多黏菌素B组分或其盐及其制备方法和应用与流程

本发明属于药物化学和药物分析化学领域，尤其涉及一种多黏菌素b(polymyxinb)或其盐及其制备方法和应用。

背景技术：

多黏菌素b为环脂肽类抗生素，对革兰氏阴性杆菌有强效杀菌作用。临床上主要使用硫酸多黏菌素b，其被认为是治疗多重耐药革兰阴性杆菌感染的“最后一道防线”。

由于是发酵产物，多黏菌素b是一系列结构类似的环脂肽的混合物，已知多黏菌素b的主要组分包括多黏菌素b1、b2、b3及b1-i，另外还有其它未知组分。多黏菌素b1、b2为有效成分，b3及b1-i为主要杂质，多黏菌素b1、b2、b3及b1-i的骨架结构相同，仅在取代基上有所不同。所述的多黏菌素b1的结构式见图1，其组成单元包括：n-端脂肪酰基链(6’r-甲基辛酰基)、1位l-α,γ-二氨基丁酸、2位l-苏氨酸、3位l-α,γ-二氨基丁酸、4位l-α,γ-二氨基丁酸、5位l-α,γ-二氨基丁酸、6位d-苯丙氨酸、7位l-亮氨酸、8位l-α,γ-二氨基丁酸、9位l-α,γ-二氨基丁酸、10位l-苏氨酸，以上组成单元之间依次以酰胺键连接，4位l-α,γ-二氨基丁酸与5位l-α,γ-二氨基丁酸、10位l-苏氨酸以酰胺键连接形成环7肽。

由于多黏菌素b的强效杀菌作用，对其化学成分的分离和鉴定具有十分重要的意义。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种多黏菌素b组分或其盐及其制备方法和应用。本发明从多黏菌素b中分离、鉴定出了一种新的组分，该组分具有较强的抗菌活性，有潜在的应用价值。

本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问题：

本发明提供了一种多黏菌素b组分(下文又称为2’,3’-脱氢多黏菌素b1)或其盐，所述的多黏菌素b组分包括依次连接的1位α,γ-二氨基丁酸、2位苏氨酸、3位α,γ-二氨基丁酸、4位α,γ-二氨基丁酸、5位α,γ-二氨基丁酸、6位苯丙氨酸、7位亮氨酸、8位α,γ-二氨基丁酸、9位α,γ-二氨基丁酸和10位苏氨酸；所述的10位苏氨酸与所述的4位α,γ-二氨基丁酸以酰胺键连接；所述的1位α,γ-二氨基丁酸连接6-甲基辛-2烯酰基。

所述的6-甲基辛-2烯酰基可为(r,e)-6-甲基辛-2烯酰基、(r,z)-6-甲基辛-2烯酰基、或它们中任一个的对映异构体。较佳地，所述的6-甲基辛-2烯酰基为(r,e)-6-甲基辛-2烯酰基。

在本发明一优选方案中，所述的1位α,γ-二氨基丁酸的α氨基连接6-甲基辛-2烯酰基；

和/或，所述的4位α,γ-二氨基丁酸的α位氨基与所述的3位α,γ-二氨基丁酸的羧基以酰胺键连接，所述的4位α,γ-二氨基丁酸的γ位氨基与所述的10位苏氨酸的羧基以酰胺键连接；

和/或，所述的多黏菌素b组分的盐为多黏菌素b组分的硫酸盐。

在本发明一优选方案中，所述的1位α,γ-二氨基丁酸的α氨基连接(r,e)-6-甲基辛-2烯酰基或(r,z)-6-甲基辛-2烯酰基。在本发明一优选方案中，所述的多黏菌素b组分为结构式为式(i)的化合物或其对映异构体：

在本发明一优选方案中，所述的多黏菌素b组分从多黏菌素b或其盐中分离得到。本领域公知，本发明中的多黏菌素b组分从多黏菌素b或其盐中分离得到，那么，所述的多黏菌素b或其盐中应含有多黏菌素b组分或其盐。本发明中，优选从硫酸多黏菌素b中分离得到所述的多黏菌素b组分。其中，所述的硫酸多黏菌素b优选购自上海上药第一生化药业有限公司，批号为1512802。

在本发明一优选方案中，所述的多黏菌素b组分的相对分子质量为1200.73-1200.75。

在本发明一优选方案中，所述的多黏菌素b组分从多黏菌素b或其盐采用液相制备色谱分离得到。较佳地，所述的液相制备色谱的色谱柱为十八烷基键合硅胶色谱柱。较佳地，所述的液相制备色谱的流动相为0-10％(v:v)甲酸水溶液-乙腈，甲酸水溶液的浓度不为0。较佳地，所述的液相制备色谱的流动相为0.01-10％(v:v)甲酸水溶液-乙腈。较佳地，所述的液相制备色谱的流动相为0.1％(v:v)甲酸水溶液-乙腈。较佳地，所述甲酸水溶液和乙腈的体积比为99:1-50:50。较佳地，所述甲酸水溶液和乙腈的体积比为85:15。较佳地，所述的液相制备色谱的流速为5-20ml/min，进样量50-1000μl，检测波长190-400nm。较佳地，所述的液相制备色谱的流速为15ml/min，进样量500μl，检测波长215nm。较佳地，所述液相制备色谱分离得到的各馏分通过电喷雾质谱检测并收集多黏菌素b组分。较佳地，所述的电喷雾质谱采用正离子扫描模式，扫描范围m/z：50-3200。较佳地，所述的扫描范围m/z：100-1250。

本发明还提供了一种多黏菌素b组分或其盐的制备方法，其中：

所述的多黏菌素b组分的制备方法包括下列步骤：从多黏菌素b或其盐中分离得到多黏菌素b组分，所述的多黏菌素b组分的分子式为c56h96n16o13；

所述的多黏菌素b组分的盐的制备方法包括下列步骤：将所述的多黏菌素b组分与酸进行成盐反应即可。

所述的多黏菌素b组分的盐的制备方法中，所述的酸可为本领域常规的酸，只要能与所述的多黏菌素b组分成盐即可，优选硫酸。所述的多黏菌素b组分的盐优选硫酸多黏菌素b组分。

所述的多黏菌素b组分的制备方法中，较佳地，所述的多黏菌素b组分从多黏菌素b或其盐采用液相制备色谱分离得到。较佳地，所述的液相制备色谱的色谱柱为十八烷基键合硅胶色谱柱。较佳地，所述的液相制备色谱的流动相为0-10％(v:v)甲酸水溶液-乙腈，甲酸水溶液的浓度不为0。较佳地，所述的液相制备色谱的流动相为0.01-10％(v:v)甲酸水溶液-乙腈。较佳地，所述的液相制备色谱的流动相为0.1％(v:v)甲酸水溶液-乙腈。较佳地，所述甲酸水溶液和乙腈的体积比为99:1-50:50。较佳地，所述甲酸水溶液和乙腈的体积比为85:15。较佳地，所述的液相制备色谱的流速为5-20ml/min，进样量50-1000μl，检测波长190-400nm。较佳地，所述的多黏菌素b或其盐的浓度为10mg/ml(溶剂为水和乙腈的混合物，体积比：水-乙腈＝80:20)。较佳地，所述的液相制备色谱的流速为15ml/min，进样量500μl，检测波长215nm。较佳地，所述液相制备色谱分离得到的各馏分通过电喷雾质谱检测并收集多黏菌素b组分。较佳地，所述的电喷雾质谱采用正离子扫描模式，扫描范围m/z：50-3200。较佳地，所述的扫描范围m/z：100-1250。

所述的多黏菌素b组分的制备方法中，所述的多黏菌素b组分的结构较佳地采用高效液相色谱-质谱联用方法和核磁来鉴定。较佳地，所述的高效液相色谱-质谱联用方法采用十八烷基键合硅胶色谱柱。较佳地，所述的高效液相色谱-质谱联用方法的流动相采用0-10％(v:v)三氟乙酸水溶液-乙腈，所述的三氟乙酸水溶液的浓度不为0。较佳地，所述的高效液相色谱-质谱联用方法的流动相采用0.01-10％(v:v)三氟乙酸水溶液-乙腈。较佳地，所述的高效液相色谱-质谱联用方法的流动相采用0.1％(v:v)三氟乙酸水溶液-乙腈。较佳地，所述的三氟乙酸水溶液和乙腈的体积比为99:1-50:50。较佳地，所述的三氟乙酸水溶液和乙腈的体积比为80:20。较佳地，所述的高效液相色谱-质谱联用方法的流速为0.1-2ml/min，进样量0.5-100μl，检测波长190-400nm。较佳地，所述的流速为1ml/min，进样量20μl，检测波长215nm。较佳地，所述高效液相色谱-质谱联用方法的质谱离子化方式为电喷雾离子化或大气压离子化。较佳地，所述高效液相色谱-质谱联用方法的质谱的质量分析器为四级杆飞行时间质谱、线性或三维离子肼质谱、三重四级杆质谱或轨道离子肼质谱。较佳地，所述高效液相色谱-质谱联用方法通过一级质谱及二级质谱的信息进行所述组分的结构判断。较佳地，所述的一级质谱及二级质谱的扫描范围为m/z50-2000。较佳地，所述的二级质谱碰撞能量设置范围为10-30ev。较佳地，所述的核磁的扫描频率为300-800mhz。较佳地，所述的核磁的扫描频率为500mhz。

本发明还提供了一种由上述制备方法制备得到的多黏菌素b组分或其盐。

本发明还提供了一种药物组合物，其含有上述的多黏菌素b组分或其盐。

较佳地，所述的药物组合物以注射剂或软膏剂的形式存在。

本发明还提供了一种上述多黏菌素b组分或其盐在制备抗菌药物中的应用；较佳地，所述的抗菌药物为抗革兰氏阴性菌的药物；较佳地，所述的革兰氏阴性菌为鲍曼不动杆菌(acinetobacterbaumannii)或铜绿假单胞菌(pseudomonaaeruginosa)。

本发明还提供了一种多黏菌素b组分或其盐，所述的多黏菌素b组分的分子式为c56h96n16o13，所述的多黏菌素b组分能够从多黏菌素b或其盐中分离得到。较佳地，所述的多黏菌素b组分从多黏菌素b或其盐采用液相制备色谱分离得到。其中所述的液相制备色谱分离的方法和条件均同前所述。

本发明还提供了一种多黏菌素b组分或其盐，所述的多黏菌素b组分的相对分子质量为1200.73-1200.75，所述的多黏菌素b组分能够从多黏菌素b或其盐中分离得到。较佳地，所述的多黏菌素b组分从多黏菌素b或其盐采用液相制备色谱分离得到。其中所述的液相制备色谱分离的方法和条件均同前所述。

本发明的积极进步效果在于：

(1)本发明采用高效液相色谱-质谱联用对多黏菌素b各组分的在线结构分析，通过一级质谱、二级质谱以及核磁的解析结果，首次发现了双键化多黏菌素b组分2’,3’-脱氢多黏菌素b1，对于多黏菌素b的研究具有重要意义。

(2)本发明所述的2’,3’-脱氢多黏菌素b1具有较强的抗菌活性，有潜在的应用价值，而且，对于多黏菌素b中2’,3’-脱氢多黏菌素b1的含量的检测可用来控制多黏菌素b的质量。

附图说明

图1为多黏菌素b1的结构式。

图2为2’,3’-脱氢多黏菌素b1的结构式。

图3a为多黏菌素b1的一级质谱图。

图3b为多黏菌素b1的一级质谱局部放大图。

图4为多黏菌素b1的二级质谱图。

图5a为2’,3’-脱氢多黏菌素b1的一级质谱图。

图5b为2’,3’-脱氢多黏菌素b1的一级质谱局部放大图。

图6为2’,3’-脱氢多黏菌素b1的二级质谱图。

图7为多黏菌素b1的氢谱。

图8为2’,3’-脱氢多黏菌素b1的氢谱。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

本发明中所述的“1位”、“2位”……“10位”是指氨基酸的连接顺序，与图1中数字标号对应。

本发明中所述的“α位氨基”、“γ位氨基”分别指连接在α-碳原子和γ-碳原子上的氨基。

本发明中涉及的硫酸多黏菌素b，以上海上药第一生化药业有限公司的硫酸多黏菌素b为具体实施案例，但也可适用于其他硫酸多黏菌素b对照品及制剂中，只要其能够采用本发明的分离方法分离出多黏菌素b组分即可。

以下实施例中使用的鲍曼不动杆菌atcc19606(标准菌株)为市售菌株，购自美国模式菌种收集中心(atcc)，货号：2208[81,dsm6974]。

以下实施例中使用的铜绿假单胞菌atcc27853(标准菌株)为市售菌株，购自美国模式菌种收集中心(atcc)，货号：boston41501。

实施例1

一、仪器与试药

waters自动纯化系统(沃特世科技(上海)有限公司)，冻干机(美国labconco型真空冻干机)，agilent1290型高效液相色谱仪-6550qtof-ms(美国agilenttechnologies公司)，核磁共振仪(bruker，300mhz)。

硫酸多黏菌素b(上海上药第一生化药业有限公司，批号：1512802)。

二、液相制备色谱纯化

本发明中采用waters自动纯化系统制备，硫酸多黏菌素b浓度为10mg/ml(溶剂为水和乙腈的混合物，体积比：水-乙腈＝80:20)，c18色谱柱(19×100mm，5μm)，流动相：0.1vol％甲酸水溶液-乙腈(85:15，v:v)，流速为15ml/min，进样量500μl，检测波长215nm，液相制备色谱分离得到的各馏分通过电喷雾质谱检测并收集多黏菌素b组分，电喷雾质谱采用正离子扫描模式，单四级杆质量分析器，扫描范围m/z：100-1250，锥孔电压：35v。收集多黏菌素b组分(m/z601.4，[m+2h]²⁺)及多黏菌素b1(m/z602.2，[m+2h]²⁺)的馏分。收集200次，分别合并以上两种馏分，经旋转蒸发仪去除溶剂，各加约3-4ml水转移至玻璃瓶中，放入冻干机中冷冻干燥。冻干机冷肼温度设置为-80℃，真空度设置为0mbar，经24h后，瓶中出现白色片状蓬松状固体，停止冷冻干燥。

三、多黏菌素b1及多黏菌素b组分的质谱数据

各称量约2mg的纯化组分：多黏菌素b1及所述多黏菌素b组分分别加1ml溶剂(水与乙腈的体积比为80:20)溶解后，经高效液相色谱-电喷雾离子化-四级杆飞行时间质谱进行结构鉴定。分析条件如下：c18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流动相采用0.1vol％三氟乙酸水溶液-乙腈(80:20，v:v)，流速为1ml/min，进样量20μl，检测波长215nm，柱温为50℃；以正离子扫描模式采集一级质谱图和二级质谱图，进样量为5μl，采集范围m/z50-1700，二级质谱碰撞能量为10-30ev。

多黏菌素b1的一级质谱图见附图3a和图3b，其准分子离子峰[m+h]⁺的m/z为1203.7614，[m+na]⁺的m/z为1225.7429。在溶液状态或是在电喷雾过程中，多黏菌素b1容易加和两个h⁺而主要以[m+2h]²⁺(m/z，602.3848)存在。以[m+2h]²+为母离子，调整碎裂电压得到多黏菌素b1的二级质谱图，见附图4所示，通过特征离子m/z963.5745,863.5117,762.4638,662.3994,482.2919,361.2243,241.1925及101.0719，可以推断出多黏菌素b1的氨基酸连接次序。将以上特征离子与所述多黏菌素b组分的特征离子进行比对，分析结构差异。

所述多黏菌素b组分的一级质谱图见附图5a和图5b，其准分子离子峰[m+h]⁺的m/z为1201.7451，[m+na]⁺的m/z为1223.7271，加和两个质子后的[m+2h]²⁺为m/z601.3771。以[m+2h]²+为母离子，调整碎裂电压得到多黏菌素b组分的二级质谱图，见附图6所示，特征离子为m/z963.5742,863.5102,762.4628,662.3985,482.2913,361.2237,239.1761及101.0714。通过一级质谱及二级质谱的信息进行所述组分的结构判断，与多黏菌素b1相比，m/z239.1761比m/z241.1925小2，推断出发生双键化的位置在n-端脂肪酰基链上，因此，所述多黏菌素b组分为2’,3’-脱氢多黏菌素b1。

通过所述质谱数据，证明所述的2’,3’-脱氢多黏菌素b1包括依次连接的1位α,γ-二氨基丁酸、2位苏氨酸、3位α,γ-二氨基丁酸、4位α,γ-二氨基丁酸、5位α,γ-二氨基丁酸、6位苯丙氨酸、7位亮氨酸、8位α,γ-二氨基丁酸、9位α,γ-二氨基丁酸和10位苏氨酸；所述的10位苏氨酸与所述的4位α,γ-二氨基丁酸以酰胺键连接；所述的1位α,γ-二氨基丁酸连接6-甲基辛-2烯酰基。所述的多黏菌素b组分的分子式为c56h96n16o13。

依据已有药典及文献数据(参见欧洲药典9.7版，polymyxinbsulfate，page：6668-6669；orwaja,etal，jchromatogra,2001,912(2):369-373；govaertsc,etal,jpeptidesci,2002,8(2):45-55)，判断1位α,γ-二氨基丁酸的α位氨基连接(r,e)-6-甲基辛-2烯酰基、(r,z)-6-甲基辛-2烯酰基、或它们中任一个的对映异构体，1位α,γ-二氨基丁酸的羧基连接2位苏氨酸的氨基、2位苏氨酸的羧基连接3位α,γ-二氨基丁酸的α位氨基、3位α,γ-二氨基丁酸的羧基连接4位α,γ-二氨基丁酸的α位氨基，4位α,γ-二氨基丁酸的羧基连接5位α,γ-二氨基丁酸的α位氨基，5位α,γ-二氨基丁酸的羧基连接6位苯丙氨酸的氨基，6位苯丙氨酸的羧基连接7位亮氨酸的氨基，7位亮氨酸的羧基连接8位α,γ-二氨基丁酸的α位氨基，8位α,γ-二氨基丁酸的羧基连接9位α,γ-二氨基丁酸的α位氨基，9位α,γ-二氨基丁酸的羧基连接10位苏氨酸的氨基。所述的4位α,γ-二氨基丁酸的γ位氨基与所述的10位苏氨酸的羧基以酰胺键连接形成环7肽。

四、多黏菌素b1及2’,3’-脱氢多黏菌素b1的核磁数据

各称量约2mg的纯化组分：多黏菌素b1及2’,3’-脱氢多黏菌素b1加氘水溶解后，转移至核磁管中，经核磁共振仪扫描氢谱。多黏菌素b1的氢谱见附图7所示，2’,3’-脱氢多黏菌素b1的氢谱见附图8所示，对比两者的氢谱，差别主要在化学位移6-7之间。化学位移6.05(d,j＝15.4hz,1h)及6.91(dt,j＝15.4,7.6hz,1h)为双键(2^’氢与3^’氢)的特征峰，且由于顺式双键的耦合常数大概在10.9左右，从2’,3’-脱氢多黏菌素b1的耦合常数j＝15.4hz推断为反式双键。由于与羰基形成共轭双键氢的化学位移才会移向6-7，如果单独双键则化学位移在5-6范围内，因此，从较低场的化学位移判断双键与羰基形成共轭结构。

依据上述药典及文献数据，判断出该组分的手性碳构型，所述的多黏菌素b组分的结构如图2所示。

五、多黏菌素b1及2’,3’-脱氢多黏菌素b1的抗菌活性

根据临床和实验室标准协会(clinical&laboratorystandardsinstitute，clsi)规定，采用微量肉汤稀释法测定多黏菌素b1(pmb1)与2’,3’-脱氢多黏菌素b1对鲍曼不动杆菌的最低抑菌浓度(mic，minimalinhibitoryconcentration)。多黏菌素b1为对照药，在96孔板中接种鲍曼不动杆菌atcc19606(标准菌株)10⁶cfu/ml的细菌，并加入多黏菌素b1或2’,3’-脱氢多黏菌素b1的溶液，使溶液终浓度分别为0.125、0.25、0.5、1、2、4、8mg/l，并于35±2℃下培养18～24小时后观测浊度，以溶液澄清的最低浓度为mic。结果如下表1：

表1多黏菌素b1与2’,3’-脱氢多黏菌素b1对鲍曼不动杆菌的mic

结果显示，2’,3’-脱氢多黏菌素b1对鲍曼不动杆菌标准菌株atcc19606具有抗菌活性，2’,3’-脱氢多黏菌素b1的mic较pmb1低一个稀释度，抗菌活性好(该方法误差允许范围为1个稀释度)。

根据clsi规定，采用微量肉汤稀释法测定多黏菌素b1与2’,3’-脱氢多黏菌素b1对铜绿假单胞菌的mic。多黏菌素b1为对照药，在96孔板中接种铜绿假单胞菌atcc27853(标准菌株)10⁶cfu/ml的细菌，并加入多黏菌素b1或2’,3’-脱氢多黏菌素b1的溶液，使溶液终浓度分别为0.125、0.25、0.5、1、2、4、8mg/l，并于35±2℃下培养18～24小时后观测浊度，以溶液澄清的最低浓度为mic。结果如下表2：

表2多黏菌素b1与多黏菌素bx对鲍曼不动杆菌的mic

结果显示，2’,3’-脱氢多黏菌素b1对铜绿假单胞菌标准菌株atcc27853具有抗菌活性，两化合物的mic相同，2’,3’-脱氢多黏菌素b1抗菌活性与多黏菌素b1相当。

综上所述，本发明中发现了新的多黏菌素b组分，即2’,3’-脱氢多黏菌素b1，通过液相制备色谱、高效液相色谱-质谱联用及核磁技术等方法确证其结构。这种新型的双键化组分具有优异的抗菌活性及生物活性，具有潜在的应用前景。

有必要在此指出的是：以上实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。