2-甲氧基雌二醇-17β-脯氨酰胺类似物、合成方法及其应用与流程

本发明涉及药物化学领域，主要涉及一类新型的以雌甾为母核的2-甲氧基雌二醇-17β-脯氨酰胺类似物、其制备方法和用途。

背景技术：

根据“2015年中国的癌症统计数据”(chenw,,etal.caacancerjournalforclinicians,2016,66(2):115.)，中国2015年新增癌症患病人数为429万人，并且新增癌症死亡人数281万人，其中主要发病的癌症种类是肺癌和胃癌。通过性别区分发现，在女性群体中乳腺癌的发病率超过肺癌，并且总的来看女性的生殖系统癌症的发病率远远高于男性。

女性的生理周期和生殖能力主要是由雌激素调控的，先前人们认为这个过程仅仅是雌激素、黄体酮和其它激素像催产素、催乳素等产生的特定作用。现在人们意识到激素在人体内仅仅是起到一部分作用，它们的代谢产物在生殖生理过程和病理过程的调控中同样具有重要作用。这些激素代谢紊乱就会打破身体内激素的平衡，改变生殖器官如乳腺、卵巢、子宫等功能，随之而来的就是月经不调、子痫前期、子宫内膜异位症、不孕症和癌症。

2-甲氧基雌二醇(2-me)是17β-雌二醇的内源性代谢产物。2-甲氧基雌二醇存在于正常人的尿液、血液中，据报道2-甲氧基雌二醇在男性及未怀孕的妇女血浆中含量较低(分别为10～35pg·ml^-1和18～138pg·ml^-1)，而在孕妇血浆中含量较高(可达216～10690pg·ml^-1)。2-me曾经被认为是一种没有作用的代谢产物，但现在研究发现2-me是生殖生理调控的重要组成物质，对癌症、风湿性关节炎、心血管系统等均有一定的作用(dubeyrk,etal.trendsinendocrinology&metabolism,2009,20(8):374-379)。

2-甲氧基雌二醇是一个有希望的抗癌候选药，目前已经处于临床i期和ii期研究。但由于其水溶性差，生物利用度低，体内半衰期短，且体内吸收无规律，2-me的临床应用还面临诸多困难。因此对2-甲氧基雌二醇进行结构修饰和改造以改进2-甲氧基雌二醇的水溶性和生物利用度，具有现实意义和研究价值。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种具有较好抗肿瘤活性且水溶性好的2-甲氧基雌二醇-17β-脯氨酰胺类似物，并提供其制备方法和在抗肿瘤药物方面的应用。

为实现本发明目的，技术方案如下：

所述2-甲氧基雌二醇-17β-脯氨酰胺类似物是以雌甾为母核的2-甲氧基雌二醇-17β-脯氨酰胺类似物，具有如下所示通式结构：

其中，m＝0,1,2；n＝0,1,2；r＝0,1,2；x＝h,oh,f,cl,br,oso2nh2；y＝c,o,s,n；r1＝h,so2nh2；r2＝h,me,et,ac；

优选：m＝0,1,2；n＝0,1；r＝0,1,2；x＝h,oh,oso2nh2；y＝c,s；r1＝h,so2nh2；r2＝h,ac。

上述化合物17位取代基为l或d或dl构型。

本发明提供2-甲氧基雌二醇-17β-脯氨酰胺类似物，可通过以下反应路线实现：

(1)将雌甾母体化合物1溶解在有机溶剂中，常温搅拌下加入路易斯碱和缩合剂至溶解，然后加入氨基n保护的脯氨酸或脯氨酸类似物，薄层检测至反应完全；然后有机相经洗涤，萃取分离，干燥、浓缩后，通过重结晶或柱层析进行分离纯化，得到酰胺缩合的中间体化合物2；

(2)将酰胺中间体2溶于有机溶剂中，采用催化氢化、酸解、碱解、或三甲基卤代硅烷方法脱除保护剂，然后将反应液抽滤，滤液浓缩，用溶剂重结晶或柱层析方法得到化合物3或化合物a；

(3)在有机溶剂中，将化合物3和氨基磺酰氯反应，生成3-位氨基磺酸酯化的化合物4，其中氨基磺酰氯也可以由氯磺酰异氰酸酯和甲酸在冰浴下反应现场制得；

(4)将酰胺化合物4溶于有机溶剂中，采用催化氢化、酸解、碱解、或三甲基卤代硅烷方法脱除保护剂，然后将反应液抽滤，滤液浓缩，用溶剂重结晶或柱层析方法得到化合物b。

步骤(1)中，所述的脯氨酸类似物可为l或d或dl构型的脯氨酸、羟脯氨酸、硫代脯氨酸、高脯氨酸(2-哌啶酸)、3-哌啶酸、4-哌啶酸；氨基保护基r”选苄氧羰基(cbz)、叔丁氧羰基(boc)、9-芴甲氧羰基(fmoc)或乙酰基(ac)；其中，所述的雌甾母体化合物1和氨基保护的脯氨酸类似物的配料摩尔比为1:1.0～1:3.0。

所用的路易斯碱选三乙胺、n，n-二异丙基乙胺、乙二胺、n,n’-二甲基乙二胺、n,n,n',n'-四甲基乙二胺、吡啶、三乙醇胺、三乙烯二胺、n-甲基吗啉、4-二甲氨基吡啶、吡咯烷基吡啶、1,5-二氮杂双环，1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯、四甲基胍、1,5,7-三氮二环[4,4,0]十碳-5-烯、7-甲基-1,5,7-三氮二环[4,4,0]十碳-5-烯其中之一，或碳酸钠、醋酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾、甲醇钠、乙醇钠、氢化钙、氢化钠、叔丁醇钾、叔丁醇钠、正丁基锂、叔丁基锂、六甲基二硅基胺基钾、六甲基二硅基胺基钠、二异丙基氨基锂、2,2,6,6-四甲基哌啶锂(litmp)其中之一；其中雌甾母体化合物1和路易斯碱的配料摩尔比为1:1.0～1:5.0。

缩合剂选2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-n,n,n’,n’-四甲基脲六氟磷酸盐、6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯、二环己基碳二亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺、n-羟基苯并三氮唑、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、n-羟基邻苯二甲酰亚胺、o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸酯、o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐、o-(n-琥珀酰亚胺)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯、2-(5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸季铵盐中的一种或两种；雌甾母体化合物1和缩合剂的配料摩尔比为1:1.0～1:5.0。

步骤(1)所用的有机溶剂选n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、丙酮、甲基乙基酮、甲苯、氯仿、三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、异丁醇、乙醚、异丙醚、乙酸乙酯、四氢呋喃、二氧六环、硝基甲烷、吡啶、二氯化乙烯等中的一种或两种；

所述的雌甾母体化合物1具有如下分子结构通式：

其中r′为氢原子、乙酰基、苄基、甲氧基亚甲基或四氢吡喃基；优选苄基。其制备方法采用xiufangshi,etal,steroids,2017,128:6-14文献方法合成。

步骤(2)和步骤(4)中，脱保护基过程中反应温度优选50～90℃；催化氢化方法选质量百分含量10％的钯碳催化剂，用量为所述酰胺中间体质量的5％～20％；三甲基卤代硅烷优选三甲基溴硅烷、三甲基碘硅烷、或三甲基氯硅烷；酸解溶液选盐酸、氢溴酸、三氟乙酸、冰醋酸或乙酸、甲酸、磷酸、柠檬酸或酒石酸及三氟化硼、三氯化铁、四氯化钛、硝酸铈胺等路易斯酸lewis；碱解溶液选氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸氢钾的水溶液或醇钠等；有机溶剂选甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、异丁醇、乙醚、异丙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、丙酮、甲基乙基酮、甲苯、四氢呋喃、1，4-二氧六环、硝基甲烷、吡啶、二氯化乙烯中的一种或两种；重结晶或柱层析溶剂优选乙酸乙酯、石油醚、甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷等中的一种或两种。

步骤(3)中，有机溶剂优选水、乙醇、乙腈、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺。

按照上述方法，制备得到的系列a化合物和系列b化合物的结构如下：

本发明优点：以2-甲氧基雌二醇为先导化合物，在其3位引入氨基磺酸酯基，17β位引入脯氨酰胺基，制备2-甲氧基雌二醇衍生物，制备方法简单，条件温和，收率高，达60％以上，可以方便地制备2-甲氧基雌二醇-17β-脯氨酰胺类似物。肿瘤细胞的抗增殖活性评价实验结果表明，本发明提供的2-甲氧基雌二醇-7β-脯氨酰胺类似物具有较好的水溶性和生物利用度，并且对于大多数肿瘤细胞例如食管癌ec-109细胞、乳腺癌mcf-7细胞、前列腺癌pc-3细胞宫颈癌hela细胞及卵巢癌skov3细胞等具有一定的抑制作用。其中化合物a-1在37℃水中的溶解度为42.8mg/l，脂水分配系数为1.25,优于2-甲氧基雌二醇的水溶性(1.669mg/l)和脂水分配系数(2.86)(郭新红等，郑州大学学报(医学版)，2010,45(1):141-143)，并且药物体内代谢半衰期明显延长到4小时左右(2-me半衰期为20min左右)，药物体内生物利用度也明显改善，可用于抗肿瘤药物制剂的开发。

附图说明

图1为本发明化合物a-1和2-me的半衰期对比图，图中，1为本发明化合物a-1，2为2-甲氧基雌二醇化合物(2-me)。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的具体实施方式作详细说明。

其中雌甾母体2-甲氧基-3-苄氧基-雌甾-1,3,5(10)-三烯-17β-胺按照xiufangshi,etal,steroids,2017,128:6-14文献方法合成。

实例1：化合物2-甲氧基-3-羟基-17β-(l-脯氨酰胺基)-雌甾-1,3,5,(10)-三烯(a-1)的制备方法

准确称量2-甲氧基-3-苄氧基-雌甾-1,3,5,(10)-三烯-17β-胺400mg加入到三口烧瓶中，加入15ml二氯甲烷室温搅拌溶解，然后逐次加入n-叔丁氧基羰基-l-脯氨酸329mg、二环己基碳二亚胺422mg、n-羟基琥珀酰亚胺235mg和n，n-二异丙基乙胺0.55ml，常温搅拌6小时后反应完全。反应液过滤，然后分别用10％盐酸、饱和碳酸钠、饱和氯化钠萃取一次。有机相用无水硫酸钠干燥，柱层析纯化(洗脱剂为体积比石油醚：乙酸乙酯＝4:1)，得到缩合产物477mg，收率80％。

于三口烧瓶中，加入上述缩合产物426mg，用12ml乙腈溶解，在油浴中加热至60℃，然后滴加三甲基溴硅烷0.8ml，70℃反应4小时，冷却后将反应液抽滤，滤液浓缩，用四氢呋喃重结晶得到产物218mg，收率76％。¹hnmr(400mhz,chloroform-d)δ7.57(d,j＝9.5hz,1h),6.77(s,1h),6.64(s,1h),3.91(q,j＝9.1,8.7hz,1h),3.85(s,3h),3.75(dd,j＝9.1,5.4hz,1h),3.01(dt,j＝10.3,6.8hz,1h),2.88(dt,j＝10.2,6.4hz,1h),2.75(h,j＝7.4hz,2h),2.27–2.18(m,2h),2.17–2.08(m,2h),1.97–1.89(m,1h),1.89–1.82(m,1h),1.82–1.74(m,2h),1.70(td,j＝7.0,5.2hz,2h),1.44(t,j＝10.0hz,2h),1.34(pd,j＝10.9,9.6,3.2hz,5h),0.73(s,3h).¹³cnmr(101mhz,chloroform-d)δ175.0,144.7,143.6,114.7,108.2,60.7,58.2,56.1,51.6,47.2,44.1,43.4,38.9,36.9,30.8,29.0,28.7,27.4,26.5,26.2,23.3,12.1.

实例2：化合物2-甲氧基-3-氨基磺酸酯基-17β-(l-脯氨酰胺基)-雌甾-1,3,5,(10)-三烯(b-1)的制备方法

于50ml聚四氟乙烯耐压瓶，将实例1中制得的脯氨酸缩合产物200mg用20ml乙醇溶解，然后加入10％钯碳催化剂30mg，加氢装置通入氢压力为0.3mpa，油浴60℃反应3h至氢化反应完全。然后过滤，滤液蒸干，用适量乙醇重结晶，得到氢化粗品156mg，产率92％。

在冰浴和氮气保护下，将156mg氢化粗品溶于5ml无水n,n-二甲基甲酰胺溶液中，然后缓慢滴加0.1ml氨基磺酰氯，冰浴下搅拌2h至反应完全。然后缓慢滴加8倍量体积的蒸馏水，析出大量白色固体，抽滤，得到氨基磺酰化物145mg，产率80.2％。

将上述氨基磺酰化物145mg置于圆底烧瓶中，加入乙醇5ml搅拌溶解，然后室温下滴加三氟乙酸0.5ml，反应2h减压蒸去乙醇及三氟乙酸，残余物再用饱和碳酸氢钠溶液洗三次，柱层析纯化，洗脱剂体积比为二氯甲烷：甲醇：三乙胺＝10：1：0.1得到产物95mg，产率79.2％。¹hnmr(400mhz,chloroform-d)δ7.27(s,1h),6.75(s,1h),6.45(d,j＝3.0hz,1h),4.78(s,1h),4.45(s,1h),3.71(t,j＝2.5hz,3h),3.24(dq,j＝22.1,7.5hz,2h),2.75–2.58(m,2h),2.39–2.24(m,2h),2.14(t,j＝9.7hz,2h),1.96(h,j＝7.5,6.6hz,3h),1.78(d,j＝11.2hz,2h),1.69(d,j＝9.7hz,1h),1.66–1.58(m,1h),1.41(d,j＝11.9hz,1h),1.37(s,2h),1.33(d,j＝10.5hz,3h),1.23(s,1h),0.76(s,3h).¹³cnmr(101mhz,dmso-d6)δ168.76,145.54,144.41,129.94,128.26,115.59,109.85,83.89,58.84,55.85,48.81,45.40,43.43,42.88,38.17,36.31,28.32,27.99,26.88,26.83,25.88,22.94,22.73,11.90.

实例3：化合物2-甲氧基-3-羟基-17β-(l-2-哌啶酰胺基)-雌甾-1,3,5,(10)-三烯(a-7)的制备方法

准确称取2-甲氧基-3-苄氧基-雌甾-1,3,5,(10)-三烯-17β-胺540mg加入到三口烧瓶中，然后加入30ml甲苯于室温下搅拌溶解，加入483mgn-苄氧羰基-l-2哌啶酸，然后加入苯并三氮唑-n,n,n’,n’,-四甲基脲六氟磷酸盐847mg和三乙胺0.7ml，tlc检测，室温反应4h后反应完全。过滤后的反应液分别用质量百分含量10％盐酸水溶液，饱和碳酸钠溶液和饱和食盐水洗一次，有机相用适量无水硫酸钠干燥，浓缩后柱层析纯化(洗脱剂为体积比石油醚：乙酸乙酯＝6：1)得到缩合产物648mg，收率73.8％。

于聚四氟乙烯耐压瓶中，加入上述缩合产物648mg，用适量的乙醇溶解后加入48mg的10％钯碳催化剂，加氢压力为0.3mpa，60℃反应4小时，tlc检测反应进度。然后用薄层硅胶抽滤反应液，用适量乙酸乙酯和石油醚重结晶，得到产物286mg，收率68.3％。¹hnmr(400mhz,dmso)δ8.59(br,1h,-oh),7.25(d,j＝9.0hz,1h),6.75(s,1h),6.44(s,1h),3.85–3.74(m,1h),3.71(s,3h),3.07(dd,j＝10.0,1.9hz,1h),2.91(d,j＝12.6hz,1h),2.69–2.57(m,2h),2.23(d,j＝4.9hz,1h),2.11(s,1h),1.95–1.83(m,1h),1.81–1.61(m,6h),1.46(d,j＝9.9hz,2h),1.35–1.22(m,10h),0.66(s,3h).¹³cnmr(101mhz,dmso)δ172.94,145.52,144.34,130.29,128.29,115.57,109.83,59.31,57.71,55.82,51.14,45.05,43.68,43.23,38.68,36.90,30.18,28.41,27.32,27.10,26.05,25.84,23.98,22.91,11.96。

实例4：化合物2-甲氧基-3-氨基磺酸酯基-17β-(d-2-哌啶酰胺基)-雌甾-1,3,5,(10)-三烯(b-8)的制备方法

准确称取2-甲氧基-3-苄氧基-雌甾-1,3,5,(10)-三烯-17β-胺617mg加入到三口烧瓶中，加入30ml乙腈室温下搅拌溶解，然后逐次加入620mgn-叔丁氧羰基-d-2-哌啶酸，苯并三氮唑-n,n,n’,n’,-四甲基脲六氟磷酸盐1.0g和n,n-二异丙基乙胺1.0ml，室温反应4h。反应液过滤，然后分别用质量百分含量10％盐酸水溶液，饱和碳酸钠溶液和饱和食盐水洗一次，加适量无水硫酸钠干燥，浓缩后柱层析纯化，(洗脱剂为体积比石油醚：乙酸乙酯＝20：3)，得到缩合产物626mg，收率65.9％。

于50ml聚四氟乙烯耐压瓶，加入上述缩合产物626mg和50ml甲醇溶解后加入10％钯碳催化剂70mg，加氢装置通入氢压力为0.3mpa，油浴60℃反应4h后。过滤，滤液蒸干，用适量乙醇重结晶，得到氢化粗品536mg，产率100％。

在冰浴和氮气保护下，将无水甲酸0.176ml加入到氯磺酰异氰酸酯0.406ml中，快速搅拌，15min后瓶中产生大量白色固体，加入无水乙腈5ml，然后室温下搅拌7h得到氨基磺酰氯溶液。然后将含有536mg氢化粗品的8ml无水n,n-二甲基乙酰胺溶液，缓慢滴加到上述氨基磺酰氯溶液中，冰浴下搅拌2h至反应完全。然后缓慢滴加8倍量体积的蒸馏水，析出大量白色固体，抽滤，得到氨基磺酰化物546mg，产率88.3％。

将上述氨基磺酰化物546mg置于圆底烧瓶中，加入二氯甲烷10ml搅拌溶解，然后室温下滴加三氟乙酸0.840ml，反应2h减压蒸去二氯甲烷及三氟乙酸，残余物再用饱和碳酸氢钠溶液洗三次，柱层析纯化，洗脱剂体积比为二氯甲烷：甲醇：三乙胺＝10：1：0.1得到产物345mg，产率76.1％。¹hnmr(400mhz,dmso)δ8.14(d,j＝8.3hz,1h),7.83(s,2h),6.99(s,1h),6.97(s,1h),3.82-3.79(m,1h),3.76(s,3h),3.74-3.71(m,1h),3.22(d,j＝11.8hz,1h),3.15–3.06(m,1h),2.93(d,j＝11.6hz,1h),2.77–2.67(m,2h),2.37–2.27(m,1h),2.26–2.17(m,1h),2.13–2.03(m,1h),2.00–1.88(m,1h),1.87–1.75(m,3h),1.74-1.65(m,2h),1.64–1.55(m,1h),1.53-1.43(m,3h),1.40–1.24(m,6h),0.71(s,3h).¹³cnmr(101mhz,dmso)δ168.41,149.43,138.79,136.78,128.29,122.90,110.52,58.76,57.17,55.90,51.06,43.88,43.28,43.21,38.18,36.71,28.21,27.20,27.02,26.76,25.74,22.83,21.62,21.23,11.92。

按照实例1、实例3的类似方法可以制备得到a系列其他化合物。

按照实例2、实例4的类似方法可以制备得到b系列化合物。

本权利要求书中所涉及的化合物a-1～a-15及b-1～b-15但不仅仅局限于这些化合物，其合成方法可参考实施例1～4的方法进行。其中，具有代表性的化合物的核磁数据如下：

化合物a-2，¹hnmr(400mhz,dmso)δ8.02(d,j＝8.7hz,1h),6.74(s,1h),6.45(s,1h),4.29(s,1h),4.04–3.97(m,1h),3.78(q,j＝9.2hz,1h),3.70(s,3h),3.08(dd,j＝11.7,4.2hz,1h),2.90(d,j＝11.8hz,1h),2.68–2.58(m,2h),2.27–2.19(m,1h),2.12(dd,j＝12.8,7.6hz,2h),1.97–1.90(m,1h),1.84–1.59(m,5h),1.53–1.42(m,1h),1.33–1.23(m,6h),0.67(s,3h).¹³cnmr(101mhz,dmso)δ171.03,145.49,144.38,130.21,128.33,115.61,109.91,70.29,58.62,58.22,55.87,54.26,51.04,43.62,43.36,39.81,38.64,36.90,28.39,27.25,27.09,26.03,22.90,12.01。

化合物a-3，¹hnmr(400mhz,dmso)δ8.13(d,j＝8.7hz,1h),6.74(s,1h),6.45(s,1h),4.35–4.27(m,1h),4.06(dd,j＝9.6,5.6hz,1h),3.83(q,j＝9.0hz,1h),3.70(s,3h),3.16(dd,j＝11.4,4.8hz,1h),2.87(dd,j＝14.5,7.3hz,1h),2.67–2.57(m,2h),2.49–2.38(m,1h),2.23(d,j＝9.2hz,1h),2.12(s,1h),1.98–1.92(m,1h),1.90–1.87(m,1h),1.86–1.74(m,2h),1.72–1.64(m,2h),1.63–1.50(m,1h),1.37–1.22(m,6h),0.68(s,3h).¹³cnmr(101mhz,dmso)δ169.39,145.51,144.34,130.26,128.27,115.57,111.88,68.96,58.66,58.11,55.83,53.05,50.97,43.61,40.07,38.63,36.80,28.37,27.10,26.75,26.08,22.91,12.06。

化合物a-4，¹hnmr(400mhz,dmso)δ8.58(s,1h),7.77(d,j＝9.5hz,1h),6.75(s,1h),6.44(s,1h),4.65(s,1h),4.15–4.06(m,1h),3.75(q,j＝9.6hz,1h),3.71(s,3h),3.48(dd,j＝9.4,5.4hz,1h),2.94(dd,j＝10.8,5.3hz,1h),2.68–2.60(m,3h),2.27–2.20(m,1h),2.17–2.08(m,2h),1.98–1.86(m,1h),1.82–1.74(m,1h),1.74–1.61(m,3h),1.49–1.38(m,1h),1.34–1.20(m,6h),0.69(s,3h).¹³cnmr(101mhz,dmso)δ173.98,145.52,144.35,130.35,128.32,115.58,109.87,71.12,59.27,57.50,55.83,54.71,51.16,43.69,43.39,39.56,38.67,36.71,28.40,27.75,27.11,26.07,22.93,11.66。

化合物a-5，¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ6.77(s,1h),6.63(s,1h),4.58(d,j＝8.0hz,1h),3.91–3.86(m,1h),3.86(s,4h),3.21(q,j＝7.1hz,3h),2.73(dt,j＝13.9,9.7hz,3h),2.47–2.34(m,2h),2.21(dd,j＝16.4,10.4hz,3h),2.11(s,3h),1.95–1.84(m,6h),1.44(dd,j＝13.8,8.1hz,4h),1.33–1.27(m,3h),0.75(s,3h).¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ171.15,171.13,144.63,143.48,131.80,129.47,114.63,108.23,59.82,59.14,56.12,51.63,48.40,47.36,44.13,43.51,38.93,37.11,28.99,28.58,27.44,26.56,25.02,23.38,22.52,12.11。

化合物a-6，¹hnmr(400mhz,dmso)δ8.58(s,1h),7.72(d,j＝8.8hz,1h),6.75(s,1h),6.44(s,1h),4.22–4.15(m,1h),3.86–3.78(m,1h),3.78–3.72(d,j＝21.6hz,2h),3.70(s,3h),3.24–3.13(m,1h),2.78(dd,j＝9.8,6.9hz,1h),2.68–2.59(m,2h),2.30–2.20(m,1h),2.12(s,1h),1.98–1.84(m,2h),1.82–1.74(m,1h),1.71–1.62(m,2h),1.54–1.43(m,1h),1.35–1.21(m,6h),0.67(s,3h).¹³cnmr(101mhz,dmso)δ170.00,145.52,144.34,130.27,128.31,115.57,109.81,65.89,58.25,55.81,54.02,51.06,43.64,43.34,38.64,36.94,36.38,28.39,27.20,27.09,26.06,22.90,12.05。

化合物a-8，¹hnmr(400mhz,dmso)δ8.85–8.34(br,1h,-oh),7.25(d,j＝9.0hz,1h),6.75(s,1h),6.44(s,1h),3.79(q,j＝9.2hz,1h),3.71(s,3h),3.08–3.03(m,1h),2.89(d,j＝12.7hz,1h),2.67–2.55(m,3h),2.27–2.20(m,1h),2.16–2.08(m,1h),1.94–1.84(m,1h),1.80–1.62(m,5h),1.53–1.42(m,2h),1.38–1.23(m,10h),0.67(s,3h).¹³cnmr(101mhz,dmso)δ172.86,145.51,144.34,130.29,128.30,115.57,109.84,59.21,57.75,55.82,51.14,44.90,43.67,43.29,38.67,36.97,29.69,28.41,27.36,27.10,26.03,25.72,23.72,22.91,12.01。

化合物a-9，¹hnmr(400mhz,dmso)δ7.67–7.64(m,1h),6.74(s,1h),6.44(s,1h),3.77(q,j＝9.2hz,1h),3.70(s,3h),2.93–2.79(m,2h),2.68–2.57(m,3h),2.36–2.27(m,1h),2.25–2.17(m,1h),2.10(s,1h),1.92–1.74(m,3h),1.69–1.51(m,5h),1.50–1.32(m,3h),1.31–1.20(m,6h),0.65(s,3h).¹³cnmr(101mhz,dmso)δ173.75,145.53,144.40,130.31,128.31,115.60,109.87,59.71,57.87,55.84,51.14,47.94,45.43,43.67,43.29,42.18,38.69,37.07,28.40,27.11,26.07,24.51,22.89,20.71,14.05,12.08。

化合物a-10，¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ6.79(s,1h),6.65(s,1h),4.02–3.95(m,1h),3.87(s,3h),2.86–2.82(m,2h),3.54–3.47(m,1h),3.46–3.29(m,2h),2.81–2.74(m,2h),2.74–2.68(m,1h),2.43–2.36(m,1h),2.26–2.20(m,2h),2.15–2.13(m,1h),2.12(s,2h),1.90–1.83(m,2h),1.80–1.75(m,2h),1.73–1.63(m,2h),1.60–1.55(m,1h),1.49–1.44(m,2h),1.41–1.35(m,4h),0.69(s,3h)。

化合物a-11，¹hnmr(400mhz,dmso)δ7.42(d,j＝8.6hz,1h),6.74(s,1h),6.44(s,1h),3.77(q,j＝9.2hz,1h),3.70(s,3h),2.97(d,j＝11.8hz,2h),2.68–2.58(m,2h),2.54–2.42(m,2h),2.33–2.17(m,2h),2.10(s,1h),1.89–1.74(m,2h),1.68–1.58(m,3h),1.56–1.42(m,4h),1.32–1.21(m,7h),0.64(s,3h).13cnmr(101mhz,dmso)δ174.42,145.52,144.38,130.31,128.29,115.59,109.84,57.93,55.82,51.16,45.18,44.97,43.67,43.34,42.12,38.69,37.10,29.70,28.47,28.40,27.11,26.96,26.07,22.88,12.08。

化合物a-12，¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ6.77(s,1h),6.63(s,1h),4.56(d,j＝13.6hz,1h),3.97(dd,j＝16.8,8.2hz,1h),3.85(s,3h),3.16–3.05(m,1h),2.78–2.64(m,4h),2.43–2.30(m,2h),2.27–2.15(m,4h),2.09(s,3h),1.90–1.80(m,3h),1.79–1.60(m,5h),1.47–1.34(m,5h),0.72(s,3h).¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ174.22,169.14,144.73,143.56,131.64,129.38,114.72,108.30,58.72,56.13,51.61,47.19,44.09,43.50,41.05,38.95,37.12,28.97,28.53,27.40,26.53,23.29,21.43,12.12,8.78.¹³cnmr(101mhz,dmso)δ173.75,171.22,144.40,130.31,128.31,115.60,109.87,59.71,57.87,55.84,51.14,47.94,45.43,43.67,43.29,42.18,38.69,37.07,28.40,27.11,26.07,24.51,22.89,20.71,14.05,12.60。

化合物b-2，¹hnmr(400mhz,dmso)δ7.97–7.70(m,3h),7.50(s,2h,),6.98(s,1h),6.97(s,1h),4.98–4.93(m,1h),3.83–3.77(m,1h),3.76(s,3h),3.75–3.70(m,1h),3.11(dd,j＝12.8,4.3hz,1h),3.07–3.00(m,1h),2.76–2.67(m,2h),2.36–2.25(m,2h),2.24–2.18(m,1h),1.96–1.87(m,2h),1.83(d,j＝10.7hz,1h),1.72–1.63(m,2h),1.62–1.40(m,2h),1.39–1.25(m,6h),0.68(s,3h).¹³cnmr(101mhz,dmso)δ172.53,149.42,138.9,136.74,128.28,122.91,110.50,81.55,59.12,57.94,55.88,52.55,51.09,43.89,43.17,38.21,37.57,36.84,28.21,27.47,26.77,25.79,22.90,11.93。

化合物b-3，¹hnmr(400mhz,dmso)δ8.17(d,j＝8.3hz,1h),7.82(s,2h),7.65(s,2h),6.98(s,1h),6.96(s,1h),5.10–5.04(m,1h),4.18-410(m,1h),3.84(q,j＝9.2hz,1h),3.76(s,3h),3.48–3.39(m,2h),2.78–2.66(m,3h),2.36–2.08(m,4h),2.02–1.90(m,1h),1.88–1.65(m,4h),1.60–1.46(m,1h),1.42–1.23(m,7h),0.69(s,3h).¹³cnmr(101mhz,dmso)δ168.55,149.42,138.86,136.74,128.27,122.91,110.45,77.86,58.70,58.15,55.87,51.03,51.00,43.87,43.50,38.19,36.82,36.67,28.19,26.91,26.78,25.86,22.88,11.92。

化合物b-4，¹hnmr(400mhz,dmso)δ7.89–7.76(m,3h),7.49(s,2h),6.98(s,1h),6.96(s,1h),4.97–4.90(m,1h),3.84–3.77(m,1h),3.76(s,3h),3.74–3.68(m,1h),3.24(dd,j＝12.3,5.1hz,0h),2.77–2.67(m,2h),2.48–2.41(m,1h),2.36–2.28(m,1h),2.26–2.16(m,1h),2.08–2.00(m,1h),2.00–1.91(m,1h),1.88–1.58(m,4h),1.56–1.42(m,1h),1.41–1.23(m,7h),0.70(s,3h).¹³cnmr(101mhz,dmso)δ149.42,139.24,136.85,128.43,123.04,110.47,79.10,58.04,55.81,52.08,51.25,43.91,43.20,38.21,36.72,36.62,28.32,27.47,26.83,25.77,22.90,11.67。

化合物b-5，¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.27(s,1h),7.17(d,j＝8.8hz,1h),7.02(s,1h),6.90(s,1h),5.38(s,2h,-nh2),4.58(d,j＝7.1hz,1h),3.92–3.87(m,1h),3.86(s,3h),3.61–3.53(m,1h),3.47–3.37(m,1h),2.94(dd,j＝32.0,23.7hz,1h),2.81–2.75(m,2h),2.48–2.40(m,1h),2.24–2.18(m,2h),2.11(s,3h),2.03–1.97(m,1h),1.90–1.82(m,3h),1.77–1.70(m,1h),1.51–1.40(m,3h),1.39–1.27(m,5h),0.74(s,3h).¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ171.22,171.16,149.03,140.36,136.91,130.04,123.94,110.56,59.80,59.06,56.41,51.63,48.41,44.36,43.40,38.44,37.00,28.64,28.54,27.42,27.14,26.32,25.04,23.37,22.49,12.07。

化合物b-6，¹hnmr(400mhz,dmso)δ7.83(s,2h),6.75(s,1h),6.44(s,1h),4.22–4.15(m,1h),3.86–3.78(m,1h),3.78–3.72(d,j＝21.6hz,2h),3.70(s,3h),3.24–3.13(m,1h),2.78(dd,j＝9.8,6.9hz,1h),2.68–2.59(m,2h),2.30–2.20(m,1h),2.12(s,1h),1.98–1.84(m,2h),1.82–1.74(m,1h),1.71–1.62(m,2h),1.54–1.43(m,1h),1.35–1.21(m,6h),0.67(s,3h).¹³cnmr(101mhz,dmso)δ170.00,145.52,144.34,130.27,128.31,115.57,109.81,65.89,58.25,55.81,54.02,51.06,43.64,43.34,38.64,36.94,36.38,28.39,27.20,27.09,26.06,22.90,12.05。

化合物b-7，¹hnmr(400mhz,acetone)δ7.02(s,1h),7.01(s,1h),4.13(dd,j＝11.8,3.3hz,2h),3.98(t,j＝9.6hz,1h),3.83(s,3h),3.82(t,j＝12hz,1h),3.53(d,j＝12.8hz,1h),3.21–3.17(m,1h),2.81–2.76(m,2h),2.39–2.33(m,1h),2.32–2.23(m,3h),1.96-1.93(m,2h),1.92-1.87(m,3h),1.84–1.80(m,1h),1.70–1.66(m,1h),1.64–1.61(m,1h),1.48–1.44(m,2h),1.43–1.36(m,5h),0.8(s,3h).¹³cnmr(101mhz,dmso)δ168.49,149.42,138.80,136.76,128.27,118.54,115.57,58.28,56.93,55.84,50.91,43.83,43.55,43.17,38.17,36.80,30.56,28.17,27.75,26.74,25.80,22.83,21.64,21.19,11.98。

化合物b-9，¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.23(s,1h),6.74(s,1h),6.44(s,1h),3.77(q,j＝9.2hz,1h),3.70(s,3h),2.93–2.79(m,2h),2.68–2.57(m,3h),2.36–2.27(m,1h),2.25–2.17(m,1h),2.10(s,1h),1.92–1.74(m,3h),1.69–1.51(m,5h),1.50–1.32(m,3h),1.31–1.20(m,6h),0.65(s,3h).¹³cnmr(101mhz,dmso)δ173.75,145.53,144.40,130.31,128.31,115.60,109.87,59.71,57.87,55.84,51.14,47.94,45.43,43.67,43.29,42.18,38.69,37.07,28.40,27.11,26.07,24.51,22.89,20.71,14.05,12.08。

化合物b-10，¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.28(s,1h),7.03(s,1h),6.89(s,1h),5.67(s,2h),4.09–3.93(m,2h),3.86(s,3h),3.84-3.81(m,1h),3.61–3.47(m,1h),3.44–3.22(m,2h),2.81–2.74(m,2h),2.42–2.32(m,1h),2.24–2.15(m,2h),2.12–2.10(m,1h)2.09(s,2h),1.90–1.84(m,2h),1.80–1.64(m,4h),1.57–1.50(m,1h),1.49–1.41(m,2h),1.40–1.29(m,4h),0.71(s,3h)。

化合物b-11，¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.27(s,1h),6.74(s,1h),6.44(s,1h),3.77(q,j＝9.2hz,1h),3.70(s,3h),2.97(d,j＝11.8hz,2h),2.68–2.58(m,2h),2.54–2.42(m,2h),2.33–2.17(m,2h),2.10(s,1h),1.89–1.74(m,2h),1.68–1.58(m,3h),1.56–1.42(m,4h),1.32–1.21(m,7h),0.64(s,3h).13cnmr(101mhz,dmso)δ174.42,145.52,144.38,130.31,128.29,115.59,109.84,57.93,55.82,51.16,45.18,44.97,43.67,43.34,42.12,38.69,37.10,29.70,28.47,28.40,27.11,26.96,26.07,22.88,12.08。

化合物b-12，¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.27(s,1h),7.03(s,1h),6.90(s,1h),5.47(d,j＝2.9hz,2h),4.62–4.54(m,1h),4.04–3.96(m,1h),3.87(s,3h),3.15–3.06(m,1h),2.82–2.76(m,2h),2.74–2.60(m,2h),2.41–2.32(m,2h),2.27–2.19(m,2h),2.09(s,2h),1.93–1.84(m,3h),1.81-1.74(m,3h),1.50–1.44(m,2h),1.42–1.31(m,6h),0.70(s,3h).¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ173.19,168.15,148.11,139.14,135.85,128.94,122.90,109.35,55.25,50.57,44.94,43.49,42.57,42.20,39.90,37.59,35.82,29.99,28.67,28.33,28.06,27.81,27.69,26.28,25.28,22.26,20.36,11.22。

实例5：2-甲氧基雌二醇-17β-脯氨酰胺类似物的抗增殖活性评价方法

(1)测试样品和癌细胞系

本发明2-甲氧基雌二醇-17β-脯氨酰胺类似物样品(共30种)及2-me分别用二甲基亚砜(dmso)配制成20mmol/l的原药储存液，在4℃冰箱中保存备用。实验前用质量百分含量10％fbs的rpmi-1640完全培养基(或dmem培养基)将其稀释成工作液，用0.22μm滤膜过滤后使用。

实验所选用癌细胞系为人宫颈癌hela细胞、人卵巢癌细胞skov3、人乳腺癌细胞mcf-7、人前列腺癌细胞pc-3和人食管癌细胞ec-109。其中人宫颈癌hela细胞在dmem培养基中培养，人卵巢癌细胞skov3、人乳腺癌细胞mcf-7、人前列腺癌细胞pc-3和人食管癌细胞ec109细胞在rpmi1640培养基中培养。

(2)实验方法

用mtt染色法检测30种2-甲氧基雌二醇类似物对不同癌细胞增殖的抑制作用，筛选出抑制效果较好的化合物。

取处于对数生长期的细胞，用胰酶消化，用配制好的rpmi-1640培养基配成细胞悬液，计数，并将细胞密度调整稀释至5×10⁴个/ml，取细胞悬液以100μl/孔z字形贴壁接种于96孔板中，边缘孔用200μl无菌pbs填充，以消除边缘效应。全部加完后，静置3min，将培养板置入37℃恒温、体积百分含量5％co2以及饱和湿度培养箱中培养24h。将待测药物分别用rpmi-1640培养基稀释至一定浓度，按需要设置调零组(空白培养基无细胞)、空白组(空白细胞悬液不加药)、溶剂组(加空白溶剂dmso)，吸出每个孔的培养基，加入200μl含药培养基(每个化合物设置七个药物浓度，分别为1.25μmol/l、2.5μmol/l、5μmol/l、10μmol/l、20μmol/l、40μmol/l、80μmol/l。药物浓度每个浓度设三个复孔)，加药后将培养板转入恒温co2培养箱中，在37℃、体积百分含量5％co2以及饱和湿度条件下培养72h。加药72h后，每个孔加入20μlmtt。继续培养4h后，吸出培养基，加入150μl的dmso，振荡均匀，用酶标仪在490nm处检测吸光度值，计算抑制率，计算公式如下：抑制率(％)＝(1-给药组吸光度数值/空白组吸光度数值)×100％。然后利用统计软件spss计算2-me衍生物对不同肿瘤细胞株的半数抑制浓度(ic50)，每组实验重复三次，数值用用抑制率(x±s)表示。

(3)实验结果

实验结果见表1和表2。

表1化合物对5种细胞的ic50值(μmol/l，72h)

由表1初步药理活性数据可知，本专利所提供的2-甲氧基雌二醇-17β-脯氨酰胺类似物表现出较好的抗肿瘤细胞增殖的作用，比如化合物a-1、b-1对hela细胞、skov3细胞、pc-3细胞、mcf-7细胞、ec-109细胞五种细胞都显示出较好的增殖抑制作用，活性优于或等于2-me。化合物a-7对pc-3细胞、mcf-7细胞、ec-109细胞三种细胞具有较好的选择性抑制作用，化合物b-7、a-8对mcf-7细胞、ec-109细胞两种细胞具有较好的选择性抑制作用，a-9对ec-109细胞具有选择性抑制活性。

实例6：2-甲氧基雌二醇-17β-脯氨酰胺(a-1)溶解度

(1)色谱条件

色谱柱：agilenteclipsexdb-c18柱(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相：甲醇-水(65:35，v/v)；

流速：0.8ml/min；

柱温：30℃；

检测波长：λ激发＝286nm,λ发射＝317nm；

进样量：20μl；

检测器：荧光检测器。

(2)药物溶解度的测定

分别称取0.5mg、1.0mg、2.0mg的化合物a-1各三份于西林瓶中，加入5ml超纯水，保鲜膜封口，于37℃恒温振摇72h，120r/min。取其饱和溶液4ml，离心4000rpm×10min，取上清液适量过0.45μm滤膜过滤，收集于液相进样瓶中，按(1)hplc测定条件进样。

(3)脂水分配系数的测定

精密称取化合物a-110.0mg置于10ml的容量瓶中，加入10ml的水饱和的正辛醇溶液定容至刻度，超声使其溶解，用0.45μm的有机微孔滤膜过滤除去不溶物，制成a-1水饱和的正辛醇溶液。量取5ml的a-1水饱和的正辛醇溶液，加入5ml的正辛醇饱和的去离子水。37℃下，恒温振摇72h，转速120rpm,使其达到分配平衡，离心，按含量测定方法下hplc测定条件测定分配平衡后水相药物浓度和有机相药物浓度。根据公式p＝co/cw到脂水分配系数。

表22-me及其衍生物a-1的溶解度比较(37℃)

从表2实验结果可以看出，2-甲氧基雌二醇-17β-脯氨酰胺(a-1)的水溶性明显优于2-me，此类衍生物能有效改善2-me水溶性差的缺点。

实例7：化合物2-甲氧基雌二醇-17β-脯氨酰胺(a-1)的药代动力学研究

(1)材料和试剂

测试本发明化合物a-1；对照药2-甲氧基雌二醇(2-me)；

spf大鼠(清洁级)，体重200±20g，雌雄各半，由郑州大学实验动物中心提供。

(2)实验方法

取spf级大鼠12只，随机分成2组(a-1和2-me组)，每组6只，大鼠给药前禁食12h，自由饮水，分别尾缘静脉注射给药，a-1和2-me分别用氢化蓖麻油：乙醇：生理盐水＝l：2：7的溶剂溶解后，以10mg/kg体重给药量给药，给药前先取约0.5ml空白血浆，在给药后5、10、15、30、45、60、90、120、180、240、480、720min几个时间点从大鼠的眼眶静脉丛取血约0.5ml，置于肝素化的离心管中，4000rmp离心10min，吸取200μl上层血浆进行样品处理，按照建立的色谱条件进行操作，根据标准曲线计算血药浓度。

(3)数据处理和结果

根据pksolver软件对这化合物的血药浓度数据进行拟合，可以看出a-1和2-me的血药浓度模型为二室模型，a-1的半衰期为246.8min，比2-me的半衰期(26.9min)显著延长。

2-甲氧基雌二醇-17β-脯氨酰胺(a-1)及其类似物有待进行更深入的药物活性评价，很有希望获得临床疗效较好的抗肿瘤药物，用于抗乳腺癌、抗前列腺癌、抗卵巢癌、抗宫颈癌或抗食管癌等抗肿瘤药物制剂的开发。