一种鼻粘膜类器官培养基及培养方法与流程

本发明涉及类器官培养领域，进一步涉及鼻粘膜类器官培养领域，特别涉及一种鼻粘膜类器官培养基及培养方法。

背景技术：

类器官(organoids)是衍生于干细胞或前体细胞的器官特异性细胞集合。体外培养的类器官在细胞成分和组织架构上与对应器官高度相似，并具备相应的功能学特征。类器官培养是对常规细胞生物学技术的重大改革。与常规细跑培养在二维环境中培养单一细胞类群不同，类器官培养是在三维环境中培养出特定组织器官包含的多种细胞类群，其培养体系与体内微环境更为相似。因此，在各种器官生理病理的基础研究、精准医疗、药物筛选和开发、基因治疗、再生医学等方面，显示出巨大的应用前景。

多种鼻腔鼻窦疾病与鼻粘膜功能密切相关，利用鼻粘膜上皮细胞体外培养作为疾病模型，可开展粘膜修复损伤、干细胞、纤毛功能等研究。有文献报道利用呼吸道粘膜3d培养体系培养支气管和肺泡上皮类器官，诱导下呼吸道上皮中成体干细胞分化增殖，形成3d上皮细胞团，但这种呼吸道粘膜类器官在全液体环境生长，与人体内呼吸道粘膜气液界面生长的理化环境差距较大，无法形成完整假复层柱状纤毛上皮结构。此外，由于组织特征的差异，下呼吸道粘膜类器官也难以应用于鼻粘膜研究。一些实验室采用二维(2d)气液界面培养法建立鼻粘膜上皮体外模型，但只能体外培养单层鼻粘膜上皮细胞，同样缺乏分化和组织结构，无法模拟人体鼻粘膜组织形态和生理功能。因此，我们提出了全新的气液界面鼻粘膜3d类器官培养体系。

鼻粘膜体外模型对于鼻粘膜细胞组织结构、功能以及鼻腔鼻窦疾病研究具有重要意义。虽然多种人源组织使用不同的方法、不同的培养条件下可在体外成功培养成功原代细胞或者类器官，但是目前暂无关于基于气液界面法的鼻粘膜组织类器官的培养方法的研究及报道，尤其是具体的试验流程、操作步骤、培养条件、即培养基配方尚无尝试及报道。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种用于鼻粘膜类器官的培养基和培养方法。该方法培养可操作性和重复性好，所用培养基配方价格适中。

本发明采用的技术方案如下：

一种鼻粘膜类器官的培养基，培养基的成分如下：不含vit-a的b27、n-acetylcysteine、egf、noggin、r-spondin1、wnt3a、a83-01、nicotinamide、y-27632、glutamax、gastrin、sb202190、青霉素链霉素混合液、wnt7a、il-6、hepes的一种或多种。

进一步地，培养基的成分及其含量如下：不含vit-a的b27，1-5x；n-acetylcysteine，0.2-5mm；egf，10-250ng/ml；noggin，20-500ng/ml；r-spondin1，50-1000ng/ml；wnt3a，50-1000ng/ml；a83-01，100-2500nm；nicotinamide，2-50mm；y-27632，2-50μm；glutamax，1-5x；gastrin，1-25nm；sb202190，2-50μm；青霉素链霉素混合液，1-5x；wnt7a，2-50ng/ml；il-6，10-250ng/ml；hepes，0.2-5mm。

进一步地，培养基的成分及其含量如下：不含vit-a的b27，1x；n-acetylcysteine，1mm；egf，50ng/ml；noggin，100ng/ml；r-spondin1，250ng/ml；wnt3a，250ng/ml；a83-01，500nm；nicotinamide，10mm；y-27632，10μm；glutamax，1x；gastrin，5nm；sb202190，10μm；青霉素链霉素混合液，1x；wnt7a，10ng/ml；il-6，50ng/ml；hepes，1mm。

本发明还公开了一种鼻粘膜类器官培养方法，具体步骤为：将来源于鼻甲、鼻中隔、鼻底、嗅区、鼻窦、鼻咽部等不同部位的鼻粘膜组织，预处理得到细胞沉淀，将细胞沉淀加入至含有混合胶原溶液的transwell小室内皿中，凝固成凝胶；在transwell小室外皿中加入上述的培养基，恒温培养。

进一步的，预处理步骤包括洗涤、切碎、消化、裂解步骤。

进一步的，预处理步骤具体为：鼻粘膜组织采用含2％双抗的hanks液洗涤后，将组织切碎；加入消化酶i消化，离心弃上清，再加入消化酶ii消化，离心弃上清，hanks液吹打重悬消化的组织沉淀，过滤得到含有鼻粘膜单细胞的滤液，离心弃上清，加红细胞裂解液裂解，离心弃上清得细胞沉淀。

进一步的，消化酶i包括collagenasetypeiii、透明质酸酶、insulin和egf；消化酶ii包括trypleexpress和dnasei酶。

进一步的，混合胶原溶液的配制方法如下：a.胶原基质(鼠尾i型胶原蛋白)，b.1x浓缩无菌培养基(dmem)，c.advanceddmem/f12，d.无菌naoh溶液(1mol/l)；先将100μlb与1mlc混合，再加入875μla，最后加入15μld，得到混合胶原溶液。

进一步的，还包括更换培养基步骤：每间隔2-3天更换一次培养基，更换的培养基同权利要求1-3任一项的培养基，优选为条件培养基。

进一步的，还包括传代步骤：将内皿中含有细胞的混合胶原转移至15ml离心管，加入100unit/ml胶原酶iv在37℃下解离15-20分钟，每30天对类器官进行1:2传代。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明首次将上皮和间充质/基质成分都整合到了基于气液界面法的类器官培养系统中，将来源于鼻甲、鼻中隔、鼻底、嗅区、鼻窦、鼻咽部等不同部位的鼻粘膜组织，通过诱导新鲜鼻粘膜上皮组织中的成体干细胞的增殖和分化，能够获得包括纤毛细胞、杯状细胞、棒状细胞和基底细胞等多种细胞组成的，接近体内粘膜结构和功能的类器官，成为具有增殖和多谱系分化能力的鼻粘膜体外模型。

2.该系统可以使原代鼻粘膜上皮持续增殖分化超过30天，表明在微环境内成功复制了干细胞的生态位，可用于粘膜干细胞，纤毛功能，分泌功能以及鼻部肿瘤、遗传性、变应性、感染性疾病的理想研究模型。

3.本发明的鼻粘膜组织的类器官培养与鉴定方法操纵流程简单便捷，成功率高，鉴定结果可信度高，技术稳定，可重复性高。实验成本低于现有技术。

附图说明

图1.气液界面培养法示意图

图2.基质胶胶滴法培养中的鼻粘膜类器官

图3.气液界面法培养的鼻粘膜类器官及组织切片he染色照片

图4.气液界面法培养出的鼻粘膜类器官动纤毛扫描电镜图

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换，均落入本发明保护范围。

材料说明：

dmem:购自gibco公司，4℃保存，dmem是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在mem培养的基础上研制的。与mem比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型(低于4500mg/l)和低糖型(低于1000mg/l)。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。该类培养基广泛应用于疫苗生产和各种初代病毒宿主细胞的细胞培养及单一细胞培养。正常卵巢组织短途运输用dmem4度低温保存。

advanceddmem/f12：购自gibco公司，4℃保存，改良的dmem/f-12(dulbecco改良的eagle培养基/ham的f-12)是一种广泛使用的无血清配方的基础培养基。与经典dmem/f-12相比，血清添加量可减少50–90％，而生长速率或形态没有变化。与其他培养基不同，添加了以下成分以最大程度减少血清：乙醇胺，谷胱甘肽，抗坏血酸，胰岛素，转铁蛋白，用于细胞培养的富含脂质的牛血清白蛋白，以及微量元素亚硒酸钠，偏钒酸铵，硫酸铜和氯化锰。改良的dmem/f-12还补充有和4mml-谷氨酰胺或glutamaxtm补充剂。

鼠尾i型胶原蛋白：购自corning公司，2-8℃保存，系采用birkedal-hansen方法在无菌下制备，纯度达到95％以上，可溶于0.006mol/l乙酸。可在组织培养表面上用作薄层以增强细胞附着和增殖，或用作凝胶来促进细胞立体形态和功能的表达。

naoh：购自sigma公司，用于配制混合胶原溶液。

b27(不含vit-a)：购自gibco公司,即b27补充剂，为无血清添加剂，用于海马神经元和其他中枢神经系统(cns)神经元的生长和保持其短期或长期活性。无维生素a型添加剂是定制的添加剂，维生素a(视黄醇)能被转化成视黄酸，后者可以诱导干细胞向神经细胞的分化。不含维生素a的配方是干细胞培养的理想选择。

wnt3a：wnt信号通路激动剂，购自peprotech公司。

n-acetylcysteine:购自sigma公司,n-乙酰半胱氨酸。

egf：购自r&d公司，表皮生长因子。

noggin：购自peprotech公司，细胞生长蛋白成分。

r-sponding1:购自r&dsystems公司，wnt信号通路激活因子。

a83-01：购买自tocrisbioscience。

nicotinamide：购自sigma公司，烟酰胺。

y-27632dihydrochloride：购自abmolebioscience，rock特异性通路阻断剂。

wnt7a：购自peprotech公司,wnt7a经典通路激活能够加强气道上皮细胞增殖。

il-6：购自peprotech公司，促进纤毛细胞分化。

glutamax：谷氨酰胺，购自gibco公司。

sb202190：购自sigma-aldrich公司，小分子抑制剂。

hepes：购自invitrogen公司，是一种弱酸，主要作用是防止培养基ph迅速变动。

青霉素-链霉素100x溶液：购自gibco公司，主要作用是防止细菌污染。

collagenasetypeiv胶原酶：购自stemcell公司，用于溶解i型胶原。

实施例1

一种鼻粘膜类器官培养基，其成分及其含量如下：不含vit-a的b27，1x；n-acetylcysteine，0.2mm；egf，10ng/ml；noggin，20ng/ml；r-spondin1，50ng/ml；wnt3a，50ng/ml；a83-01，100nm；nicotinamide，2mm；y-27632，2μm；glutamax，1x；gastrin，1nm；sb202190，2μm；青霉素链霉素混合液，1x；wnt7a，2ng/ml；il-6，10ng/ml；hepes，0.2mm。

实施例2

一种鼻粘膜类器官培养基，其成分及其含量如下：不含vit-a的b27，5x；n-acetylcysteine，5mm；egf，250ng/ml；noggin，500ng/ml；r-spondin1，1000ng/ml；wnt3a，1000ng/ml；a83-01，2500nm；nicotinamide，50mm；y-27632，50μm；glutamax，5x；gastrin，25nm；sb202190，50μm；青霉素链霉素混合液，5x；wnt7a，50ng/ml；il-6，250ng/ml；hepes，5mm。

实施例3

一种鼻粘膜类器官培养基，其成分及其含量如下：不含vit-a的b27，1x；n-acetylcysteine，1mm；egf，50ng/ml；noggin，100ng/ml；r-spondin1，250ng/ml；wnt3a，250ng/ml；a83-01，500nm；nicotinamide，10mm；y-27632，10μm；glutamax，1x；gastrin，5nm；sb202190，10μm；青霉素链霉素混合液，1x；wnt7a，10ng/ml；il-6，50ng/ml；hepes，1mm。

实施例4

一种鼻粘膜类器官培养方法，具体步骤为：

(1)配胶：

a.胶原基质(鼠尾i型胶原蛋白)，b.1x浓缩无菌培养基(dmem)，c.advanceddmem/f12，d.无菌naoh溶液(1mol/l)；

先将100μlb与1mlc混合，再加入875μla，最后加入15μld，得到混合胶原溶液，于4℃保存；将1ml混合胶原溶液倒入transwell小室里的30mm直径的内皿中，在37℃培养箱中固化30分钟，备用。

(2)将鼻粘膜装入准备好的含有5％双抗的无血清的ham’sf12溶液中保存，3小时内送入实验室预处理。

(3)将新鲜的鼻粘膜组织放于已加入3-5ml含2％双抗的hanks液的15ml离心管中，振荡洗涤(共洗涤4次)。

(4)将洗涤过后的组织块移至6cm培养皿中，用已消毒的镊子将软骨剔除，皿里加入适量hbss溶液。

(5)用持针器夹取已消毒的刀片在冰上操作将组织切碎至大小0-5mm³，切碎过程不应超过10分钟以避免细胞损坏和组织干燥。

(6)将培养皿中切碎的组织块转移至15ml离心管中，消化酶i(collagenasetypeiii(iii型胶原酶)、透明质酸酶、insulin、egf)加至3ml。37℃恒温摇床消化2小时左右，每隔30分钟将离心管取出，在生物安全柜中用移液枪吹打消化的组织5次左右。吹打结束继续放入37℃恒温摇床中。

(7)第一次消化结束后，离心管1100r离心5min。

(8)离心结束弃上清，加3ml消化酶ii(trypleexpress、dnasei酶)吹打重悬，将离心管放入37℃恒温摇床消化8min。

(9)加入2mlhbss液终止消化。

(10)将离心管放入离心机内，1100r离心5min。

(11)离心结束弃上清，再加2mlhanks液吹打重悬消化的组织沉淀。

(12)用100μm滤网过滤组织混合液，得到含有鼻粘膜单细胞的滤液，将滤液转入15ml离心管中，1100r离心3min，得到单细胞沉淀。

(13)离心结束弃上清，加2ml红细胞裂解液，裂解5min后加入2mlhbss终止，最后1100r离心3min，弃上清得细胞沉淀。

(14)用1ml预冷的混合胶原溶液重悬细胞并转入上述步骤1中已预铺有混合胶原溶液的内皿中。

(15)盖上外盖后，内皿的混合胶在30分钟内在37℃培养箱中凝固成凝胶。

(16)在transwell小室外皿中加入1.5ml实施例3的培养基，镜下观察，拍照，放入37℃恒温孵箱，细胞不与培养基直接接触。

(17)每间隔2-3天更换一次培养基，培养出鼻粘膜类器官；更换的培养基同步骤(16)中的细胞培养基，优选为条件培养基。

(18)传代：将内皿中含有细胞的混合胶原(已固定)转移至15ml离心管，加入100unit/ml胶原酶iv在37℃下解离15-20分钟，每30天对类器官进行1:2传代。

对照例1

对比普通原代培养方法

传统的基于气液界面的组织原代培养方法，采用普通的培养基(dmem+10％fbs)2d条件下培养的分散的鼻粘膜细胞，37℃，5％co2细胞培养箱培养。每间隔2-3天更换一次培养基，结果4周后发现鼻粘膜细胞贴壁效果不佳，生长缓慢，逐渐凋亡。此外原代细胞很难传代、冻存与复苏。

对照例2

对比hansclever提出的基质胶胶滴培养方法

采用同一类器官特有的培养基，37℃，5％co2细胞培养箱3d条件下培养，每间隔2-3天更换一次培养基。通过胶滴法与ali法培养的类器官电镜结果对比发现，ali法成功率更高，更利于纤毛的增殖与分化。

本发明的鼻粘膜组织的培养基及培养方法针对于不同解剖部位的鼻粘膜组织来源细胞的增殖分化及其生理功能特点，设计了最佳的实验操作流程，优选出最佳的培养基。经过调和的培养基中细胞因子，信号通路调控因子含量适宜，鼻粘膜细胞能够成功稳定的在3d环境中形成鼻粘膜类器官。本发明的3d培养体系的主要特征是能够通过体外三维(3dimensional,3d)培养成体干细胞，自我更新自我组织形成具有类似于鼻粘膜上皮组织形态结构及功能的细胞团，以诱导与基质成纤维细胞相互作用的适当极性的上皮细胞的形成。这种方法可用于更好地研究细胞与细胞之间以及上皮-间充质之间相互作用的信号传导作用、纤毛功能异常与慢性鼻窦炎的互相作用、药物转运途径和吸收机制等，满足诸多科学研究的需要。此外，本发明培养方法流程也可用于其他上皮组织类器官的培养(如下呼吸道及消化道粘膜)，形成一个标准规范化上皮类器官培养体系。同时本发明的培养基可以完成鼻粘膜组织的传代培养，达到大规模复制鼻粘膜类器官的需求，控制培养得到的类器官具有高度的一致性。

以上所述仅为本发明的优选实施例，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的相关技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，其中所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。