一种免疫增强剂及其在疫苗制备中的应用的制作方法

技术领域：
：本发明属于生物领域，具体涉及一种免疫增强剂及其在疫苗制备中的应用，可以用于猪繁殖与呼吸综合征的治疗药物的开发。
背景技术：
：：疫苗主要可分为减毒活疫苗，灭活疫苗以及通过基因工程技术表达的蛋白亚单位疫苗。在以上的三种类型疫苗中，灭活疫苗及蛋白亚单位疫苗安全性最高，但由于免疫进入机体后无法增殖，因此难以有效刺激宿主免疫系统，往往需要多次免疫，并且刺激机体所产生的免疫反应主要以体液免疫应答为主（抗体），难以刺激机体产生细胞免疫应答（杀伤性t细胞，ctl），因此对于一些病毒性传染病，灭活疫苗或亚单位疫苗保护效果存在缺陷。igm为机体在感染时产生的第一种抗体类型，与其他类型的抗体不同，igm为五聚体结构，因此具有独特的生物学活性。igm可以结合补体c1通过经典途径来激活补体反应，刺激局部的天然免疫应答，同时igm可以通过其恒定区（fc）结合抗原提呈细胞（apc）表面的fc受体，来促进apc的抗原加工提呈能力，促进适应性免疫应答（体液免疫应答，细胞免疫应答）的启动。而我们认为，通过使用特异性识别抗原的igm与抗原结合成为“igm-抗原”复合物来免疫动物，可以增强机体免疫系统对于抗原的适应性免疫应答。猪繁殖与呼吸综合征（porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，prrs）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，prrsv）引起的以母猪流产和仔猪呼吸障碍为主要特征的病毒性传染病，并能引起严重的免疫抑制。该病毒已在全球猪群中广泛传播，给世界养猪业造成了巨大的经济损失，已成为全球规模化猪场的主要疫病之一，也是全球猪病控制上的一大难题。现有的prrsv的防控主要依靠减毒活疫苗和灭活疫苗，现有的证据显示减毒活疫苗的在生产实践中尽快可诱导机体产生免疫保护，但被免疫动物排毒（疫苗毒株），在免疫猪群中长期存在，毒力返祖以及与野生流行毒株重组等缺点。另一方面，尽管灭活疫苗安全性较好，但由于灭活疫苗免疫动物后刺激适应性免疫应答较弱，因此难以形成有效保护，市场接受度不高。技术实现要素：：为了解决现有prrsv灭活疫苗存在的问题，本发明鉴定出一株prrsv广谱中和抗体5d9，对于prrsv-i型和prrsv-ii型病毒均具有较高的中和活性，进一步将其制备成免疫增强剂，用于prrsv疫苗的制备，所述广谱中和抗体5d9与灭活prrsv病毒进行结合形成“igm-灭活病毒”免疫复合物，所述“igm-灭活病毒”复合物型疫苗对于疫苗诱导的细胞免疫应答的提升作用。为解决以上技术问题，本发明采用如下技术手段;一种免疫增强剂，所述免疫增强剂包含prrsv广谱中和抗体5d9，所述prrsv广谱中和单克隆抗体5d9包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于：所述重链可变区的氨基酸序列如seqidno：1所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如seqidno：2所示。所述prrsv广谱中和单克隆抗体5d9的编码dna，包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于：所述重链可变区的编码dna序列如seqidno：3所示；所述轻链可变区的编码dna序列如seqidno：4所示。所述单克隆抗体5d9为igm亚型。本发明还请求保护所述免疫增强剂在制备prrsv疫苗中的应用。所述疫苗为prrsv灭活疫苗或或亚单位疫苗。本发明还请求保护一种免疫复合物，其是由广谱中和抗体5d9与灭活prrsv病毒进行结合形成“igm-灭活病毒”免疫复合物。本发明还请求保护所述免疫复合物的制备方法，其特征在于，其是将prrsv-sd16病毒粒子灭活后与单克隆抗体5d9（以质量计算）按照1:5-10的比例混合，37℃放置2小时形成复合物。本发明还请求保护一种prrsv灭活疫苗，所述灭活疫苗包含所述免疫复合物和佐剂。优选的，所述佐剂为油包水佐剂，更优选为montanide™isa206。基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：本发明采用prrsv病毒液-sd16作为免疫原，免疫balb/c小鼠。经细胞融合，病毒感染marc145细胞筛选克隆，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系，获得鼠单克隆抗体5d9。用elisa技术测定该单克隆抗体5d9的亚型为igm型单克隆抗体。prrsv-i型和prrsv-ii型病毒感染marc145细胞，利用ifa技术用该单克隆抗体进行检测，证明单克隆抗体5d9对prrsv-i和prrsv-ii型病毒具有广谱反应性。随后用其进行病毒中和实验，利用westernblot技术和qpcr技术证明该单克隆抗体对prrsv-i和prrsv-ii型病毒都具有中和活性，可阻止病毒入侵，保护机体免受感染。试验表明，当“igm-灭活病毒”免疫复合物与佐剂联合免疫小鼠时，ifn-γ分泌t细胞显著升高（增加2倍），提示在灭活病毒免疫过程中，prrsv特异性igm-5d9与正常的水包油佐剂联合免疫可增强ctl反应。动物试验表明，本发明制备的“igm-灭活病毒”免疫复合物的免疫保护率相比仅采用商业化佐剂isa206制备得到的疫苗以及商品化的弱毒疫苗能够达到更高的保护效力。附图说明：图1：单克隆抗体5d9病毒中和实验结果图：图1-a为westernblot检测结果，其中sd16表示prrsv-sd16病毒；isotypecontrol为同型对照组，即未感染prrsv的小鼠igm；n表示基于prrsv-n蛋白检测表征的病毒繁殖水平；α-tublin为α微管蛋白，作为westernblot内参。图1-b为基于荧光定量pcr检测prrsv-n基因mrna表达水平的检测结果。图2：单克隆抗体5d9广谱反应活性测定结果图。图3：单克隆抗体5d9广谱中和活性测定结果图。图4：免疫流程图。图5：小鼠抗体水平检测图。图6：流式细胞仪分选图谱。具体实施方式：下面列出具体实施方案对本发明做进一步阐述，以使本领域技术人员可以更清楚得得知本发明的技术方案，并非对本发明的限制。实施例1：单克隆抗体5d9的制备和鉴定1.1杂交瘤细胞系的建立将prrsv病毒sd16（由西北农林动物医学院免疫生物学实验室提供）作为免疫原，用弗氏完全佐剂（sigma公司）1:1混合乳化，免疫6周龄雌性balb/c小鼠（由西安交通大学提供），腹部皮下注射，剂量为（3×10^7pfu/只），每14天加强免疫一次。第三次免疫后7天尾静脉采血用ifa检测小鼠血清中抗免疫原的抗体效价，效价最好的的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，免疫原用生理盐水1:1混匀，剂量为（3×10^7pfu/只）。1.2细胞融合（1）无菌获取免疫后小鼠的脾细胞，以扩大培养好的小鼠骨髓瘤细胞（sp2/0）,两者比例5:1，将50ml离心管中脾细胞悬液和瘤细胞悬液1000rpm离心10min。（2）离心后分别弃尽上清，各添加10ml不完全1640培养基，用吸管重新悬浮细胞，用吸管将10ml脾细胞悬液添加到10ml瘤细胞悬液中，充分混匀。1000rpm离心10min。离心完成后，弃上清，用手指轻轻弹击离心管底部，使细胞松散呈糊状，散在管底壁上。（3）准备37℃水浴烧杯，将离心管置于烧杯中，右手用吸管吸取1mlpeg1500（roche公司），沿离心管壁，尽量接近细胞处缓缓加入peg，右手始终不停均匀转动离心管，时间控制在60s。（4）轻轻摇晃，缓缓添加15ml培养基，终止融合，充分混匀，在水浴中静置5min。700rpm离心8min弃上清，添加hat培养基10ml，补加hat培养基至所需的量。用吸管将细胞悬液滴加在含有饲养细胞的96孔板中，每孔添加1滴，大约200μl每孔。添加完毕后，将96孔板置于37℃，5%co2温箱中培养。1.3挑克隆融合后七天，显微镜下观察，选取已经出现大小适中的细胞团的孔，细胞量大约占孔1/2。检测前一天将marc145铺板并感染prrsv病毒，取融合成功孔的上清进行ifa试验检测筛选，阳性孔进行亚克隆筛选，并转入24孔板扩大培养并冻存，至到筛选出阳性的杂交瘤细胞。1.4杂交瘤上清培养法大量制备单克隆抗体用rpmi-1640培养基（gbico公司）大量培养筛选得的杂交瘤细胞，培养24h后取上清室温3000g离心10min去除其中细胞碎片。1.5单克隆抗体的纯化（1）将离心去除完细胞碎片的上清与饱和硫酸铵等量混合，在4℃下沉淀30min。（2）沉淀完成后，4℃下2500rpm离心30min，弃上清取沉淀，用20mm，ph8.0的tris-hcl重悬，透析过夜。（3）透析完后，2500rpm离心10min，弃上清。所得沉淀用pbs重悬。平衡好proteinlresin后，向柱中缓慢加入最终得到的重悬液样品，用pbs洗涤填料去除杂蛋白，直至洗涤液od280值至0.01。（4）向proteinlresin层析柱中加入甘氨酸洗脱目的蛋白，并立刻用1mtris-hcl（ph8.0）按适中比例中和洗脱液至ph7-8。最后将所得样品再次透析至pbs，4℃8h，重复3次，收集样品，即得到该发明所得的单克隆抗体5d9。1.6单克隆抗体的亚型鉴定和测序（1）亚型鉴定：用亚型测定试剂盒（sigma公司）进行测定，测得其亚型为igm。（2）单克隆抗体可变区序列测定：1.6.1总rna提取：取10^6个细胞，trizol裂解，加入氯仿分层获取rna，异丙醇沉淀后用乙醇洗涤，干燥，用depc水溶解rna。1.6.3反转录pcr：取500ngrna，加入oligo（dt）,random,dntp及5×rtbuffer，反转录酶（takara公司），37℃25min，85℃5sec，4℃终止反应获得cdna,之后进行pcr扩增。1.6.3将扩增得到的重链和轻链可变区克隆至pmd18-t，送至公司测序，使用imgt/v-quest数据库进行数据比对分析。经测序，所述重链可变区的编码dna序列如seqidno：3所示；所述轻链可变区的编码dna序列如seqidno：4所示。根据密码子编码规则，可知：所述重链可变区的氨基酸序列如seqidno：1所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如seqidno：2所示。实施例2：单克隆抗体5d9的中和活性测定2.1中和活性测定利用该单克隆抗体5d9进行病毒中和实验，以检测其中和活性。用pam细胞铺至24孔板，分别接入0.01moi不同型的prrsvsd16病毒，每种病毒分别和100μg/ml，200μg/ml，300μg/ml，400μg/ml的抗体，37℃孵育1h之后换液，36h后进行westernblot和qpcr检测，确定其具有中和活性。具体结果参见图1。基于图1的结果可知，使用prrsv在宿主体内的天然靶细胞肺泡巨噬细胞（pams）在体外培养，使用纯化的单克隆抗体5d9按照0.05,0.1,0.2,0.4μm/ml（微摩尔每毫升）浓度与0.01mprrsv-sd16病毒在37℃培养1小时，接种后pams，接种24小时后收集样品，分别通过westernblot和荧光定量pcr检测prrsv-n基因在蛋白和mrna水平的表达，显示5d9单抗对prrsv病毒的抑制作用呈现出剂量依赖型增加。2.2单克隆抗体5d9广谱反应活性测定分别用prrsv-i和prrsv-ii型病毒感染marc145细胞，用该单抗作为一抗进行ifa试验检测。具体检测结果参见图2。基于图2的结果可知，使用prrsv-ii型病毒经典毒株（vr2332，ch1a），高致病prrsv-2毒株（gd-hd，sd16），以及prrsv-ii经典毒株突变株vr2385，以及prrsv-2新型突变毒株nadc30，和prrsv-i型毒株gz11感染macr-145细胞，24小时后使用4%多聚甲醛溶液固定细胞，含有0.5%tritonx100的pbs对固定细胞进行破膜处理，使用5d9（红色荧光通道）和prrsv多克隆猪阳性血清（绿色通道，阳性对照）对细胞进行免疫荧光染色后可发现5d9可识别所有prrsv病毒所感染的marc-145细胞，表明单克隆抗体5d9对prrsv-i和prrsv-ii型病毒具有广谱反应性。2.3单克隆抗体5d9广谱中和活性测定挑选目前在国内广泛流行的代表性prrsv毒株，高致病prrsv（jxa1，gd-hd），经典prrsv毒株（vr2332,ch1a）和突变毒株（vr2385，nadc30），以0.4微摩尔每毫升的剂量加入抗体37℃孵育后感染pams细胞，荧光定量pcr检测prrsv-n基因表达，基于图3的结果可知，发现单克隆抗体5d9可广谱抑制不同prrsv毒株的感染。实施例3：3.1抗原的制备及与抗体的复合（以下以prrsv病毒为例）使用prrsv-sd16毒株感染marc145细胞，在病毒感染72小时后收集病毒培养上清液，将足够量的病毒培养上清以12000g离心力离心1小时去除细胞碎片，通过labscaletff切滤仪使用100kd分子量滤膜（emdmillipore公司)使用100kd分子量滤膜浓缩50倍，再通过液相色谱纯化prrsv-sd16病毒粒子。使用千分之一浓度的β-丙内脂处理病毒并于4度放置过夜灭活病毒，37度水浴锅放置1小时降解β-丙内脂后，将病毒与单克隆抗体5d9（以质量计算）按照1:5的比例混合，37℃放置2小时形成复合物。3.2疫苗的配制及小鼠免疫将复合后的“igm-灭活病毒”免疫复合物（以体积计算）以46:54比值与montanide™isa206油包水佐剂，混合乳化后，按照每只小鼠120ul疫苗的剂量免疫，2周后免疫第二次。在此过程中，还设置了3个对照组。其中组1为灭活的prrsv-sd16病毒粒子(10μg)+isa206+5d9(50μg)；组2为灭活的prrsv-sd16病毒粒子(10μg)+isa206；组3为灭活的prrsv-sd16病毒粒子(10μg)；组4为pbs，其免疫程序为：在首次免疫前1天采血保存；首次免疫后2周进行第二次免疫，第二次免疫后2周采血，并处死小鼠进行细胞水平分析。3.3抗体水平检测用idexx-prrs3x-elisa检测稀释至1-20的小鼠血清样品中的prrsv抗体水平，具体结果如图5所示。基于图4可知，除pbs对照组小鼠外，所有小鼠在第二次免疫后均出现血清转化。所述组1（灭活的prrsv-sd16病毒粒子(10μg)+isa206+5d9(50μg)）和组2（灭活的prrsv-sd16病毒粒子(10μg)+isa206）均能诱导小鼠产生较高的抗体水平，其相比仅组3仅注射灭活病毒而言，所产生的抗体浓度更高。3.4抗原特异性杀伤性t细胞免疫应答的检测小鼠cd8+杀伤性t细胞的采集，在第二次免疫两周后处死小鼠，采集小鼠脾脏并使用单细胞滤网研磨后，使用抗pe标记的cd4抗体和fitc标记的cd8抗体进行染色，流式细胞仪分选cd8阳性t细胞，用于后继检测，其典型流式细胞仪分选图谱如图5所示。结果显示，不同组间cd4+和cd8+t细胞百分比相似，观察组间无显著差异。3.4抗原特异性cd8杀伤性t细胞的检测将从未免疫小鼠体内分选获得的树突状细胞（dc细胞）使用prrsv-sd16病毒（1moi）刺激24小时以模拟体内抗原加工提呈的过程，将5×103个病毒刺激过dc细胞，与1×104个cd8杀伤性t细胞在v型底96孔板中进行共培养刺激72小时后，使用ifn-γ酶联免疫斑点检测试剂盒（r&d公司产品）检测cd8杀伤性t细胞的增殖，不同组别的酶联免疫斑点图如图6所示。结果显示，在刀豆蛋白a（cona）刺激的cd8+t细胞中观察到斑点，而在幼稚小鼠组的cd8+t细胞中未检测到斑点。pbs免疫组和单纯灭活病毒免疫组观察到少量斑点（少于10个），两组间无显著性差异。当使用正常的水包油疫苗佐剂时，只观察到ifn-γ点的数量略有增加，这表明正常的疫苗佐剂不能增强灭活病毒疫苗引起的ctl反应。然而，当“igm-灭活病毒”免疫复合物与佐剂联合免疫小鼠时，ifn-γ分泌t细胞显著升高（增加2倍），提示在灭活病毒免疫过程中，prrsv特异性igm-5d9与正常的水包油佐剂联合免疫可增强ctl反应。实施例4：仔猪免疫攻毒保护试验筛选prrsv抗原抗体双阴性的35-40日龄健康仔猪40头，按10头每组分为4组，第一组试验猪免疫实施例3中“3.2疫苗的配制”制备得到的组1疫苗（灭活的prrsv-sd16病毒粒子(10μg)+isa206+5d9(50μg)）；第二组的试验猪免疫过程中采用实施例3中“3.2疫苗的配制”制备得到的组2疫苗（灭活的prrsv-sd16病毒粒子(10μg)+isa206）（对照组1）；第三组试验猪免疫市售弱毒活疫苗，第四组试验猪为空白对照组。在免疫后第28天使用高致病性prrsv-sd16强毒株肌肉注射攻毒感染，于攻毒前2天以及攻毒后21天持续监测实验动物体温与临床表现，并于攻毒后第21天剖杀试验动物，观察剖检病变，重点记录肺脏病变情况。prrsv攻毒后发病标准，即：（1）连续3日体温高于41℃或咳嗽与呼吸困难症状；（2）剖检可见片状的肺部实变。具体结果见表1。表1仔猪的免疫保护试验结果组别疫苗临床症状高体温症状肺部实变发病判断保护率第一组灭活的prrsv-sd16病毒粒子(10μg)+isa206+5d9(50μg)0/100/100/100/10100%第二组灭活的prrsv-sd16病毒粒子(10μg)+isa2061/100/101/101/1090%第三组市售弱毒活疫苗2/103/102/103/1070%第四组pbs10/1010/1010/1010/100%结果表明，本发明制备的“igm-灭活病毒”免疫复合物的免疫保护率最高（表1），其相比仅采用商业化佐剂isa206制备得到的疫苗以及商品化的弱毒疫苗能够达到更高的保护效力。序列表<110>西北农林科技大学<120>一种免疫增强剂及其在疫苗制备中的应用<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>574<212>prt<213>单克隆抗体5d9重链氨基酸序列(人工合成)<400>1gluvalglnleuglnglnserglyproaspleuvallysprosergln151015serleuserleuthrcysthrvalthrglytyrserilethrarggly202530tyrsertrphistrpileargglnpheproglyasnlysleuglutrp354045metglytyrilehistyrserglyserthrasntyrasnproserleu505560lysserargileserilethrargaspthrserlysasnglnphephe65707580leuglnleuasnservalthrthrgluaspthralathrtyrtyrcys859095alaargtyrglyasntyrtrpphealatyrtrpglyglnglythrleu100105110valthrvalseralagluserglnserpheproasnvalpheproleu115120125valsercysgluserproleuserasplysasnleuvalalametgly130135140cysleualaargasppheleuproserthrileserphethrtrpasn145150155160tyrglnasnasnthrgluvalileglnglyileargthrpheprothr165170175leuargthrglyglylystyrleualathrserglnvalleuleuser180185190prolysserileleugluglyseraspglutyrleuvalcyslysile195200205histyrglyglylysasnargaspleuhisvalproileproalaval210215220alaglumetasnproasnvalasnvalphevalproproargaspgly225230235240pheserglyproalaproarglysserlysleuilecysglualathr245250255asnphethrprolysproilethrvalsertrpleulysglytrpglu260265270alaargglyiletrpleuproproglnileargtrpthrileargglu275280285glnargilehishisproglnthrtyrlysvalileserthrleuthr290295300ilesergluileasptrpleuasnleuasnvaltyrthrcysargval305310315320asphisargglyleuthrpheleulysasnvalserserthrcysala325330335alaserproserthraspileleuthrphethrileproproserphe340345350alaaspilepheleuserlysseralaasnleuthrcysleuvalser355360365asnleualathrtyrgluthrleuasnilesertrpalaserglnser370375380glygluproleugluthrlysilelysilemetgluserhisproasn385390395400glythrpheseralalysglyalaalaservalcysvalgluasptrp405410415asnasnarglysgluphevalcysthrvalthrhisargaspleupro420425430serproglnlyslyspheileserlysproasngluvalhislyshis435440445proproalavaltyrleuleuproproalaarggluglnleuasnleu450455460arggluseralathrvalthrcysleuvallysglypheserproala465470475480aspileservalglntrpleuglnargglyglnleuleuproglnglu485490495lystyrvalthrseralaprometprogluproglyalaproglyphe500505510tyrphethrhisserileleuthrvalthrglugluglutrpasnser515520525glygluthrtyrthrcysvalvalglyhisglualaleuprohisleu530535540valthrgluargthrvalasplysserthrglylysprothrleutyr545550555560asnvalserleuilemetseraspthrglyglythrcystyr565570<210>2<211>213<212>prt<213>单克隆抗体5d9轻链氨基酸序列(人工合成)<400>2aspilevalleuthrglnserthralailemetseralaserprogly151015glulysvalthrilesercysseralaserserservalsertyrmet202530tyrtrptyrglnglnlysproglyserserprolysprotrpiletyr354045argthrserasnleualaserglyvalproalaargpheserglyser505560glyserglythrsertyrserleuthrilesersermetglualaglu65707580aspalaalathrtyrtyrcysglnglntyrhissertyrprotyrthr859095pheglyglyglythrlysprogluilelysargalaaspalaalapro100105110thrvalserilepheproprosersergluglnleuthrserglygly115120125alaservalvalcyspheleuasnasnphetyrprolysaspileasn1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