期糖基化终产物受体(rage-1)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)、肾泛素1(ru1)、肾泛素2(ru2)、呼吸道合胞病毒、rh血型d抗原、恒河猴因子、肉瘤易位断点、硬化素(sost)、选择素p、唾液酸lewis粘附分子(sle)、精子蛋白17(spa17)、鞘氨醇-1-磷酸、t细胞识别的鳞状细胞癌抗原1、2、和3(sart1、sart2、和sart3)、阶段特异性胚胎抗原-4(ssea-4)、金黄色葡萄球菌、steap1、存活(surviving)、多配体聚糖1(sdc1)+a314、sox10、存活素、存活-2b、滑膜肉瘤、x断点2(ssx2)、t细胞受体、tcrγ交替阅读框蛋白(tarp)、端粒酶、tem1、腱生蛋白c、tgf-β(例如、tgf-β1、tgf-β2、tgf-β3)、促甲状腺激素受体(tshr)、组织因子途径抑制物(tfpi)、tn抗原((tnag)或(galnac-ser/thr))、tnf受体家族成员b细胞成熟(bcma)、tnf-trail-r1、trail-r2、trg、转谷氨酰胺酶5(tgs5)、肿瘤抗原ctaa16.88、肿瘤内皮标志物1(tem1/cd248)、肿瘤内皮标志物7相关(tem7r)、肿瘤蛋白p53(p53)、肿瘤特异性糖基化muc1、肿瘤相关钙信号转导子2、肿瘤相关糖蛋白72(tag72)、肿瘤相关糖蛋白72(tag-72)+a327、tweak受体、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1(tyrp1或糖蛋白75)、酪氨酸酶相关蛋白2(tyrp2)、uroplakin2(upk2)、血管内皮生长因子(例如、vegf-a、vegf-b、vegf-c、vegf-d、pigf)、血管内皮生长因子受体1(vegfr1)、血管内皮生长因子受体2(vegfr2)、波形蛋白、v-myc禽髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生同源物(mycn)、血管假性血友病因子(vwf)、肾母细胞瘤蛋白(wt1)、x抗原家族成员1a(xage1)、707-ap、生物素化分子、a-辅肌动蛋白-4、abl-bcralb-b3(b2a2)、abl-bcralb-b4(b3a2)、脂肪分化相关蛋白、afp、aim-2、膜联蛋白ii、art-4、bage、b-连环蛋白、bcr-abl、bcr-ablp190(e1a2)、bcr-ablp210(b2a2)、bcr-ablp210(b3a2)、bing-4、cag-3、caix、camel、胱天蛋白酶-8、cd171、cd19、cd20、cd22、cd23、cd24、cd30、cd33、cd38、cd44v7/8、cdc27、cdk-4、cea、clca2、cyp-b、dam-10、dam-6、dek-can、egfrviii、egp-2、egp-40、elf2、ep-cam、epha2、epha3、erb-b2、erb-b3、erb-b4、es-eso-1a、etv6/aml、fbp、胎儿乙酰胆碱受体、fgf-5、fn、g250、gage-1、gage-2、gage-3、gage-4、gage-5、gage-6、gage-7b、gage-8、gd2、gd3、gnt-v、gp100、gp75、her-2、hla-a*0201-r170i、hmw-maa、hsp70-2m、hst-2(fgf6)、hst-2/neu、htert、ice、il-11ril-13rkdr、kiaa0205、k-ras、l1-细胞粘附分子、lage-1、ldlr/fut、lewisy、mage-1、mage-10、mage-12、mage-2、mage-3、mage-4、mage-6、mage-a1、mage-a2、mage-a3、mage-a6、mage-b1、mage-b2、苹果酸酶、乳腺珠蛋白-a、mart-1/melan-a、mart-2、mc1r、m-csf、间皮素、muc1、muc16、muc2、mum-1、mum-2、mum-3、肌球蛋白、na88-a、neo-pap、nkg2d、npm/alk、n-ras、ny-eso-1、oa1、ogt、癌胎抗原(h5t4)、os-9、p多肽、p15、p53、prame、psa、psca、psma、ptprk、rage、ror1、ru1、ru2、sart-1、sart-2、sart-3、sox10、ssx-2、存活素、存活素-2b、syt/ssx、tag-72、tel/aml1、tgfarii、tgfbrii、tp1、trag-3、trg、trp-1、trp-2、trp-2/int2、trp-2-6b、酪氨酸酶、vegf-r2、和wt1。在一些实施例中，胞外受体结构域结合抗体，抗体又结合前述抗原。在一些实施例中，胞外受体结构域结合抗体的fc结构域，所述抗体结合前述抗原。

在一些实施例中，胞外受体结构域包含来自以下中一种或多种的抗体或其功能衍生物、变体或片段：20-(74)-(74)(米拉妥珠单抗；维妥珠单抗)、20-2b-2b、3f8、74-(20)-(20)(米拉妥珠单抗；维妥珠单抗)、8h9、a33、ab-16b5、阿巴戈沃单抗、阿昔单抗、阿比珠单抗、abp494(西妥昔单抗生物类似物)、阿布鲁单抗、abt-700、abt-806、actimab-a(锕ac-225林妥珠单抗)、阿克托舒单抗、阿达木单抗、adc-1013、adct-301、adct-402、阿替卡木单抗、阿度努单抗、阿非利莫单抗、afm13、阿富珠单抗、agen1884、ags15e、ags-16c3f、ags67e、阿拉珠单抗、ald518、阿仑单抗、阿利罗单抗、戊酸阿土莫单抗、阿玛妥昔单抗、amg228、amg820、麻安莫单抗(anatumomabmafenatox)、雷星-阿奈妥单抗(anetumabravtansine)、阿尼鲁单抗、安卢吉珠单抗、apn301、apn311、阿珀利珠单抗、apx003/sim-bd0801(sevacizumab)、apx005m、阿西妥莫单抗、arx788、阿伐苏单抗、阿瑟利珠单抗、asg-15me、阿特利珠单抗、阿替努单抗、atl101、阿特利单抗(atlizumab)(也称为托西利珠单抗)、阿托木单抗(atorolimumab)、阿维鲁单抗、b-701、巴匹奈珠单抗、巴司利昔单抗、巴韦妥昔单抗、bay1129980、bay1187982、贝妥莫单抗、贝戈洛单抗、贝利木单抗、本雷利珠单抗、柏替利木单抗、贝西来索单抗、倍他卢汀单抗(betalutin)(177lu-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸特托单抗(177lu-tetraxetan-tetulomab))、贝伐赛珠单抗、bevz92(贝伐赛珠单抗生物类似物)、贝洛托舒单抗、bgb-a317、bhq880、bi836880、bi-505、比西单抗、比玛卢单抗、比美吉珠单抗、莫比瓦妥单抗(bivatuzumabmertansine)、biw-8962、布利妥莫单抗、布洛索珠单抗、bms-936559、bms-986012、bms-986016、bms-986148、bms-986178、bnc101、伯考赛珠单抗、维汀-布仑妥昔单抗、brevarex、布瑞吉努单抗、布洛鲁单抗、布洛赛珠单抗、布隆妥珠单抗、c2-2b-2b、卡那吉努单抗、莫星-坎妥珠单抗、坎妥单抗瑞伐坦(cantuzumabravtansine)、卡普赛珠单抗、卡罗单抗喷地肽、卡鲁单抗、卡妥玛索单抗、cbr96-阿霉素免疫缀合物、cbt124(贝伐赛珠单抗)、cc-90002、cdx-014、cdx-1401、西利珠单抗(cedelizumab)、培戈-瑟托利珠单抗、塞妥昔单抗、cgen-15001t、cgen-15022、cgen-15029、cgen-15049、cgen-15052、cgen-15092、ch.14.18、柏托-西他妥珠单抗、西舒妥木单抗、克拉吉珠单抗、克立昔单抗(clenoliximab)、泰坦-克利妥珠单抗、cm-24、考曲妥珠单抗、雷星-考妥昔单抗、考那妥木单抗、康赛珠单抗、cr6261、克瑞奈珠单抗、da-3111(曲妥珠单抗生物类似物)、达塞妥珠单抗、达克利珠单抗、达洛妥珠单抗、培戈-达匹利珠单抗、达雷妥木单抗、达雷木单抗enhanze(达雷木单抗)、达介素(darleukin)、德屈库单抗、登赛珠单抗、玛汀-地宁妥珠单抗、迪诺舒单抗、迪妥昔珠单抗、玛汀-迪妥昔珠单抗、地洛妥单抗生物素、地莫单抗(detumomab)、di-b4、地努妥昔单抗、地利伏单抗、dkn-01、dmot4039a、阿托度单抗(dorlimomabaritox)、卓齐妥单抗、ds-1123、ds-8895、杜利他单抗(duligotumab)、度匹鲁单抗、度伐鲁单抗、度司妥单抗、依洛美昔单抗、依库利珠单抗、埃巴单抗(edobacomab)、依曲考罗单抗、依法利珠单抗、依芬谷单抗、埃迪鲁单抗、依更妥单抗、依洛妥珠单抗、艾西莫单抗(elsilimomab)、依米妥珠单抗、依玛妥珠单抗、依那妥珠单抗、维汀-恩弗妥单抗、peg化恩莫单抗(enlimomabpegol)、依诺妥珠单抗、依诺吉珠单抗、依诺苏单抗、恩司妥昔单抗、西坦-依匹妥莫单抗、依普妥珠单抗、厄利珠单抗、厄妥玛索单抗、依他赛珠单抗、依卓利珠单抗、依维苏单抗、依沃苏单抗、埃比韦卢单抗、法索单抗(fanolesomab)、法拉莫单抗(faralimomab)、法乐妥珠单抗、法司努单抗、fbta05、泛维珠单抗(felvizumab)、菲扎吉努单抗、ff-21101、fgfr2抗体-药物缀合物、菲伯免疫蛋白(fibromun)、菲拉妥珠单抗、菲吉妥木单抗、非利伏单抗、夫兰妥单抗、夫来库单抗、芳托利珠单抗、弗雷鲁单抗、弗雷韦卢单抗、fpa144、夫瑞利木单抗、fs102、伏雷努单抗、伏妥昔单抗、加利昔单抗、加尼妥单抗、冈特奈卢单抗、加威利莫单抗、奥-吉妥珠单抗、吉利单抗(gerilimzumab)、格沃吉珠单抗、吉仑妥昔单抗、维汀-格仑妥木单抗、gnr-006、gnr-011、戈利木单抗、高密昔单抗(gomiliximab)、gsk2849330、gsk2857916、gsk3174998、gsk3359609、谷瑟库单抗、hu14.18k322amab、hu3s193、hu8f4、hul2g7、humab-5b1、艾巴利珠单抗、替坦-艾瑞妥莫单抗、艾卢苏单抗、艾达赛珠单抗、ign002、ign523、伊戈伏单抗(igovomab)、imab362、imab362(克洛昔单抗(claudiximab))、伊玛鲁单抗、imc-cs4、imc-d11、英赛罗单抗、英加妥珠单抗、imgn529、immu-102(钇y-90依普鲁单抗-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸偶联物(yttriumy-90epratuzumabtetraxetan))、immu-114、immutuneimp701拮抗剂抗体、incagn1876、英拉苏单抗、incshr1210、雷星-英达妥昔单抗、维汀-英度妥单抗、英夫利昔单抗(infliximab)、艾诺利莫单抗、奥星-艾诺妥珠单抗、英特妥木单抗、艾瑞西普、iph4102、艾匹利木单抗、艾雷妥木单抗、艾萨妥昔单抗、艾司妥单抗、艾托利珠单抗、艾塞吉珠单抗、jnj-56022473、jnj-61610588、克利昔单抗(keliximab)、ktn3379、l19il2/l19tnf、拉贝妥珠单抗、戈维替康-拉贝妥珠单抗、lag525、兰布利单抗(lambrolizumab)、兰帕利珠单抗、l-dos47、乐瑞吉珠单抗、乐玛来索单抗、仑兹鲁单抗、乐迪利木单抗、白妥昔单抗(leukotuximab)、乐萨妥木单抗、利比韦卢单抗、维汀-利法妥珠单抗、利格利珠单抗、利洛单抗-赛塔坦偶联物(lilotomabsatetraxetan)、林妥珠单抗、利瑞鲁单抗、lkz145、洛迪赛珠单抗、洛吉维单抗、莫星-洛沃妥珠单抗、鲁卡妥木单抗、培戈-鲁利珠单抗、鲁米昔单抗(lumiliximab)、鲁妥珠单抗、ly3164530、玛帕妥木单抗、玛格妥昔单抗、马司莫单抗(maslimomab)、马妥单抗(matuzumab)、玛弗利木单抗、mb311、mcs-110、medi0562、medi-0639、medi0680、medi-3617、medi-551(英比利珠单抗)、medi-565、medi6469、美珀利珠单抗、美特利木单抗、mgb453、mgd006/s80880、mgd007、mgd009、mgd011、米拉妥珠单抗、米拉妥珠单抗-sn-38、明瑞妥莫单抗、索星-米妥昔单抗、米托单抗(mitumomab)、mk-4166、mm-111、mm-151、mm-302、莫加利珠单抗、mor202、mor208、morab-066、莫洛莫单抗(morolimumab)、莫他韦珠单抗、帕舒托-莫塞妥莫单抗、穆罗莫纳-cd3(muromonab-cd3)、他托-那考罗单抗、那米鲁单抗、埃托-那普妥莫单抗、那呐妥单抗、那他利珠单抗、奈巴库单抗、奈西妥木单抗、奈莫利珠单抗、奈瑞利莫单抗、奈伐苏单抗、尼莫妥珠单抗、尼沃鲁单抗、巯诺莫单抗-美培坦偶联物(nofetumomabmerpentan)、nov-10、奥托萨昔单抗、奥比妥珠单抗、奥卡妥珠单抗、奥瑞利珠单抗、奥杜莫单抗(odulimomab)、奥法妥木单抗、奥拉妥单抗、奥洛吉珠单抗、奥玛利珠单抗、omp-131r10、omp-305b83、奥那妥珠单抗、昂妥昔珠单抗、奥匹努单抗、蒙托-奥珀妥珠单抗、奥瑞戈沃单抗、奥替苏单抗、奥特昔珠单抗、奥乐妥珠单抗、ox002/men1309、奥塞鲁单抗、奥扎奈珠单抗、奥佐利珠单抗、帕吉巴昔单抗(pagibaximab)、帕利韦珠单抗、帕尼妥木单抗、潘科曼单抗(pankomab)、潘科曼单抗-gex、帕诺巴库单抗、帕萨妥珠单抗、帕考利珠单抗、帕妥昔珠单抗、帕特利珠单抗、帕曲妥单抗、pat-sc1、pat-sm6、兰洛利珠单抗、培马单抗(pemtumomab)、珀雷吉珠单抗、珀妥珠单抗、培塞利珠单抗、pf-05082566(乌托鲁单抗)、pf-06647263、pf-06671008、pf-06801591、匹地利珠单抗、维汀-匹那妥珠单抗、品妥莫单抗(pintumomab)、普拉鲁单抗、维汀-珀拉妥珠单抗、珀奈珠单抗、普利昔单抗(priliximab)、瑞托萨昔单抗、普瑞妥木单抗、pro140、普罗信单抗(proxinium)、psmaadc、奎利珠单抗、雷考妥莫单抗、雷曲妥单抗、雷非韦卢单抗、雷泮赛珠单抗、雷姆赛卢单抗、雷尼比珠单抗、雷昔巴库单抗、瑞法奈珠单抗、瑞伐单抗(regavirumab)、regn1400、regn2810/sar439684、瑞司利珠单抗、rfm-203、rg7356、rg7386、rg7802、rg7813、rg7841、rg7876、rg7888、rg7986、瑞洛妥木单抗、利努苏单抗、瑞妥昔单抗、rm-1929、ro7009789、洛巴妥木单抗、洛来度单抗、洛莫索珠单抗、隆他利珠单抗、洛维利珠单抗、卢普利珠单抗、戈维替康-沙西妥珠单抗、萨玛利珠单抗、sar408701、sar566658、萨瑞鲁单抗、sat012、沙妥单抗-喷地肽偶联物(satumomabpendetide)、sct200、sct400、sea-cd40、瑟库吉努单抗、瑟瑞妥单抗、瑟托萨昔单抗、赛韦单抗(sevirumab)、sgn-cd19a、sgn-cd19b、sgn-cd33a、sgn-cd70a、sgn-liv1a、西布曲单抗(sibrotuzumab)、司法利木单抗、司妥昔单抗、辛妥珠单抗、西普利珠单抗、司卢库单抗、维汀-索非妥珠单抗、索拉奈珠单抗、索利托单抗、索普昔单抗(sonepcizumab)、索妥单抗(sontuzumab)、司达鲁单抗、苏来索单抗、苏韦珠单抗、syd985、sym004(伏妥昔单抗和扎妥昔单抗)、sym015、tab08、他巴鲁单抗、塔卡珠单抗-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸偶联物(tacatuzumabtetraxetan)、他多赛珠单抗、他利珠单抗、他奈珠单抗、塔尼单抗(tanibirumab)、普利妥单抗-帕普毒素偶联物(taplitumomabpaptox)、他瑞妥单抗、tb-403、特非巴珠单抗、特勒金单抗(teleukin)、阿替莫单抗-阿利毒素偶联物(telimomabaritox)、特那妥莫单抗、特奈利昔单抗、特普利珠单抗、特普妥木单抗、特度鲁单抗、替普珠单抗(tetulomab)、tg-1303、tgn1412、钍-227-依普妥珠单抗缀合物(thorium-227-epratuzumabconjugate)、替昔单抗(ticilimumab)、替加妥珠单抗、替曲吉珠单抗、维汀-替索妥单抗、tnx-650、托西利珠单抗、托雷利珠单抗、托萨托舒单抗、托司妥莫单抗、托维妥单抗、曲洛吉努单抗、曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-厄塔毒素偶联物(trastuzumabemtansine)、trbs07、trc105、曲加利珠单抗、曲美利木单抗、曲戈卢单抗、trph011、trx518、tsr-042、tti-200.7、塞莫白介素-2-妥考妥珠单抗、妥韦单抗(tuvirumab)、u3-1565、u3-1784、乌利妥昔单抗、乌洛鲁单抗、乌瑞鲁单抗、厄托萨珠单抗、优特吉努单抗、他立林-伐达妥昔单抗、维汀-万多妥珠单抗、万替妥单抗、伐努赛珠单抗、伐帕利昔单抗、伐立鲁单抗、伐特利珠单抗、vb6-845、维多利珠单抗、维妥珠单抗、维帕利莫单抗、维森苏单抗、威司利珠单抗、沃洛赛昔单抗、玛汀-沃瑟妥珠单抗、伏妥单抗(votumumab)、yyb-101、扎鲁妥木单抗、扎诺利木单抗、扎妥昔单抗(zatuximab)、齐拉明单抗(ziralimumab)、和阿托-佐利莫单抗。在一些实施例中，胞外受体结构域结合前述抗体。在另外的实施例中，胞外受体结构域结合前述抗体的fc结构域。

锚定跨膜结构域

在一些实施例中，跨膜结构域包括多肽。使粘附受体的胞外受体结构域锚定的跨膜结构域可以具有任何合适的多肽序列。在一些情况下，跨膜结构域包含内源性或野生型跨膜蛋白的跨膜部分的多肽序列。在一些实施例中，跨膜结构域包含与内源性或野生型跨膜蛋白的跨膜部分相比具有至少1个(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多)氨基酸取代，缺失和插入的多肽序列。在一些实施例中，跨膜结构域包含非天然多肽序列，例如多肽接头的序列。多肽接头可以是柔性的或刚性的。多肽接头可以是结构化的或非结构化的。在一些实施例中，嵌合受体使用β肾上腺素能受体的一部分作为跨膜结构域。

胞质效应子结构域

在一些实施例中，粘附受体还包含胞质效应子结构域。在一些实施例中，胞质效应子结构域包含在粘附受体与抗原结合后诱导nk细胞扩增的胞质结构域。在一些实施例中，胞质效应子结构域诱导nk细胞的扩增而不触发细胞毒性。在一些实施例中，胞质效应体结构域是细胞因子受体(例如il-2或il-15)的胞质结构域。在一些实施例中，这种胞质效应子结构域被配置成异源二聚。

抗her2粘附受体

her2是人表皮生长因子受体(her/egfr/erbb)家族的成员。已经表明这种癌基因的扩增或过度表达在某些侵袭性乳腺癌的发展和进展中起着重要作用。在一些实施例中，胞外受体结构域结合her2。在一些实施例中，抗her2胞外受体结构域包含抗her2抗体曲妥珠单抗、帕妥珠单抗及其功能衍生物、变体或片段。在几个实施例中，抗her2胞外受体包含scfv。在几个实施例中，抗her2scfv由seqidno.58编码。在几个实施例中，抗her2scfv包含seqidno:59的氨基酸序列。在若干实施例中，胞外受体可具有seqidno.58的一个或多个另外的突变，但保留her2结合功能、或在一些实施例中具有增强的her2结合功能。在几个实施例中，抗her2胞外受体结构域以二聚体、三聚体或其他多联体形式提供，这些实施例提供增强的配体结合活性。在几个实施例中，编码抗her2胞外受体结构域的序列任选地被完全或部分密码子优化。另外，在若干实施例中，使用信号肽。信号肽的种类或序列可随构建体而变化。然而，在几个实施例中，使用cd8α的信号肽或其部分或衍生物。在一个实施例中，信号肽来自cd8a并具有seqidno.4的序列。在一个实施例中，信号肽来自cd8并具有seqidno:67的dna序列。在一个实施例中，信号肽来自cd8并具有seqidno:68的蛋白质序列。

抗psma粘附受体

前列腺特异性膜抗原(psma)，又称叶酸水解酶1(folh1)，是一种完整的非脱落膜糖蛋白，在前列腺上皮细胞中高表达，并且是前列腺癌的细胞-表面标志物。在一些实施例中，胞外受体结构域与psma结合。在一些实施例中，抗psma胞外受体结构域包含scfv(单链fv)抗体，例如：as、go、g1、g2、和g4，mab3/e7、3/f11、3/a12、k7、k12和d20；mabe99、j591、j533和j415；mab7e11-05.3；抗体7e11；和以下中描述的抗体：chang等人,1999,cancerres.[癌症研究],59:3192；murphy等人,1998,j.urol.[泌尿学杂志],160:2396；grauer等人,1998,cancerres.[癌症研究],58:4787；和wang等人,2001,int.j.cancer[国际癌症杂志],92:871，及其功能衍生物、变体或片段。在几个实施例中，抗psma胞外受体包含scfv。在几个实施例中，抗psmascfv由seqidno.62编码。在几个实施例中，抗psmascfv包含seqidno:63的氨基酸序列。在若干实施例中，胞外受体可具有seqidno.62的一个或多个另外的突变，但保留psma结合功能、或在一些实施例中具有增强的psma结合功能。在几个实施例中，胞外受体结构域以二聚体、三聚体或其他多联体形式提供，这些实施例提供增强的配体结合活性。在几个实施例中，编码抗psma胞外受体结构域的序列任选地被完全或部分密码子优化。另外，在若干实施例中，使用信号肽。信号肽的种类或序列可随构建体而变化。然而，在几个实施例中，使用cd8α的信号肽。在几个实施例中，信号肽是cd8的一部分或衍生物。在一个实施例中，信号肽来自cd8a并具有seqidno.4的序列。在几个实施例中，信号肽可以具有seqidno.4的一个或多个另外的突变，但仍提供所需的受体结构域的膜取向。在一个实施例中，信号肽来自cd8并具有seqidno:67的dna序列。在一个实施例中，信号肽来自cd8并具有seqidno:68的蛋白质序列。

粘附受体构建体

鉴于本文提供的公开，存在多种粘附受体，其可以在nk细胞中产生和表达，以靶向和破坏特定的靶细胞，例如患病细胞或癌细胞。下文更详细地讨论了此类粘附受体的非限制性实例。

在几个实施例中，提供了编码粘附受体的多核苷酸，所述粘附受体包含胞外受体结构域和锚定跨膜结构域。在几个实施例中，提供了编码两个或更多个粘附受体的多核苷酸。在几个实施例中，两个或更多个粘附受体以协同方式作用，以在配体与粘附受体结合后活化(例如扩增)nk细胞。在一些实施例中，两个或更多个粘附受体结合不同的抗原。在一些实施例中，两个或更多个粘附受体结合相同抗原。在一些实施例中，两个或更多个粘附受体结合相同抗原的不同表位。

除了单一类型的粘附受体、一种类型的粘附受体的多个“重复”和不同类型的粘附受体的组合之外，在几个实施例中还提供了另外的共活化分子。例如，在若干实施例中，nk细胞经工程改造以表达膜结合白细胞介素15(mbil15)。在此类实施例中，nk细胞上mbil15的存在通过协同增强nk细胞的增殖和寿命而进一步增强nk细胞的细胞毒性作用。在几个实施例中，mbil15具有seqidno.16的核酸序列。在一些实施例中，mbil15可以被截短或修饰，使得其与seqidno.16的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同源性。在几个实施例中，mbil15具有seqidno.17的氨基酸序列。在一些实施例中，mbil15可以被截短或修饰，使得其与seqidno.17的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同源性。在几个实施例中，mbil15虽然被截短，但保留了mbil15的至少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％的功能。结合本文公开的粘附受体，这些实施例提供了特别有效的nk细胞组合物，用于靶向和破坏特定的靶细胞。

在一些实施例中，本文公开的粘附受体的表面表达和功效通过间隔区(铰链)的变化而增强，在一些实施例中，所述间隔区(铰链)位于邻近跨膜结构域的胞外受体结构域中。在一些实施例中，用于本文其他地方公开的某些目的的结构域可以提供额外的功能(例如，即使特定结构域可以在公开信号传导结构域的部分中描述，所述特定结构域也可以用于构建体的不同部分中的另一功能)。例如，在若干实施例中，cd8a被重新目的化以用作铰链区(在若干实施例中，由seqidno:5的核酸序列编码)。在另一个实施例中，铰链区包含n末端截短形式的cd8a和/或c末端截短形式的cd8a。取决于实施例，这些截短可以与seqidno.5编码的铰链至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％同源。在若干另外的实施例中，铰链包含甘氨酸和丝氨酸残基的跨度(本文称为“gs接头”)，其中gsn代表序列(gly-gly-gly-gly-ser)n(seqidno.42)。在一个实施例中，铰链包含cd8a和gs3，并且由seqidno:32的氨基酸序列编码，例如，其中n＝3。在另外的实施例中，取决于实施例，n的值可以等于1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更大。在若干实施例中，铰链也可以构造为gsn/cd8a。或者，gs接头可包含整个铰链区。在一个这样的实施例中，铰链区由seqidno:33的核酸序列编码。在另一个这样的实施例中，铰链区由seqidno:34的核酸序列编码。

在若干实施例中，粘附受体被配置为二聚化，如本文另外详细讨论的。取决于实施例，二聚化可包括同源二聚体或异二聚体。在一些实施例中，二聚化导致粘附受体(以及因此表达受体的nk细胞)的亲合力转变为在协调平衡减少(或缺乏)不利毒性作用情况下更好的配体识别。在更进一步的实施例中，胞外受体结构域还包含cd8a信号肽。在若干实施例中，粘附受体使用内部二聚体或一个或多个组分亚基的重复。

任选地，取决于实施例，本文公开的任何多核苷酸还可编码粘附受体的一个或多个组成亚基的截短和/或变体，但仍保留其将nk细胞导向靶细胞的能力，并且在若干实施例中出人意料地增强结合后的细胞毒性。此外，本文公开的任何多核苷酸还可任选地包括编码粘附受体的各种组成亚基的密码子优化的核苷酸序列。如本文所用，术语“片段”和“截短的”应给出它们的普通含义，并且还应包括蛋白质的n-和c-末端缺失变体。

在几个实施例中，提供了编码抗her2粘附受体的多核苷酸，所述抗her2粘附受体包含抗her2scfv和跨膜区。在一个实施例中，该粘附受体由seqidno:60的核酸序列编码。在又一个实施例中，抗her2粘附受体包含seqidno:61的氨基酸序列。在若干实施例中，当nk细胞同时表达mbil15时，该构建体特别有效，mbil15对nk细胞的活化和细胞毒性提供进一步的协同效应。在一些实施例中，粘附受体的序列可以不同于seqidno.60，但取决于实施例，与seqidno.60保留至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同源。在几个实施例中，粘附受体可以不同于seqidno.60，粘附受体保留nk细胞活化和/或细胞毒性功能或在一些实施例中具有增强的nk细胞靶向、活化和/或细胞毒性功能。

在几个实施例中，提供了编码抗psma粘附受体的多核苷酸，所述抗psma粘附受体包含抗psmascfv和跨膜区。在一个实施例中，该粘附受体由seqidno:64的核酸序列编码。在又一个实施例中，抗psma粘附受体包含seqidno:65的氨基酸序列。在若干实施例中，当nk细胞同时表达mbil15时，该构建体特别有效，mbil15对nk细胞的活化和细胞毒性提供进一步的协同效应。在一些实施例中，粘附受体的序列可以不同于seqidno.64，但取决于实施例，与seqidno.64保留至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同源。在几个实施例中，粘附受体可以不同于seqidno.64，粘附受体保留nk细胞活化和/或细胞毒性功能或在一些实施例中具有增强的nk细胞靶向、活化和/或细胞毒性功能。

可以将编码本文所述粘附受体的多核苷酸插入载体中以在nk细胞中实现重组蛋白表达。在一个实施例中，所述多核苷酸可操作地连接到用于表达所述粘附受体的至少一个调控元件。在具体的实施例中，与本文公开的肽异源的转录调节元件(例如内部核糖体进入位点(ires)或增强子元件)用于指导粘附受体的转录。根据实施例，粘附受体的各种组成部分可以在单个载体中递送至nk细胞，或者可替代地在多个载体中递送。在一些实施例中，粘附受体构建体在单一载体中递送，而另一种增强粘附受体功效的因子(例如mbil15)在分开的载体中递送。在若干实施例中，粘附受体和增强粘附受体功效的因子(例如mbil15)在单一载体中递送。无论使用多少载体，任何多核苷酸可任选地包括标签序列，该标签序列允许鉴定表达该构建体的nk细胞的存在。例如，在几个实施例中，使用flag标签(dykddddk，seqidno.55)。还可用其他标签序列，例如多组氨酸标签(his标签)(hhhhhh，seqidno.56)，ha标签或myc标签(eqkliseedl；seqidno:57)。可替代地，使用绿色荧光蛋白或其他荧光部分。还可以使用标签类型的组合来单独识别粘附受体的亚组分。

在若干实施例中，编码粘附受体的多核苷酸是可以通过电穿孔引入nk细胞的mrna。在另一个实施例中，载体是病毒，优选逆转录病毒，其可以通过转导引入nk细胞。在若干实施例中，载体是鼠干细胞病毒(mscv)。在另外的实施例中，可以使用其他载体，例如可以使用慢病毒、腺病毒、腺相关病毒等。在若干实施例中，使用非hiv衍生的逆转录病毒。选择的载体取决于多种因素，包括但不限于转录调节元件的强度和用于表达蛋白质的细胞。载体可以是质粒、噬菌粒、粘粒、病毒载体、噬菌体、人工染色体等。在另外的实施例中，载体可以是游离载体、非同源地或同源地整合的载体，其可以通过任何合适的方式(转化、转染、接合、原生质体融合、电穿孔、磷酸钙沉淀、直接显微注射等)引入适当的细胞中以转化它们。在几个实施例中使用诱导nk细胞中粘附受体表达的其他方法，包括例如sv40早期启动子区、劳斯肉瘤病毒的3′长末端重复序列中包含的启动子、疱疹胸苷激酶启动子、金属硫蛋白基因的调控序列、腺病毒(adv)启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、牛乳头瘤病毒(bpv)启动子、细小病毒b19p6启动子、β-内酰胺酶启动子、tac启动子、胭脂碱合成酶启动子区或花椰菜花叶病毒35srna启动子、核酮糖二磷酸羧化酶启动子、gal4启动子、adc(醇脱氢酶)启动子、pgk(磷酸甘油激酶)启动子、含有修饰momulvltr的u3区和骨髓增生性肉瘤病毒增强子的合成mnd启动子和碱性磷酸酶启动子。

可以改造自然杀伤细胞以表达本文公开的粘附受体。可以使用本领域技术人员已知的任何技术将粘附受体表达构建体引入nk细胞中。在一个实施例中，粘附受体在nk细胞中瞬时表达。在另一个实施例中，粘附受体在nk细胞中稳定表达。在另一个实施例中，nk细胞是自体细胞。在另一个实施例中，nk细胞是供体来源的(同种异体的)细胞。

本文进一步提供了治疗患有癌症或传染病的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用包含经工程改造以表达如本文公开的粘附受体的nk细胞的组合物，所述粘附受体设计成靶向在受损或患病细胞或组织上差异表达(例如，与正常细胞或组织相比表达程度不同)的标志物或配体。如本文所用，术语“进行表达”，“表达的”和“表达”应给出其普通含义，并且应指允许或使基因或多核苷酸序列中的信息得以表现，例如通过激活与相应基因或dna序列的转录和翻译有关的细胞功能来产生蛋白质。表达产物本身，例如所得蛋白质，也可以说成是由细胞“表达”的。表达产物可以表征为胞内、胞外或跨膜。术语“胞内”应给出其普通含义，并且应指细胞内部。术语“胞外”应给出其普通含义，并且应指细胞外部。术语“跨膜”应给出其普通含义，并且应指多肽的包埋在细胞膜中的至少一部分。术语“胞质”应具有其普通含义，并且应指位于细胞核外、细胞膜内。如本文所用，在对受试者施用治疗的背景下，术语“治疗(treat)”、“进行治疗(treating)”和“治疗(treatment)”应给予其普通含义，并且应指受试者源自治疗的有益效果。在某些实施例中，用本文所述的一种或多种基因工程改造的细胞治疗受试者实现以下效果中的一种、两种、三种、四种或更多种，这些效果包括例如：(i)减少或改善疾病或与其相关的症状的严重程度；(ii)减少与疾病相关的症状的持续时间；(iii)防止疾病或与其相关的症状的进展；(iv)疾病或与其相关的症状的消退；(v)防止与疾病相关的症状的发展或发作；(vi)防止与疾病相关的症状再次发生；(vii)减少受试者的住院治疗；(viii)减少住院治疗时长；(ix)患有疾病的受试者的存活增加；(x)减少与疾病相关的症状的数目；(xi)另一种疗法的一个或多个预防效果或治疗效果的增强、改善、补充、互补或增大。可以通过多种途径给药，包括但不限于静脉内、动脉内、皮下、肌肉内、肝内、腹膜内和/或局部递送至受影响的组织。对于给定受试者基于他们的体重、疾病类型和状态以及所需的治疗积极性可以容易地确定的nk细胞剂量，但取决于实施例，范围从约10⁵个细胞/kg至约10¹²细胞/kg(例如，10^5-10⁷、10^7-10¹⁰、10^10-10¹²及其中的重叠范围)。在一个实施例中，使用剂量递增方案。在一些实施例中，施用一个范围的nk细胞，例如约1x10⁶个细胞/kg与约1x10⁸个细胞/kg之间。根据实施例，可以治疗各种类型的癌症或传染病。本文提供的各种实施例包括治疗或预防癌症的以下非限制性实例，包括但不限于急性淋巴细胞白血病(all)、急性髓性白血病(aml)、肾上腺皮质癌、卡波西肉瘤、淋巴瘤、胃肠癌、阑尾癌、中枢神经系统癌、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑肿瘤(包括但不限于星形细胞瘤、脊髓肿瘤、脑干胶质瘤、颅咽管瘤、室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、髓质上皮瘤)、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、宫颈癌、结肠癌、慢性淋巴细胞白血病(cll)、慢性髓细胞性白血病病(cml)、慢性骨髓增生性障碍、导管癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、肾细胞癌、白血病、口腔癌、鼻咽癌、肝癌、肺癌(包括但不限于非小细胞肺癌(nsclc)和小细胞肺癌)、胰腺癌、肠癌、淋巴瘤、黑色素瘤、眼癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、垂体癌、子宫癌和阴道癌。

此外，本文提供的各种实施例包括治疗或预防传染病的以下非限制性实例，包括但不限于细菌来源的感染，该细菌来源的感染可包括例如来自以下一个或多个属的细菌感染：包特菌属(bordetella)、疏螺旋体属(borrelia)、布鲁杆菌属(brucella)、弯曲杆菌属(campylobacter)、衣原体属(chlamydia)和嗜衣原体属(chlamydophila)、梭状芽胞杆菌属(clostridium)、棒状杆菌属(corynebacterium)、肠球菌属(enterococcus)、埃希氏菌属(escherichia)、弗朗西斯氏菌属(francisella)、嗜血杆菌属(haemophilus)、螺杆菌属(helicobacter)、军团菌属(legionella)、钩端螺旋体属(leptospira)、李斯特菌属(listeria)、分枝杆菌属(mycobacterium)、支原体属(mycoplasma)、奈瑟菌属(neisseria)、假单胞菌属(pseudomonas)、立克次体属(rickettsia)、沙门菌属(salmonella)、志贺菌属(shigella)、葡萄球菌属(staphylococcus)、链球菌属(streptococcus)、密螺旋体属(treponema)、弧菌属(vibrio)和耶尔森菌属(yersinia)，以及突变体或其组合。在几个实施例中，提供了治疗多种真菌感染的方法。根据实施例，真菌来源的感染可包括例如来自以下一个或多个属的真菌的感染：曲霉属、芽生菌属、念珠菌属、球孢子菌属、隐球菌属和组织胞浆菌属，以及其突变体或组合。在一些实施例中，提供了治疗多种病毒感染的方法，这些病毒感染是例如由一种或多种病毒引起的病毒感染，该一种或多种病毒是例如腺病毒、柯萨奇病毒(coxsackievirus)、爱泼斯坦-巴尔病毒(epstein-barrvirus)、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疮疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、巨细胞病毒、埃博拉病毒、人疱疹病毒8型、hiv、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳头瘤病毒、副流感病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒、风疹病毒和水痘-带状疱疹病毒。

在一些实施例中，本文还提供了核酸和氨基酸序列，该核酸和氨基酸序列与seqidno.1-65的对应核酸或氨基酸序列相比具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％(及其中的范围)的同源性并且与对应的seqidno.1-65相比还表现出一种或多种功能：包括但不限于，(i)增强的增殖，(ii)增强的活化，(iii)中的呈递配体的细胞的增强的细胞毒性活性，该配体与携带由这些核酸和氨基酸序列编码的受体的nk细胞结合，(iv)增强的归巢至肿瘤或感染部位，(v)减少的脱靶细胞毒性作用，(vi)增强的免疫刺激细胞因子和趋化因子(包括但不限于ifng、tnfa、il-22、ccl3、ccl4和ccl5)的分泌，(vii)增强的刺激进一步先天性和适应性免疫应答的能力，和(viii)其组合。

另外，在若干实施例中，提供了对应于本文公开的任何核酸的氨基酸序列，同时考虑了核酸编码的简并性。此外，与本文明确公开的那些不同但具有功能相似性或等同性的那些序列(无论是核酸还是氨基酸)也涵盖在本公开的范围内。前述包括突变体、截短、取代或其他类型的修饰。

在几个实施例中，本文所述的活化性粘附受体与表达自然杀伤细胞组2成员d的天然配体(nkg2d)的嵌合受体靶向细胞共表达，导致协同增强的nk细胞活化和细胞毒性。因此，在几个实施例中，还提供了编码包含胞外受体结构域的nkgd嵌合受体的多核苷酸，其中所述胞外受体结构域包含结合天然nkg2d的肽，其中结合nkg2d的天然配体的肽是nkg2d的片段、跨膜区和效应子结构域。在几个实施例中，nkg2d片段由包含seqidno:1序列的片段的多核苷酸编码。在若干实施例中，nkg2d片段包含seqidno:2的序列，而在另外的实施例中，编码nkg2d的片段是经密码子优化的，并且包含例如seqidno:3的序列。在几个实施例中，效应子结构域包含cd16、ncr1、ncr2、ncr3、4-1bb、cd28、nkp80、cd3ζ和2b4中的一个或多个。在几个实施例中，nkg2d不是全长的人nkg2d，而是保留其结合一个或多个nkg2d配体的能力的片段。在若干实施例中，这些效应子结构域与cd8α偶联。如本文所讨论的，将跨膜结构域和胞内结构域的组合用于几个实施例中，其提供nkg2d嵌合受体组分之间的协同相互作用并产生增强的细胞毒性作用。在几个实施例中，在nkg2d嵌合受体构建体中提供了接头、铰链或其他“间隔”元件。例如，在若干实施例中，效应子结构域包含接头。在几个实施例中，多核苷酸编码nkg2d嵌合受体构建体的各部分之间(例如4-1bb、cd28、cd16、ncr1、ncr3、cd3ζ、dap10、2b4或nkp80中的任何之间)的gs接头。在几个实施例中，nkg2d嵌合受体效应子结构域包含接头。在几个实施例中，多核苷酸编码nkg2d嵌合受体构建体的各部分之间(例如4-1bb、cd28、cd16、ncr1、ncr3、2b4或nkp80中的任何之间)的gs接头。在若干实施例中，提供了包含铰链区的嵌合受体。在几个实施例中，nkg2d嵌合受体效应子结构域包含一个或多个半itam序列。另外，本文公开的任一嵌合受体也可与膜结合白细胞介素15(mbil15)共表达。在几个实施例中，嵌合受体不使用cd3ζ信号转导结构域。在几个实施例中，嵌合受体在信号转导结构域中不使用itam或半itam基序。在几个实施例中，嵌合受体中不包括dap10。

在若干实施例中，提供的多核苷酸是mrna。在一些实施例中，所述多核苷酸可操作地连接到用于表达所述粘附受体的至少一个调控元件。如本文所用，术语“核酸”，“核苷酸”和“多核苷酸”应给出它们的普通含义，并且应包括脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核酸、核糖核苷酸和核糖核酸及其聚合形式，并且包括单链形式或双链形式。核酸包括天然存在的核酸，例如脱氧核糖核酸(“dna”)和核糖核酸(“rna”)以及核酸类似物。核酸类似物包括以下那些，其包括非天然存在的碱基、与天然磷酸二酯键以外的其他核苷酸连接的核苷酸，或包括通过磷酸二酯键以外的连接而附接的碱基。因此，核酸类似物包括，例如但不限于，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、硼磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-o-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(pna)、锁核酸(lna)等。如本文所用，术语“可操作地连接”，例如在调节核酸序列与异源核酸序列“可操作地连接”的情况下，应给出其普通含义，并且应表示调节核酸序列是与异源核酸序列处于功能关系。在ires的情况下，“可操作地连接”是指含有内部核糖体进入位点的核酸序列和在mrna序列中间的异源编码序列起始位点(其导致异源编码序列的翻译)之间的功能性连接。如本文所用，术语“载体”应给出其普通含义，并且是应指以下载体，其可以将dna或rna序列(例如，外源基因)引入基因工程改造细胞中，从而转化基因工程改造的细胞并促进导入的序列的表达(例如转录和/或翻译)。载体包括病毒、质粒、噬菌体等。本文中使用的术语“粘附受体”应赋予其普通含义，并应指识别和结合靶细胞(例如，病毒感染的和转化的细胞)上的配体的膜结合受体。本文所用的术语“嵌合受体”应给出其普通含义，并且应指包含至少两个不是天然一起存在于单个蛋白质上的多肽结构域的细胞表面受体。如本文所用的术语“嵌合受体复合物”是指第一多肽，其可以包含组合的至少两个不是天然一起存在于单个蛋白质上的多肽结构域，该第一多肽与第二多肽(例如衔接子多肽、信号分子或刺激分子)相关联。本文公开的与粘附受体的产生和使用有关的另外的术语是本领域普通技术人员容易理解的，并且也可以在国际公开wo2014/117121和美国专利号7,994,298(在此通过引用将其每一个以其全部内容结合)中找到。

另外，根据若干实施例，提供了包含编码本文提供的任何多核苷酸的多核苷酸的载体，其中这些多核苷酸任选地与至少一个用于表达粘附受体的调节元件可操作地连接。在若干实施例中，载体是逆转录病毒。

本文进一步提供了工程改造的自然杀伤细胞，其包含本文公开的多核苷酸、载体或粘附受体。在若干实施例中，这些nk细胞适用于治疗或预防疾病，例如癌症和/或传染病。

根据几个实施例，本文提供了一种治疗或预防有需要的哺乳动物中癌症或传染病的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的nk细胞，其中所述nk细胞表达由根据本公开的多核苷酸编码的粘附受体。在一些实施例中，nk细胞是从患有癌症或传染病的患者中分离的自体细胞。在一些实施例中，nk细胞是从供体分离的同种异体细胞。本文还提供了根据本公开的多核苷酸在制备用于增强有需要的哺乳动物中的nk细胞的细胞毒性的药物中的用途。还提供了根据本公开的分离的基因工程改造的自然杀伤细胞用于治疗或预防有需要的哺乳动物中的癌症或传染病的用途。

另外，在几个实施例中，提供了编码粘附受体的多核苷酸在制备用于增强自然杀伤(nk)细胞的细胞毒性的药物中的用途，所述粘附受体包含：被配置为结合靶细胞抗原的胞外受体结构域，其中所述靶细胞抗原在健康细胞和靶细胞之间差异表达，其中所述靶细胞抗原是psma；和跨膜结构域，其中所述跨膜结构域将所述胞外受体结构域锚定在nk细胞的表面上。在几个实施例中，结合靶细胞抗原的胞外受体结构域包含抗体、fab或scfv。

另外，在几个实施例中，提供了编码粘附受体的多核苷酸在制备用于增强自然杀伤(nk)细胞的细胞毒性的药物中的用途，所述粘附受体包含：被配置为结合靶细胞抗原的胞外受体结构域，其中所述靶细胞抗原在健康细胞和靶细胞之间差异表达，其中所述靶细胞抗原是her2；和跨膜结构域，其中所述跨膜结构域将所述胞外受体结构域锚定在nk细胞的表面上。在几个实施例中，结合靶细胞抗原的胞外受体结构域包含抗体、fab或scfv。

另外，在几个实施例中，提供了编码粘附受体的多核苷酸在制备用于增强自然杀伤(nk)细胞的细胞毒性的药物中的用途，所述粘附受体包含：被配置为结合靶细胞抗原的胞外受体结构域，其中所述靶细胞抗原在健康细胞和靶细胞之间差异表达，其中所述靶细胞抗原是cd123；和跨膜结构域，其中所述跨膜结构域将所述胞外受体结构域锚定在nk细胞的表面上。在几个实施例中，结合靶细胞抗原的胞外受体结构域包含抗体、fab或scfv。

另外，在几个实施例中，提供了编码粘附受体的多核苷酸在制备用于增强自然杀伤(nk)细胞的细胞毒性的药物中的用途，所述粘附受体包含：被配置为结合靶细胞抗原的胞外受体结构域，其中所述靶细胞抗原在健康细胞和靶细胞之间差异表达，其中所述靶细胞抗原是gd-2；和跨膜结构域，其中所述跨膜结构域将所述胞外受体结构域锚定在nk细胞的表面上。在几个实施例中，结合靶细胞抗原的胞外受体结构域包含抗体、fab或scfv。

另外，在几个实施例中，提供了编码粘附受体的多核苷酸在制备用于增强自然杀伤(nk)细胞的细胞毒性的药物中的用途，所述粘附受体包含：被配置为结合靶细胞抗原的胞外受体结构域，其中所述靶细胞抗原在健康细胞和靶细胞之间差异表达，其中所述靶细胞抗原是gd-3；和跨膜结构域，其中所述跨膜结构域将所述胞外受体结构域锚定在nk细胞的表面上。在几个实施例中，结合靶细胞抗原的胞外受体结构域包含抗体、fab或scfv。

另外，在几个实施例中，提供了编码粘附受体的多核苷酸在制备用于增强自然杀伤(nk)细胞的细胞毒性的药物中的用途，所述粘附受体包含：被配置为结合靶细胞抗原的胞外受体结构域，其中所述靶细胞抗原在健康细胞和靶细胞之间差异表达，其中所述靶细胞抗原是ny-eso；和跨膜结构域，其中所述跨膜结构域将所述胞外受体结构域锚定在nk细胞的表面上。在几个实施例中，结合靶细胞抗原的胞外受体结构域包含抗体、fab或scfv。

另外，在几个实施例中，提供了编码粘附受体的多核苷酸在制备用于增强自然杀伤(nk)细胞的细胞毒性的药物中的用途，所述粘附受体包含：被配置为结合靶细胞抗原的胞外受体结构域，其中所述靶细胞抗原在健康细胞和靶细胞之间差异表达，其中所述靶细胞抗原是cd19；和跨膜结构域，其中所述跨膜结构域将所述胞外受体结构域锚定在nk细胞的表面上。在几个实施例中，结合靶细胞抗原的胞外受体结构域包含抗体、fab或scfv。

在几个实施例中，提供了编码抗her2单链可变片段(抗her2scfv)的多核苷酸。在几个实施例中，抗her2scfv包含seqidno:59。在几个实施例中，抗her2scfv由包含seqidno:58的核酸编码。在几个实施例中，所述多核苷酸还编码跨膜结构域。在几个实施例中，跨膜结构域包含cd8跨膜结构域。在几个实施例中，cd8跨膜结构域包含seqidno.70。在几个实施例中，cd8跨膜结构域由包含seqidno:69的核酸编码。在几个实施例中，所述多核苷酸还编码信号肽。在几个实施例中，信号肽包含seqidno:68的cd8信号肽。在几个实施例中，所述多核苷酸还包含科扎克序列。在几个实施例中，科扎克序列包含seqidno:66的核酸序列。

在几个实施例中，提供了编码抗psma单链可变片段(抗psmascfv)的多核苷酸。在几个实施例中，抗psmascfv包含seqidno:63。在几个实施例中，抗psmascfv由包含seqidno:62的核酸编码。在几个实施例中，所述多核苷酸还编码跨膜结构域。在几个实施例中，跨膜结构域包含cd8跨膜结构域。在几个实施例中，cd8跨膜结构域包含seqidno.70。在几个实施例中，cd8跨膜结构域由包含seqidno:69的核酸编码。在几个实施例中，所述多核苷酸还编码信号肽。在几个实施例中，信号肽包含seqidno:68的cd8信号肽。在几个实施例中，所述多核苷酸还包含科扎克序列。在几个实施例中，科扎克序列包含seqidno:66的核酸序列。

在几个实施例中，提供了编码抗her2单链可变片段(抗her2scfv)的多核苷酸，其中所述抗her2scfv包含seqidno:59。在几个实施例中，抗her2scfv还包含跨膜结构域。在几个实施例中，跨膜结构域包含cd8跨膜结构域。在几个实施例中，cd8跨膜结构域包含seqidno.70。在几个实施例中，抗her2scfv还包含信号肽。在几个实施例中，信号肽包含seqidno:68的cd8信号肽。

在几个实施例中，提供了抗-psma单链可变片段(抗-psmascfv)，其中所述抗-psmascfv包含seqidno:63。在几个实施例中，抗psmascfv还包含跨膜结构域。在几个实施例中，跨膜结构域包含cd8跨膜结构域。在几个实施例中，cd8跨膜结构域包含seqidno.70。在几个实施例中，抗psmascfv还包含信号肽。在几个实施例中，信号肽包含seqidno:68的cd8信号肽。

实施例

方法

以下实验方法和材料用于下面公开的非限制性实验例中。

细胞系和培养条件

人肿瘤细胞系skbr3、skov3、lncap、zr751、du145和plc/prf/5购自美国典型培养物保藏中心(atcc；罗克维尔(rockville)，马里兰州)。细胞系保持在rpmi-1640(赛默飞世尔公司(thermofisher)，沃尔瑟姆(waltham)，马塞诸塞州)中；培养基中补充10％胎牛血清(fbs；通用医疗集团(gehealthcare)，芝加哥(chicago)，伊利诺伊州)和抗生素。用含有绿色荧光蛋白(gfp)和萤光素酶或mcherry的鼠干细胞病毒(mscv)逆转录病毒载体(来自田纳西州孟菲斯圣裘德研究医院的载体开发和生产共享资源(vectordevelopmentandproductionsharedresourceofst.judechildren’sresearchhospital))转导细胞系。

人nk细胞的扩增

外周血样取自新加坡国立大学医院血库(nationaluniversityhospitalbloodbank)健康成人捐献者血小板捐献的废弃匿名副产物。

通过在lymphoprep密度步骤(奈科明公司(nycomed)，奥斯陆，挪威)上离心分离单核细胞，并在rpmi-1640中洗涤两次。为了扩增nk细胞，将单核细胞与基因修饰的k562-mb15-41bbl细胞共培养。简言之，在6孔组织培养板中在含有10％fbs和40iu/ml人白细胞介素(il)-2(诺华公司，巴塞尔(basel)，瑞士)的scgm培养基(cellgenix公司，弗莱堡(freiburg)，德国)中将外周血单核细胞(3x10⁶)与2x10⁶个经照射(100gy)的k562-mb15-41bbl细胞培养。每隔2-3天添加新鲜组织培养基和il-2。共培养7天后，使用dynabeadscd3(赛默飞世尔公司)去除残留的t细胞，产生含有>90％cd56+cd3-nk细胞的细胞群体。实验前将扩增的nk细胞维持在具有fbs、抗生素和400iu/mlil2的scgm中。

dna质粒、逆转录病毒的产生和nk细胞的转导

通过金斯瑞公司(genescript)(南京，中国)合成了编码抗her2-cd8tm和抗psma-cd8tm构建体的质粒。用含有所述抗her2-cd8tm和抗psma-cd8tm构建体的rd114假型mscv逆转录病毒转导nk细胞。将逆转录病毒载体条件培养基添加到retronectin(宝生物公司(takara)，大津(otsu)日本)包被的聚丙烯管中；离心并去除上清液后，将扩增的nk细胞(5x10⁵)加入试管中，在37℃下放置12小时；每12h添加新鲜病毒上清液，共添加6次。然后将细胞维持在具有fbs、抗生素和400iu/mlil2的rpmi中，直到实验时间。

通过流式细胞术检测粘附受体表达

用生物素缀合的山羊抗小鼠iggf(ab’)2片段特异性抗体(杰克森免疫研究公司(jacksonimmunoresearch)，西格罗夫(westgrove)，宾夕法尼亚州)检测抗psma-cd8tm构建体的表面表达。用l-生物素蛋白(金斯瑞公司)检测抗her2-cd8tm的表面表达。用藻红蛋白(pe)或apc缀合的链霉亲和素(杰克森免疫研究公司)可视化任一试剂。细胞染色用accuric6流式细胞仪(碧迪公司公司(bectondickinson))分析。

通过流式细胞术检测nk细胞与肿瘤细胞的聚集

为了测量细胞与细胞的聚集，将mcherry转导的skov3细胞进行胰蛋白酶处理，洗涤两次并转移到1.5mleppendorf管中。以1:1的比例添加用抗her2-cd8tm加gfp或单独gfp(“模拟”)转导的nk细胞。在37℃5％co2下30分钟后，将细胞悬浮液涡旋10秒，然后通过流式细胞术计数双峰mcherry+gfp+的比例。

nk细胞与肿瘤细胞结合的检测

将skov3细胞接种到ibidi1微载玻片(伊比迪公司(ibidi)，马丁斯里德(martinsried)，德国)中并生长至汇合。用hoechst33342溶液染色10分钟后，用rpmi洗涤细胞两次。向每个通道(1x10⁵)中添加表达抗her2-cd8tm或单独表达gfp的nk细胞。10分钟后，从室的两端移除未贴壁的nk细胞，用rpmi洗涤通道两次，添加碘化丙啶并使用olympusfluoviewfv1000共聚焦显微镜检查细胞。

细胞毒性测定

用gfp/荧光素转导的靶细胞悬浮在含有10％fbs的rpmi-1640中，并镀入96孔平板(科斯塔(costar)，康宁(corning)，纽约州)中。在添加nk细胞之前，将板放置在培养箱中至少4小时以允许细胞附着。然后以不同的效应细胞与靶细胞(e:t)比添加悬浮于含10％fbs的rpmi-1640中的表达抗her2-cd8tm或单独表达gfp的经扩增的nk细胞，并与靶细胞共培养4小时。在培养结束时，在将brightglo(普洛麦格公司(promega)，菲茨堡(fitchburg)，威斯康星州)添加到孔中后，使用flx800读板仪(拜尔泰克公司(biotek)，维努斯基(winooski)，佛蒙特州)测量活细胞的数量。在一些试验中，细胞毒性是使用incucyte缩放系统(伊森生物科学公司(essenbioscience))来测量的。将mcherry转导的skov3细胞单独培养或与抗her2-cd8tm或gfp转导的nk细胞一起培养。每4小时测量每种条件的一式三份培养物中的活靶细胞数，持续160小时。细胞图像也用同样的仪器记录。

实施例1-抗her2粘附受体构建体

如本文所公开的，提供了包含与各种跨膜结构域偶联的胞外受体结构域的各种粘附受体构建体。进行本实验以评估抗her2粘附受体构建体的表达和细胞毒活性。根据上述方法和材料制备和测试抗her2粘附受体构建体。取决于构建体，可以容易地调整所使用的方法以解释产生、表达和测试构建体所需的变化。

图1描绘了说明膜结合抗her2scfv(mbaher2)插入鼠干细胞病毒(mscv)质粒的点的质粒图谱。该质粒图谱显示mbaher2构建体插入载体的ecori和xhoi限制性位点。mbaher2构建体的胞外受体结构域包含抗her2单链可变片段(抗her2scfv)和提供受体结构域所需膜定向的cd8信号肽。cd8信号肽包含seqidno:68的氨基酸序列，并由seqidno:67的核酸序列编码。抗her2scfv包含seqidno:59的氨基酸序列，并由seqidno:58的核酸序列编码。如图1所示，mbaher2构建体还包含胞外受体结构域下游的cd8跨膜结构域，其将胞外受体结构域锚定在nk细胞表面上。cd8跨膜结构域包含seqidno.70的氨基酸序列，并且由seqidno.69的核酸编码。如图1所示，mbaher2构建体还包含信号肽上游的seqidno.66的科扎克序列。总之，mbaher2构建体编码粘附受体，所述粘附受体包含seqid:61的氨基酸序列并且由seqidno.60的核酸序列编码。

首先评估nk细胞有效表达该构建体的能力。图2描绘了与扩增的原代nk细胞表面mbaher2表达相关的流式细胞术数据。以未转导的nk细胞和模拟转导的nk细胞(用只含gfp的空mscv载体转导)作为对照。通过用别藻蓝蛋白(apc)缀合的抗fab抗体染色nk细胞，确定mbaher2的存在和相对丰度。绿色荧光蛋白(gfp)表达作为病毒转导的指标。虽然通过流式细胞术分析两个对照均未显示mbaher2表达(图2a-b)，但用含有抗her2scfv和gfp的载体转导的nk细胞显示了稳健的mbaher2表达(图2c)。总之，这些数据表明，根据本文公开的若干实施例，工程改造的粘附构建体可以成功地在nk细胞上表达。

在若干实施例中，可以通过用特定构建体重复转导nk细胞来实现构建体的增强表达。在若干实施例中，构建体的组分可以在单个载体中递送至细胞，或者可替代地使用多个载体递送至细胞。取决于实施例，构建体本身可以导致增强的表达，例如线性构建体或头对尾构建体可以产生增加的表达，因为多亚基构建体需要较低程度的细胞内组装。

为了评估转导的nk细胞群体的效力，使用表达高水平her2(skbr3、skov3、lncap、zr751)和低水平her2(du145、plc/prf/5)的癌细胞系进行细胞毒性测定。与表达mbaher2的nk细胞通过her2的接合而增加对靶细胞的粘附导致细胞毒性增加的假说一致，观察到表达mbaher2的nk细胞针对表达高水平her2的癌细胞系的细胞毒性显著增加(图3a)，而针对her2低表达的癌细胞系的细胞毒性没有显著增加(图3b)。此外，表达mbaher2的nk细胞相对于对照显示出更大的针对skov3细胞的长期细胞毒性，如由incucyte活体成像系统测量的(图4)。此外，与上述细胞毒性结果一致，与对照相比，在与表达mbaher2的nk细胞培养6天后观察到较少数量的mcherry标记的skov3细胞(图5)。这些数据提供证据表明nk细胞不仅可以被工程改造以表达粘附受体构建体，而且那些表达粘附受体的细胞能够被活化并成功地产生针对靶细胞的增强的细胞毒性作用。

除了细胞毒性数据之外，通过评估接种的模拟转导的nk细胞和表达mbaher2的nk细胞对skov3细胞的运动性和聚集，检查了nk细胞发挥这些作用的机制。与细胞毒性测定一致，相对于模拟转导的nk细胞，表达mbaher2的nk细胞显示出移动距离和平均速度的统计学显著减少(图6)。此外，如图7所示，流式细胞术检测到表达mbaher2的nk细胞与skov3细胞的聚集显著增加。重要的是，根据一些实施例，这些数据表明，粘附构建物增加了nk细胞对靶细胞的靶向性，减少了nk细胞接合靶细胞所需的时间，并减少了nk细胞移动以接合靶细胞所需的距离。在细胞流式测定中评估skov3细胞与两个nk细胞群的粘附，其中观察到gfp(指示mbaher2的nk表达)和碘化丙啶染色阳性(指示靶细胞死亡)靶细胞的实质共定位(图8)。所述测定结果的定量(如图9所示)提供了粘附受体的表达负责靶细胞杀伤的进一步证据。

实施例2-抗psma粘附受体构建体

如本文所公开的，提供了包含与各种跨膜结构域偶联的胞外受体结构域的各种粘附受体构建体。进行本实验以评估抗psma粘附受体构建体的表达和细胞毒活性。根据上述方法和材料制备和测试抗psma粘附受体构建体。取决于构建体，可以容易地调整所使用的方法以解释产生、表达和测试构建体所需的变化。

图10描绘了说明膜结合抗psma(mbapsma)scfv插入鼠干细胞病毒(mscv)质粒的点的质粒图谱。该质粒图谱显示mbapsma构建体插入载体的ecori和xhoi限制性位点。mbapsma构建体的胞外受体结构域包含抗psma单链可变片段(抗psmascfv)和提供受体结构域所需膜定向的cd8信号肽。cd8信号肽包含seqidno.68的氨基酸序列，并由seqidno.67的核酸序列编码。抗psmascfv包含seqidno.63的氨基酸序列，并由seqidno.62的核酸序列编码。如图10所示，mbapsma构建体还包含胞外受体结构域下游的cd8跨膜结构域，其将胞外受体结构域锚定在nk细胞表面上。cd8跨膜结构域包含seqidno.70的氨基酸序列，并且由seqidno.69的核酸编码。如图10所示，mbapsma构建体还包含信号肽上游的seqidno.66的科扎克序列。总之，mbapsma构建体编码粘附受体，所述粘附受体包含seqid.65的氨基酸序列并且由seqidno.64的核酸序列编码。

接下来评估nk细胞有效表达该构建体的能力。图11描绘了与扩增的原代nk细胞表面mbapsma表达相关的流式细胞术数据。以未转导的nk细胞和模拟转导的nk细胞(用只含gfp的空mscv载体转导)作为对照。通过用别藻蓝蛋白(apc)缀合的抗fab抗体染色nk细胞，确定mbapsma的存在和相对丰度。绿色荧光蛋白(gfp)表达作为病毒转导的指标。虽然通过流式细胞术分析两个对照均未显示mbapsma表达(图11a-b)，但用含有抗psmascfv和gfp的载体转导的nk细胞显示了稳健的mbapsma表达(图11c)。总之，这些数据表明，根据本文公开的若干实施例，工程改造的粘附构建体可以成功地在nk细胞上表达。

实施例3-体外评估抗psma-nk构建体

进行进一步的实验以评估根据本文公开的几个实施例的nk构建体的长期细胞毒性。特别地，本实验设计用于评估包含抗psma粘附受体的nk构建体的体外细胞毒性。前列腺癌细胞系du145细胞被用作靶细胞群。du145细胞在其天然状态下为psma阴性。然而，在这里，转导du145细胞使其表达psma(“du145-psma”)。

将du145-psma铺板，并且24小时后添加包含膜结合抗psma粘附受体的nk细胞。以效应子细胞:靶细胞比为1:1的比例添加nk细胞。随着时间的推移评估每孔du145-psma细胞数，收集数据直到nk细胞添加后150小时。收集对照(未添加nk细胞)、nk模拟(不含粘附受体但表达gfp的天然nk细胞)和nkmbapsma(工程改造以表达抗psma粘附受体的nk细胞)的数据。一式三份测量值的平均值如图13所示。细胞生存力采用incucyte活体成像系统(伊森公司(essen))进行评估。

如图13所示，未暴露于nk细胞的du145-psma细胞在整个实验期间增殖，在培养约120小时后达到约1.75x108个细胞/孔的平台期(图13中的“无nk”曲线)。暴露于天然nk细胞的du145-psma(图13中的“nk模拟”曲线)在整个实验中也显示出增殖，尽管与对照相比以更慢的速率增殖，并且还达到更低的总体群体数量。相反，与表达抗-psma粘附受体的nk细胞共培养的du145-psma表现出非常有限的增殖，主要是在共培养的最初几个小时增殖(图13中的“nkmbapsma”曲线)。约8至10小时后，du145-psma细胞数量开始下降，在培养约100小时后每孔细胞数量达到零。这些数据表明，根据几个实施例，工程改造nk细胞以表达粘附受体以便更有效地将nk细胞定位于靶细胞群，导致增强的长期细胞毒性。取决于实施例，增强的细胞毒性表现持续约50小时、约75小时、约100小时、约125小时、约150小时或更长时间。在几个实施例中，增强的细胞毒性导致治疗患者所需的nk细胞免疫疗法构建体的剂量减少(例如，比用不表达如本文所公开的粘附受体的nk细胞治疗患者所需的剂量更少)。

特别是，值得注意的是，长期细胞毒性比天然nk细胞增强，已知天然nk细胞本身具有相对高的细胞毒性。与该非限制性实施例一样，根据几个实施例，使用抗-psmascfv，例如在先实施例中描述的(例如，包含seqidno.63的氨基酸序列并由seqidno.62的核酸序列编码的抗psmascfv)。然而，如本文所述，也可使用其他粘附受体以靶向并因此增强针对其他靶细胞群的基于nk的细胞毒性。在几个实施例中，粘附受体的使用有利于增强基于nk的癌症免疫疗法方案的功效。

实施例4-另外的抗psma-nk构建体的进一步体外评估

为了进一步证明粘附构建体增强nk细胞针对各种靶细胞的细胞毒性的能力，评价了根据本文公开的几个实施例的nk构建体的长期细胞毒性的另外的体外评估。设计本实验以评估包含抗psma粘附受体的nk构建体针对雄激素依赖性lncap前列腺癌系(其内源性表达psma)的体外细胞毒性。

将lncap细胞铺板，并且24小时后添加包含膜结合抗psma粘附受体的nk细胞。以效应子细胞:靶细胞比为1:1的比例添加nk细胞。随着时间的推移评估每孔lncap细胞数量，收集数据直到nk细胞添加后130小时。收集对照(未添加nk细胞)、nk模拟(不含粘附受体但表达gfp的天然nk细胞)和nkmbapsma(工程改造以表达抗psma粘附受体的nk细胞)的数据。一式三份测量值的平均值如图14所示。细胞生存力采用essen活体成像系统进行评估。

如图14所示，未暴露于nk细胞的lncap细胞在整个实验期间增殖，在培养130小时后达到约50,000个细胞/孔(图14中的“无nk细胞”曲线)。暴露于天然nk细胞的lncap(图14中的“仅nkgfp”曲线)在整个实验中也显示出增殖，尽管与对照相比以更慢的速率增殖，并且还达到更低的总体群体数量(在130小时每孔约30,000个细胞)。与表达抗psma粘附受体的nk细胞共培养的lncap细胞在实验期间表现出有限的增殖(图14中的“nkmbapsma”曲线)。在共培养的最初18-20小时，细胞数量保持相对恒定(每孔约10,000个细胞)。此后，共培养第20-第90小时，lncap细胞数量下降并且每孔低于10,000个细胞。在约第100小时，lncap细胞数量已返回到基线，且从大约第100-第120小时检测到适度增加。虽然lncap细胞数量总体上略有增加，但与对照组和天然nk组相比，增殖明显减少。因此，这些表明，根据几个实施例，工程改造nk细胞以表达粘附受体以便更有效地将nk细胞定位于靶细胞群，导致针对靶细胞群的增强的长期细胞毒性。取决于实施例，增强的细胞毒性表现持续约10-20小时、约20-30小时、约30-40小时、约40-50小时或更长时间。在几个实施例中，增强的细胞毒性导致治疗患者(特别是雄激素依赖性前列腺癌患者)所需的nk细胞免疫疗法构建体的剂量减少(例如，比用不表达如本文所公开的粘附受体的nk细胞治疗患者所需的剂量更少)。

与先前的实施例一样，值得注意的是，长期细胞毒性比天然nk细胞增强，已知天然nk细胞本身具有相对高的细胞毒性。根据几个实施例，使用例如本文所述的抗psmascfv。然而，也可使用其他粘附受体以靶向并因此增强针对其他靶细胞群的基于nk的细胞毒性。在几个实施例中，粘附受体的使用有利于增强基于nk的癌症免疫疗法方案的功效。

实施例5-抗her2-nk构建体体内评估

基于本文所讨论的体外实施例，进行了另外的非限制性实验，以评估使用本文所公开的粘附受体的靶向nk细胞对针对靶细胞群的体内细胞毒性的影响。在该非限制性实施例中，使用表达her2的卵巢癌细胞系skov-3作为靶细胞群。转导skov-3细胞，使其表达萤火虫萤光素酶。将转导的skov-3细胞以0.2x10⁶个细胞/小鼠腹腔内注射给21只nod.cg-prkdc^scidil2rg^tm1wjl/szj(nod/scidil2rgnull)小鼠。建立三个实验组(每组7只小鼠)，如下：(i)对照组，其将不接受nk细胞，但注射组织培养基；(ii)对照，其将接受仅用gfp转导的nk细胞；和(iii)mba-her2，其将接受用膜结合的抗her2粘附受体转导的nk细胞。注射skov-3细胞后第3天和第7天腹腔内注射nk细胞。每次注射的nk细胞剂量为1x10⁷个细胞/小鼠。每只小鼠还接受il-2腹腔内注射(每次注射20,000iu)，每周三次。用xenogenivis-200系统(卡尺生命科学公司(caliperlifesciences))测量腹侧和背侧肿瘤发光，在skov-3细胞注射之前和注射后22天记录基线肿瘤发光。在腹腔内注射d-萤光素钾盐水溶液(3mg/小鼠，珀金埃尔默(perkinelmer))五分钟后开始发光成像。使用活体成像(livingimage)3.0软件程序对光子进行量化。数据如图15所示。

图15的左列示出了对照小鼠的数据。相对发光表明这些小鼠在注射skov-3卵巢癌细胞22天后肿瘤负担增加。相反，中间分图(施用仅表达gfp的nk细胞)描绘了与对照(由降低的相对发光表示)相比表示显著降低的肿瘤负担的数据。图15的右分图显示了接受表达抗her2粘附构建体的nk细胞的小鼠组的数据。这组小鼠中的相对发光低于标记组和对照组，表明肿瘤负荷显著减少(与模拟相比p值等于0.004)。图15中的统计分析是通过t检验。如以上结合体外实验所讨论的，体内数据显示表达粘附受体的nk细胞的细胞毒性出人意料地增加，特别是当考虑到天然nk细胞的相对高的天然细胞毒性时。这些数据证实了体外研究，其中粘附受体构建体的表达有助于增强nk细胞的抗肿瘤活性。根据几个实施例，粘附受体的表达可增强nk细胞对承载靶抗原的靶细胞的归巢。此外，根据几个实施例，粘附受体的表达可允许在靶细胞中的nk细胞之间发生更高亲和力的相互作用。同样，在几个实施例中，粘附受体的表达可增加nk细胞在靶细胞上的驻留持续时间(例如，nk细胞与靶细胞相互作用的时间跨度)。在几个实施例中，粘附受体的表达具有一种或多种这样的效应，其可导致基于nk的免疫疗法方案的整体增加的功效。在一些实施例中，粘附受体的表达减少总体癌症免疫疗法治疗的剂量、施用频率或持续时间中的一种或多种。在几个实施例中，粘附受体的表达可以提高接受基于nk的免疫疗法治疗的患者的患者存活率。以上(或本文其他地方)所述的所有这些比较描述了表达本文公开的粘附受体的nk细胞与不表达这种粘附受体的nk细胞的特性的比较。

预期可以进行上面公开的实施例的特定特征和方面的各种组合或子组合，并且仍然落入本发明中的一个或多个中。此外，与实施例相关的任何特定特征、方面、方法、特性、特征性、质量、属性、元件等的公开内容可以用于本文阐述的所有其他实施例中。因此，应该理解的是，所公开的实施例的各种特征和方面可以彼此组合或替换，以便形成所公开的发明的不同模式。因此，意图是本文公开的本发明的范围不应受上述具体公开的实施例的限制。此外，尽管本发明易于进行各种修改和替代形式，但是其具体实施例已在附图中示出并在本文中详细描述。然而，应该理解，本发明不限于所公开的特定形式或方法，相反，本发明将覆盖落入各种实施例描述和所附权利要求的精神和范围内的所有修改、等同物和替代物。本文公开的任何方法不需要按照所述顺序进行。本文公开的方法包括从业者采取的某些行为；但是，他们也可以明确地或暗示地包括这些行为的任何第三方指示。例如，诸如“施用扩增的nk细胞群”的行为包括“指导扩增的nk细胞群的施用”。此外，当本公开的特征或方面以马库什组(markushgroup)描述时，本领域技术人员应意识到本公开还由此描述马库什组的任何单个个体或亚组个体。

本文公开的范围还涵盖任何和所有重叠、子范围及其组合。诸如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”、“之间”等语言包括所叙述的数字。在诸如“约”或“大约”之类的术语之后的数字包括所叙述的数字。例如，“10纳米左右”包括“10纳米”。

序列表

<110>新加坡国立大学（nationaluniversityofsingapore）

<120>粘附受体构建体及其在自然杀伤细胞免疫疗法中的用途

<130>4459.1148002(nkt.016pr2)

<150>62/628797

<151>2018-02-09

<150>62/736,965

<151>2018-09-26

<160>70

<170>patentin版本3.5

<210>1

<211>645

<212>dna

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>全长nkg2d

<400>1

gggtggattcgtggtcggaggtctcgacacagctgggagatgagtgaatttcataattat60

aacttggatctgaagaagagtgatttttcaacacgatggcaaaagcaaagatgtccagta120

gtcaaaagcaaatgtagagaaaatgcatctccattttttttctgctgcttcatcgctgta180

gccatgggaatccgtttcattattatggtaacaatatggagtgctgtattcctaaactca240

ttattcaaccaagaagttcaaattcccttgaccgaaagttactgtggcccatgtcctaaa300

aactggatatgttacaaaaataactgctaccaattttttgatgagagtaaaaactggtat360

gagagccaggcttcttgtatgtctcaaaatgccagccttctgaaagtatacagcaaagag420

gaccaggatttacttaaactggtgaagtcatatcattggatgggactagtacacattcca480

acaaatggatcttggcagtgggaagatggctccattctctcacccaacctactaacaata540

attgaaatgcagaagggagactgtgcactctatgcctcgagctttaaaggctatatagaa600

aactgttcaactccaaatacgtacatctgcatgcaaaggactgtg645

<210>2

<211>405

<212>dna

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>截短的nkg2d

<400>2

ttattcaaccaagaagttcaaattcccttgaccgaaagttactgtggcccatgtcctaaa60

aactggatatgttacaaaaataactgctaccaattttttgatgagagtaaaaactggtat120

gagagccaggcttcttgtatgtctcaaaatgccagccttctgaaagtatacagcaaagag180

gaccaggatttacttaaactggtgaagtcatatcattggatgggactagtacacattcca240

acaaatggatcttggcagtgggaagatggctccattctctcacccaacctactaacaata300

attgaaatgcagaagggagactgtgcactctatgcctcgagctttaaaggctatatagaa360

aactgttcaactccaaatacgtacatctgcatgcaaaggactgtg405

<210>3

<211>405

<212>dna

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>密码子优化的截短的nkg2d

<400>3

ctgttcaatcaggaagtccagatccccctgacagagtcttactgcggcccatgtcccaag60

aactggatctgctacaagaacaattgttatcagttctttgacgagagcaagaactggtat120

gagtcccaggcctcttgcatgagccagaatgcctctctgctgaaggtgtacagcaaggag180

gaccaggatctgctgaagctggtgaagtcctatcactggatgggcctggtgcacatccct240

acaaacggctcttggcagtgggaggacggctccatcctgtctccaaatctgctgaccatc300

atcgagatgcagaagggcgattgcgccctgtacgccagctccttcaagggctatatcgag360

aactgctccacacccaatacctacatctgtatgcagaggaccgtg405

<210>4

<211>63

<212>dna

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>cd8信号传导序列

<400>4

atggctctgcccgtcaccgcactgctgctgcctctggctctgctgctgcacgccgcacga60

cca63

<210>5

<211>135

<212>dna

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>cd8α铰链

<400>5

accacaacccctgcaccacgcccccctacaccagcacctaccatcgcaagccagcctctg60

tccctgcggccagaggcatgtagaccagcagcaggaggagcagtgcacacaagaggcctg120

gacttcgcctgcgat135

<210>6

<211>1722

<212>dna

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>cd8β

<220>

<221>尚未归类的特征

<222>(674)..(773)

<223>n是a,c,g,或t

<220>

<221>尚未归类的特征

<222>(859)..(958)

<223>n是a,c,g,或t

<400>6

atctaggtcttgctgcacccgcacaacctacaaacagcgtcggggccttctctgcacctc60

cagttcccagctcacctccctcagtgtcacagccggttacctttccttcctccctggggg120

agggcaagacttggggcttgctgactccaggcccagcccagcccggggcacccaggagcc180

cctcaattgctactcaaacagacaagaagcggcccgagttagtggccagctccaccatgc240

actacacatcctgacctctctgagcctctactgtcactcggggtcacaaccctttcctga300

gcacctcccggggcagggggcgatgacacacatgcagctgcctgggggaggccggcggtg360

tcccctcctttctggaacgcggagggtcctggtgggctctggaaacgcagcccagacctt420

tgcaatgctaggaggatgagggcggagacctcgcggtccccaacaccagactcccgcagc480

caccgcgcccggtcccgccctccccactgcccccccagctccccgacccaggcgccccgc540

ccggccagctcctcacccaccccagccgcgactgtctccgccgagcccccggggccaggt600

gtcccgggcgcgccacgatgcggccgcggctgtggctcctcctggccgcgcagctgacag660

gtaaggcggcggcnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn720

nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnttgcttt780

cctcttccaggccggcggaggagagcccggcttcgtttcatgaaacagtaagtgtataac840

ctgggtgtggccttgggannnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn900

nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnct960

tgctgttgttttcagattttacaaatgagcagagaatacggttttggtgtcctgctacaa1020

aaagacatcggtcagtaacgagcacgatgtggaaaaatgagagaagggacacattcaacc1080

ctggagagttcaatggctgctgaagctgcctgcttttcactgctgcaaggcctttctgtg1140

tgtgacgtgcatgggagcaacttgttcgtgggtcatcgggaatactagggagaaggtttc1200

attgcccccagggcacttcacagagtgtgctggaggactgagtaagaaatgctgcccatg1260

ccaccgcttccggctcctgtgctttccctgaactgggacctttagtggtggccatttagc1320

caccatctttgcaggttgctttgccctggtagggcagtaacattgggtcctgggtctttc1380

atggggtgatgctgggctggctccctgttggtcttcccaggctggggctgaccttcctcg1440

cagagaggccaggtgcaggttgggaatgaggcttgctgagaggggctgtccagttcccag1500

aaggcatatcagtctctgagggcttcctttggggccgggaacttgcgggtttgaggatag1560

gagttcacttcatcttctcagctcccatttctactcttaagtttctcagctcccatttct1620

actctcccatggcttaatgcttctttcattttctgtttgttttatacaaatgtcttagtt1680

gtaaaaataaagtcccaggttaaagataacaaacgggtcctg1722

<210>7

<211>2415

<212>dna

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>cd16α

<400>7

attcttggtgctgggtggatccaaatccaggagatggggcaagcatcctgggatggctga60

gggcacactctggcagattctgtgtgtgtcctcagatgctcagccacagacctttgaggg120

agtaaagggggcagacccacccaccttgcctccaggctctttccttcctggtcctgttct180

atggtggggctcccttgccagacttcagactgagaagtcagatgaagtttcaagaaaagg240

aaattggtgggtgacagagatgggtggaggggctggggaaaggctgtttacttcctcctg300

tctagtcggtttggtccctttagggctccggatatctttggtgacttgtccactccagtg360

tggcatcatgtggcagctgctcctcccaactgctctgctacttctagtttcagctggcat420

gcggactgaagatctcccaaaggctgtggtgttcctggagcctcaatggtacagggtgct480

cgagaaggacagtgtgactctgaagtgccagggagcctactcccctgaggacaattccac540

acagtggtttcacaatgagagcctcatctcaagccaggcctcgagctacttcattgacgc600

tgccacagtcgacgacagtggagagtacaggtgccagacaaacctctccaccctcagtga660

cccggtgcagctagaagtccatatcggctggctgttgctccaggcccctcggtgggtgtt720

caaggaggaagaccctattcacctgaggtgtcacagctggaagaacactgctctgcataa780

ggtcacatatttacagaatggcaaaggcaggaagtattttcatcataattctgacttcta840

cattccaaaagccacactcaaagacagcggctcctacttctgcagggggctttttgggag900

taaaaatgtgtcttcagagactgtgaacatcaccatcactcaaggtttggcagtgtcaac960

catctcatcattctttccacctgggtaccaagtctctttctgcttggtgatggtactcct1020

ttttgcagtggacacaggactatatttctctgtgaagacaaacattcgaagctcaacaag1080

agactggaaggaccataaatttaaatggagaaaggaccctcaagacaaatgacccccatc1140

ccatgggggtaataagagcagtagcagcagcatctctgaacatttctctggatttgcaac1200

cccatcatcctcaggcctctctacaagcagcaggaaacatagaactcagagccagatccc1260

ttatccaactctcgacttttccttggtctccagtggaagggaaaagcccatgatcttcaa1320

gcagggaagccccagtgagtagctgcattcctagaaattgaagtttcagagctacacaaa1380

cactttttctgtcccaaccgttccctcacagcaaagcaacaatacaggctagggatggta1440

atcctttaaacatacaaaaattgctcgtgttataaattacccagtttagaggggaaaaaa1500

aaacaattattcctaaataaatggataagtagaattaatggttgaggcaggaccatacag1560

agtgtgggaactgctggggatctagggaattcagtgggaccaatgaaagcatggctgaga1620

aatagcaggtagtccaggatagtctaagggaggtgttcccatctgagcccagagataagg1680

gtgtcttcctagaacattagccgtagtggaattaacaggaaatcatgagggtgacgtaga1740

attgagtcttccaggggactctatcagaactggaccatctccaagtatataacgatgagt1800

cctcttaatgctaggagtagaaaatggtcctaggaaggggactgaggattgcggtggggg1860

gtggggtggaaaagaaagtacagaacaaaccctgtgtcactgtcccaagttgctaagtga1920

acagaactatctcagcatcagaatgagaaagcctgagaagaaagaaccaaccacaagcac1980

acaggaaggaaagcgcaggaggtgaaaatgctttcttggccagggtagtaagaattagag2040

gttaatgcagggactgtaaaaccaccttttctgcttcaatatctaattcctgtgtagctt2100

tgttcattgcatttattaaacaaatgttgtataaccaatactaaatgtactactgagctt2160

cgctgagttaagttatgaaactttcaaatccttcatcatgtcagttccaatgaggtgggg2220

atggagaagacaattgttgcttatgaaagaaagctttagctgtctctgttttgtaagctt2280

taagcgcaacatttcttggttccaataaagcattttacaagatcttgcatgctactctta2340

gatagaagatgggaaaaccatggtaataaaatatgaatgataaaaaaaaaaaaaaaaaaa2400

aaaaaaaaaaaaaaa2415

<210>8

<211>2473

<212>dna

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>cd16β

<220>

<221>尚未归类的特征

<222>(211)..(310)

<223>n是a,c,g,或t

<220>

<221>尚未归类的特征

<222>(537)..(636)

<223>n是a,c,g,或t

<220>

<221>尚未归类的特征

<222>(968)..(1067)

<223>n是a,c,g,或t

<400>8

aaagatgggtggagggactggggaaaggctgtttactccctcctgtctagtcggcttggt60

ccctttaggggtccggatatctttggtgacttgtccactccagtgtggcatcatgtggca120

gctgctcctcccaactgctctgctacttctaggtaagtaggatctccctggttgagggag180

aagtttgagatgccttgggttcagcagagannnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn240

nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn300

nnnnnnnnnnaagaggcatgaacagtggaagaccagagagcaggtagcaaggtttccacc360

agaaacatcctgattcttgggaaaattgggctcctggggcagaggagggcaggggagttt420

taaactcactctatgttctaatcactctgatctctgcccctactcaatatttgatttact480

cttttttcttgcagtttcagctggcatgcggactggtgagtcagcttcatggtcttnnnn540

nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn600

nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnncactgagagctgagctcccgggcc660

tggggtgtctctgtgtctttcaggctggctgttgctccaggcccctcggtgggtgttcaa720

ggaggaagaccctattcacctgaggtgtcacagctggaagaacactgctctgcataaggt780

cacatatttacagaatggcaaagacaggaagtattttcatcataattctgacttccacat840

tccaaaagccacactcaaagatagcggctcctacttctgcagggggcttgttgggagtaa900

aaatgtgtcttcagagactgtgaacatcaccatcactcaaggtgagacatgtgccaccct960

ggaatgcnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn1020

nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnntttttcatctctc1080

cacttctcctaataggtttggcagtgtcaaccatctcatcattctctccacctgggtacc1140

aagtctctttctgcttggtgatggtactcctttttgcagtggacacaggactatatttct1200

ctgtgaagacaaacatttgaagctcaacaagagactggaaggaccataaacttaaatgga1260

gaaaggaccctcaagacaaatgacccccatcccatgggagtaataagagcagtggcagca1320

gcatctctgaacatttctctggatttgcaaccccatcatcctcaggcctctctacaagca1380

gcaggaaacatagaactcagagccagatcctttatccaactctcgatttttccttggtct1440

ccagtggaagggaaaagcccatgatcttcaagcagggaagccccagtgagtagctgcatt1500

cctagaaattgaagtttcagagctacacaaacactttttctgtcccaaccattccctcac1560

agtaaaacaacaatacaggctagggatggtaatcctttaaacatacaaaaattgctcgta1620

ttataaattacccagtttagaccggaaaaaagaaaataattattcctaaacaaatggata1680

agtagaattaatgattgaggcaggaccctacagagtgtgggaactgctggggatctagag1740

aattcagtgggaccaatgaaagcatggctgagaaatagcagggtagtccaggagagtcta1800

agggaggtgttcccatctgagcccagagataagggtgtcttcctagaacattagccgtag1860

tggaattaacaggaaatcatgagggtgacgtagaattgagtcttccaggggactctatca1920

gaactggaccatttccaagtatataacgatgagccctctaatgctaggagtagcaaatgg1980

tcctaggaaggggactgaggattggggtgggggtggggtggaaaagaaagtacagaacaa2040

accctgtgtcactgtcccaagttaagctaagtgaacagaactatctcagcatcagaatga2100

gaaagcctgagaagaaagaaccaaccacaagcacacaggaaggaaagcgcaggaggtgaa2160

aatgctttcttggccagggtagtaagaattagaggttaatgcagggactgtaaaaccacc2220

ttttctgcttcaatgtctagttcctgtatagctttgttcattgcatttattaaacaaatg2280

ttgtataaccaatactaaatgtactactgagcttcactgagttacgctgtgaaactttca2340

aatccttcttcatgtcagttccaatgaggtggggatggagaagacaattgttgcttatga2400

aaaaaagctttagctgtctctgttttgtaagctttcagtgcaacatttcttggttccaat2460

aaagcattttaca2473

<210>9

<211>370

<212>prt

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>2b4

<400>9

metleuglyglnvalvalthrleuileleuleuleuleuleulysval

151015

tyrglnglylysglycysglnglyseralaasphisvalvalserile

202530

serglyvalproleuglnleuglnproasnserileglnthrlysval

354045

aspserilealatrplyslysleuleuproserglnasnglyphehis

505560

hisileleulystrpgluasnglyserleuproserasnthrserasn

65707580

aspargpheserpheilevallysasnleuserleuleuilelysala

859095

alaglnglnglnaspserglyleutyrcysleugluvalthrserile

100105110

serglylysvalglnthralathrpheglnvalphevalphegluser

115120125

leuleuproasplysvalglulysproargleuglnglyglnglylys

130135140

ileleuaspargglyargcysglnvalalaleusercysleuvalser

145150155160

argaspglyasnvalsertyralatrptyrargglyserlysleuile

165170175

glnthralaglyasnleuthrtyrleuaspglugluvalaspileasn

180185190

glythrhisthrtyrthrcysasnvalserasnprovalsertrpglu

195200205

serhisthrleuasnleuthrglnaspcysglnasnalahisglnglu

210215220

pheargphetrppropheleuvalileilevalileleuseralaleu

225230235240

pheleuglythrleualacysphecysvaltrpargarglysarglys

245250255

glulysglnsergluthrserprolysglupheleuthriletyrglu

260265270

aspvallysaspleulysthrargargasnhisgluglngluglnthr

275280285

pheproglyglyglyserthriletyrsermetileglnserglnser

290295300

seralaprothrserglngluproalatyrthrleutyrserleuile

305310315320

glnproserarglysserglyserarglysargasnhisserproser

325330335

pheasnserthriletyrgluvalileglylysserglnprolysala

340345350

glnasnproalaargleuserarglysgluleugluasnpheaspval

355360365

tyrser

370

<210>10

<211>279

<212>dna

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>dap10

<400>10

atgatccatctgggtcacatcctcttcctgcttttgctcccagtggctgcagctcagacg60

actccaggagagagatcatcactccctgccttttaccctggcacttcaggctcttgttcc120

ggatgtgggtccctctctctgccgctcctggcaggcctcgtggctgctgatgcggtggca180

tcgctgctcatcgtgggggcggtgttcctgtgcgcacgcccacgccgcagccccgcccaa240

gatggcaaagtctacatcaacatgccaggcaggggctga279

<210>11

<211>575

<212>dna

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>dap12

<400>11

agacttcctccttcacttgcctggacgctgcgccacatcccaccggcccttacactgtgg60

tgtccagcagcatccggcttcatggggggacttgaaccctgcagcaggctcctgctcctg120

cctctcctgctggctgtaagtgattgcagttgctctacggtgagcccgggcgtgctggca180

gggatcgtgatgggagacctggtgctgacagtgctcattgccctggccgtgtacttcctg240

ggccggctggtccctcgggggcgaggggctgcggaggcagcgacccggaaacagcgtatc300

actgagaccgagtcgccttatcaggagctccagggtcagaggtcggatgtctacagcgac360

ctcaacacacagaggccgtattacaaatgagcccgaatcatgacagtcagcaacatgata420

cctggatccagccattcctgaagcccaccctgcacctcattccaactcctaccgcgatac480

agacccacagagtgccatccctgagagaccagaccgctccccaatactctcctaaaataa540

acatgaagcacaaaaacaaaaaaaaaaaaaaaaaa575

<210>12

<211>126

<212>dna

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>4-1bb

<400>12

aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaa60

actactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgt120

gaactg126

<210>13

<211>339

<212>dna

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>cd3-ζ

<400>13

agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctc60

tataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggc120

cgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaat180

gaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgc240

cggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacc300

tacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa339

<210>14

<211>6

<212>prt

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>经典的半-tam

<220>

<221>尚未归类的特征

<222>(4)..(5)

<223>x=任何氨基酸

<400>14

aspglytyrxaaxaaleu

<210>15

<211>6

<212>prt

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>itsm基序

<220>

<221>尚未归类的特征

<222>(1)..(1)

<223>n=s或t

<220>

<221>尚未归类的特征

<222>(2)..(2)

<223>x=任何氨基酸

<220>

<221>尚未归类的特征

<222>(4)..(5)

<223>x=任何氨基酸

<220>

<221>尚未归类的特征

<222>(6)..(6)

<223>n=l或i

<400>15

asnxaatyrxaaxaaasn

<210>16

<211>614

<212>dna

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>膜结合il15

<400>16

atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccagg60

ccgaactgggtgaatgtaataagtgatttgaaaaaaattgaagatcttattcaatctatg120

catattgatgctactttatatacggaaagtgatgttcaccccagttgcaaagtaacagca180

atgaagtgctttctcttggagttacaagttatttcacttgagtccggagatgcaagtatt240

catgatacagtagaaaatctgatcatcctagcaaacaacagtttgtcttctaatgggaat300

gtaacagaatctggatgcaaagaatgtgaggaactggaggaaaaaaatattaaagaattt360

ttgcagagttttgtacatattgtccaaatgttcatcaacacttctaccacgacgccagcg420

ccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagag480

gcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgat540

atctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggtatca600

ccctttactgctaa614

<210>17

<211>204

<212>prt

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>膜结合il15

<400>17

metalaleuprovalthralaleuleuleuproleualaleuleuleu

151015

hisalaalaargproasntrpvalasnvalileseraspleulyslys

202530

ilegluaspleuileglnsermethisileaspalathrleutyrthr

354045

gluseraspvalhisprosercyslysvalthralametlyscysphe

505560

leuleugluleuglnvalileserleugluserglyaspalaserile

65707580

hisaspthrvalgluasnleuileileleualaasnasnserleuser

859095

serasnglyasnvalthrgluserglycyslysglucysglugluleu

100105110

gluglulysasnilelysglupheleuglnserphevalhisileval

115120125

glnmetpheileasnthrserthrthrthrproalaproargpropro

130135140

thrproalaprothrilealaserglnproleuserleuargproglu

145150155160

alacysargproalaalaglyglyalavalhisthrargglyleuasp

165170175

phealacysaspiletyriletrpalaproleualaglythrcysgly

180185190

valleuleuleuserleuvalilethrleutyrcys

195200

<210>18

<211>1140

<212>dna

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>nkg2d/cd8a/4-1bb/cd3z

<400>18

atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccagg60

ccgttattcaaccaagaagttcaaattcccttgaccgaaagttactgtggcccatgtcct120

aaaaactggatatgttacaaaaataactgctaccaattttttgatgagagtaaaaactgg180

tatgagagccaggcttcttgtatgtctcaaaatgccagccttctgaaagtatacagcaaa240

gaggaccaggatttacttaaactggtgaagtcatatcattggatgggactagtacacatt300

ccaacaaatggatcttggcagtgggaagatggctccattctctcacccaacctactaaca360

ataattgaaatgcagaagggagactgtgcactctatgcctcgagctttaaaggctatata420

gaaaactgttcaactccaaatacatacatctgcatgcaaaggactgtgaccacgacgcca480

gcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgccca540

gaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgt600

gatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggtt660

atcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccattt720

atgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaa780

gaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtac840

cagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgat900

gttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaac960

cctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgag1020

attgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctc1080

agtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa1140

<210>19

<211>379

<212>prt

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>nkg2d/cd8a/4-1bb/cd3z的氨基酸序列

<400>19

metalaleuprovalthralaleuleuleuproleualaleuleuleu

151015

hisalaalaargproleupheasnglngluvalglnileproleuthr

202530

glusertyrcysglyprocysprolysasntrpilecystyrlysasn

354045

asncystyrglnphepheaspgluserlysasntrptyrglusergln

505560

alasercysmetserglnasnalaserleuleulysvaltyrserlys

65707580

gluaspglnaspleuleulysleuvallyssertyrhistrpmetgly

859095

leuvalhisileprothrasnglysertrpglntrpgluaspglyser

100105110

ileleuserproasnleuleuthrileileglumetglnlysglyasp

115120125

cysalaleutyralaserserphelysglytyrilegluasncysser

130135140

thrproasnthrtyrilecysmetglnargthrvalthrthrthrpro

145150155160

alaproargproprothrproalaprothrilealaserglnproleu

165170175

serleuargproglualacysargproalaalaglyglyalavalhis

180185190

thrargglyleuaspphealacysaspiletyriletrpalaproleu

195200205

alaglythrcysglyvalleuleuleuserleuvalilethrleutyr

210215220

cyslysargglyarglyslysleuleutyrilephelysglnprophe

225230235240

metargprovalglnthrthrglnglugluaspglycyssercysarg

245250255

pheproglugluglugluglyglycysgluleuargvallyspheser

260265270

argseralaaspalaproalatyrglnglnglyglnasnglnleutyr

275280285

asngluleuasnleuglyargarggluglutyraspvalleuasplys

290295300

argargglyargaspproglumetglyglylysproargarglysasn

305310315320

proglngluglyleutyrasngluleuglnlysasplysmetalaglu

325330335

alatyrsergluileglymetlysglygluargargargglylysgly

340345350

hisaspglyleutyrglnglyleuserthralathrlysaspthrtyr

355360365

aspalaleuhismetglnalaleuproproarg

370375

<210>20

<211>46

<212>prt

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>ncr1tm/ic的氨基酸

<400>20

metglyleualapheleuvalleuvalalaleuvaltrppheleuval

151015

gluasptrpleuserarglysargthrarggluargalaserargala

202530

serthrtrpgluglyargargargleuasnthrglnthrleu

354045

<210>21

<211>276

<212>prt

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>全长ncr2

<400>21

metalatrpargalaleuhisproleuleuleuleuleuleuleuphe

151015

proglyserglnalaglnserlysalaglnvalleuglnservalala

202530

glyglnthrleuthrvalargcysglntyrproprothrglyserleu

354045

tyrglulyslysglytrpcyslysglualaseralaleuvalcysile

505560

argleuvalthrserserlysproargthrmetalatrpthrserarg

65707580

phethriletrpaspaspproaspalaglyphephethrvalthrmet

859095

thraspleuargglugluaspserglyhistyrtrpcysargiletyr

100105110

argproseraspasnservalserlysservalargphetyrleuval

115120125

valserproalaseralaserthrglnthrsertrpthrproargasp

130135140

leuvalserserglnthrglnthrglnsercysvalproprothrala

145150155160

glyalaargglnalaprogluserproserthrileprovalproser

165170175

glnproglnasnserthrleuargproglyproalaalaproileala

180185190

leuvalprovalphecysglyleuleuvalalalysserleuvalleu

195200205

seralaleuleuvaltrptrpglyaspiletrptrplysthrmetmet

210215220

gluleuargserleuaspthrglnlysalathrcyshisleuglngln

225230235240

valthraspleuprotrpthrservalserserprovalgluargglu

245250255

ileleutyrhisthrvalalaargthrlysileseraspaspaspasp

260265270

gluhisthrleu

275

<210>22

<211>66

<212>prt

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>ncr3tm/ic结构域

<400>22

alaglythrvalleuleuleuargalaglyphetyralavalserphe

151015

leuservalalavalglyserthrvaltyrtyrglnglylyscysleu

202530

thrtrplysglyproargargglnleuproalavalvalproalapro

354045

leuproproprocysglyserseralahisleuleuproprovalpro

505560

glygly

<210>23

<211>741

<212>dna

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>nkg2d/cd16

<400>23

atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgcccgc60

cccctgttcaaccaggaagtgcagatccccctgaccgagtcctattgtggcccttgccct120

aagaattggatttgctataaaaacaactgctaccagttctttgacgagtctaagaattgg180

tatgagtcccaggcctcttgtatgagccagaacgcctctctgctgaaggtgtacagcaag240

gaggaccaggatctgctgaagctggtgaagtcctatcactggatgggcctggtgcacatc300

cccacaaacggctcttggcagtgggaggacggctccatcctgtctcctaatctgctgacc360

atcatcgagatgcagaagggcgattgcgccctgtacgccagctccttcaagggctatatc420

gagaactgcagcacacccaatacctacatctgtatgcagcggacagtgaccacaacccca480

gcacccaggccccctacacctgcaccaaccatcgcaagccagccactgtccctgaggcct540

gaggcatgtaggccagcagcaggaggagcagtgcacacacggggcctggacttcgcctgc600

gatgtgagcttttgtctggtcatggtgctgctgttcgccgtggataccggcctgtatttt660

tccgtgaagacaaatatccggtctagcaccagagactggaaggatcacaagttcaaatgg720

aggaaggacccacaggacaag741

<210>24

<211>247

<212>prt

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>nkg2d/cd16

<400>24

metalaleuprovalthralaleuleuleuproleualaleuleuleu

151015

hisalaalaargproleupheasnglngluvalglnileproleuthr

202530

glusertyrcysglyprocysprolysasntrpilecystyrlysasn

354045

asncystyrglnphepheaspgluserlysasntrptyrglusergln

505560

alasercysmetserglnasnalaserleuleulysvaltyrserlys

65707580

gluaspglnaspleuleulysleuvallyssertyrhistrpmetgly

859095

leuvalhisileprothrasnglysertrpglntrpgluaspglyser

100105110

ileleuserproasnleuleuthrileileglumetglnlysglyasp

115120125

cysalaleutyralaserserphelysglytyrilegluasncysser

130135140

thrproasnthrtyrilecysmetglnargthrvalthrthrthrpro

145150155160

alaproargproprothrproalaprothrilealaserglnproleu

165170175

serleuargproglualacysargproalaalaglyglyalavalhis

180185190

thrargglyleuaspphealacysaspvalserphecysleuvalmet

195200205

valleuleuphealavalaspthrglyleutyrpheservallysthr

210215220

asnileargserserthrargasptrplysasphislysphelystrp

225230235240

arglysaspproglnasplys

245

<210>25

<211>870

<212>dna

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>cd8/nkg2dopt/cd8a/cd16tm/ic/4-1bb

<400>25

atggctctgcccgtcaccgcactgctgctgcctctggctctgctgctgcacgccgcacga60

ccactgttcaatcaggaagtccagatccccctgacagagtcttactgcggcccatgtccc120

aagaactggatctgctacaagaacaattgttatcagttctttgacgagagcaagaactgg180

tatgagtcccaggcctcttgcatgagccagaatgcctctctgctgaaggtgtacagcaag240

gaggaccaggatctgctgaagctggtgaagtcctatcactggatgggcctggtgcacatc300

cctacaaacggctcttggcagtgggaggacggctccatcctgtctccaaatctgctgacc360

atcatcgagatgcagaagggcgattgcgccctgtacgccagctccttcaagggctatatc420

gagaactgctccacacccaatacctacatctgtatgcagaggaccgtgaccacaacccct480

gcaccacgcccccctacaccagcacctaccatcgcaagccagcctctgtccctgcggcca540

gaggcatgtagaccagcagcaggaggagcagtgcacacaagaggcctggacttcgcctgc600

gatgtgagcttttgtctggtcatggtgctgctgttcgccgtggataccggcctgtacttt660

tccgtgaagacaaatatcaggtctagcacccgcgactggaaggatcacaagtttaagtgg720

cggaaggaccctcaggataagaagcggggcagaaagaagctgctgtatatcttcaagcag780

cccttcatgcggcccgtgcagacaacccaggaggaagacggctgctcatgtagatttcct840

gaagaagaagaagggggctgtgaactgtaa870

<210>26

<211>289

<212>prt

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

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<400>26

metalaleuprovalthralaleuleuleuproleualaleuleuleu

151015

hisalaalaargproleupheasnglngluvalglnileproleuthr

202530

glusertyrcysglyprocysprolysasntrpilecystyrlysasn

354045

asncystyrglnphepheaspgluserlysasntrptyrglusergln

505560

alasercysmetserglnasnalaserleuleulysvaltyrserlys

65707580

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859095

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100105110

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130135140

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145150155160

alaproargproprothrproalaprothrilealaserglnproleu

165170175

serleuargproglualacysargproalaalaglyglyalavalhis

180185190

thrargglyleuaspphealacysaspvalserphecysleuvalmet

195200205

valleuleuphealavalaspthrglyleutyrpheservallysthr

210215220

asnileargserserthrargasptrplysasphislysphelystrp

225230235240

arglysaspproglnasplyslysargglyarglyslysleuleutyr

245250255

ilephelysglnprophemetargprovalglnthrthrglngluglu

260265270

aspglycyssercysargpheproglugluglugluglyglycysglu

275280285

leu

<210>27

<211>741

<212>dna

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>nkg2d/ncr1

<400>27

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<210>28

<211>247

<212>prt

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>nkg2d/ncr1

<400>28

metalaleuprovalthralaleuleuleuproleualaleuleuleu

151015

hisalaalaargproleupheasnglngluvalglnileproleuthr

202530

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505560

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65707580

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leuvalhisileprothrasnglysertrpglntrpgluaspglyser

100105110

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115120125

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130135140

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145150155160

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165170175

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180185190

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195200205

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210215220

argthrarggluargalaserargalaserthrtrpgluglyargarg

225230235240

argleuasnthrglnthrleu

245

<210>29

<211>801

<212>dna

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>nkg2d/ncr3

<400>29

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gaggaccaggatctgctgaagctggtgaagtcctatcactggatgggcctggtgcacatc300

cctacaaacggctcttggcagtgggaggacggctctatcctgagcccaaatctgctgacc360

atcatcgagatgcagaagggcgattgcgccctgtacgccagctccttcaagggctatatc420

gagaactgcagcacacccaatacctacatctgtatgcagcggacagtgaccacaacccca480

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gaggcatgcaggcctgcagcaggaggcgccgtgcacacaaggggcctggactttgcctgt600

gatgcaggaaccgtgctgctgctgagagcaggcttctatgccgtgtcctttctgtctgtg660

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ctgccacccgtgcccggagga801

<210>30

<211>267

<212>prt

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>nkg2d/ncr3

<400>30

metalaleuprovalthralaleuleuleuproleualaleuleuleu

151015

hisalaalaargproleupheasnglngluvalglnileproleuthr

202530

glusertyrcysglyprocysprolysasntrpilecystyrlysasn

354045

asncystyrglnphepheaspgluserlysasntrptyrglusergln

505560

alasercysmetserglnasnalaserleuleulysvaltyrserlys

65707580

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859095

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100105110

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115120125

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130135140

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145150155160

alaproargproprothrproalaprothrilealaserglnproleu

165170175

serleuargproglualacysargproalaalaglyglyalavalhis

180185190

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195200205

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210215220

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245250255

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260265

<210>31

<211>6

<212>prt

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<222>(6)..(6)

<223>n是整数，表示重复的ggggs数

<400>31

glyglyglyglyserasn

<210>32

<211>60

<212>prt

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>gs3/cd8a

<400>32

glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyserthr

151015

thrthrproalaproargproprothrproalaprothrilealaser

202530

glnproleuserleuargproglualacysargproalaalaglygly

354045

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505560

<210>33

<211>45

<212>prt

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>gs9

<400>33

glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglysergly

151015

glyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyserglygly

202530

glyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyser

354045

<210>34

<211>15

<212>prt

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>gs3

<400>34

glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyser

151015

<210>35

<211>120

<212>prt

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>2b4icr

<400>35

trpargarglysarglysglulysglnsergluthrserprolysglu

151015

pheleuthriletyrgluaspvallysaspleulysthrargargasn

202530

hisgluglngluglnthrpheproglyglyglyserthriletyrser

354045

metileglnserglnserseralaprothrserglngluproalatyr

505560

thrleutyrserleuileglnproserarglysserglyserarglys

65707580

argasnhisserproserpheasnserthriletyrgluvalilegly

859095

lysserglnprolysalaglnasnproalaargleuserarglysglu

100105110

leugluasnpheaspvaltyrser

115120

<210>36

<211>360

<212>dna

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>2b4icr

<400>36

tggaggaggaaaaggaaggagaaacagagcgagacctcccctaaggagttcctgaccatc60

tacgaggacgtgaaggacctgaagaccaggaggaaccacgagcaggaacagacctttcct120

ggcggaggcagcaccatctacagcatgatccagagccagagcagcgcccctaccagccaa180

gagcctgcctacaccctgtacagcctgatccagcccagcaggaaaagcggctccaggaag240

aggaaccacagccccagcttcaacagcaccatctatgaggtgatcggcaagagccagccc300

aaggcccagaaccctgccaggctgtccaggaaggagctggagaacttcgacgtgtacagc360

<210>37

<211>38

<212>prt

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>nkp80icr

<400>37

metglnaspgluaspglytyrmetthrleuasnvalglnserlyslys

151015

argserseralaglnthrserglnleuthrphelysasptyrserval

202530

thrleuhistrptyrlys

<210>38

<211>114

<212>dna

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>nkp80icr

<400>38

atgcaggatgaggacggctatatgaccctgaacgtccagtccaagaagaggtccagcgct60

cagaccagccagctgaccttcaaggactactccgtgaccctgcactggtacaag114

<210>39

<211>30

<212>prt

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>b2adn-末端ecd

<400>39

metglyglnproglyasnglyseralapheleuleualaproasnarg

151015

serhisalaproasphisaspvalthrglnglnargaspglu

202530

<210>40

<211>90

<212>dna

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>b2adrn-末端ecd

<400>40

atggggcaacccgggaacggcagcgccttcttgctggcacccaatagaagccatgcgccg60

gaccacgacgtcacgcagcaaagggacgag90

<210>41

<211>33

<212>prt

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>b2adrtm螺旋

<400>41

valtrpvalvalglymetglyilevalmetserleuilevalleuala

151015

ilevalpheglyasnvalleuvalilethralailealalyspheglu

202530

arg

<210>42

<211>99

<212>dna

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>b2adrtm螺旋

<400>42

gtgtgggtggtgggcatgggcatcgtcatgtctctcatcgtcctggccatcgtgtttggc60

aatgtgctggtcatcacagccattgccaagttcgagcgt99

<210>43

<211>924

<212>dna

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>nk15_1

<400>43

gccgccaccatggctctgcccgtcaccgcactgctgctgcctctggctctgctgctgcac60

gccgcacgaccactgttcaatcaggaagtccagatccccctgacagagtcttactgcggc120

ccatgtcccaagaactggatctgctacaagaacaattgttatcagttctttgacgagagc180

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gaccctcaggataagaagcggggcagaaagaagctgctgtatatcttcaagcagcccttc840

atgcggcccgtgcagacaacccaggaggaagacggctgctcatgtagatttcctgaagaa900

gaagaagggggctgtgaactgtaa924

<210>44

<211>789

<212>dna

<213>智人

<220>

<221>尚未归类的特征

<223>nk15_2

<400>44