一种表达拉沙热病毒空衣壳的重组病毒及其制备方法与流程

本发明涉及免疫学及基因工程领域。具体涉及一种表达拉沙热病毒空衣壳的重组病毒及其制备方法。

背景技术：

拉沙热(lassafever)是一种急性烈性病毒性(lassavirus，lasv)传染病，据统计，每年感染者20～50万人，造成0.5～1万人死亡，受威胁人口达3700万。目前尚没有批准的商业化拉沙热疫苗，众多拉沙热候选疫苗尚处于实验室研究阶段。

lasv是一种两节段的单股负链rna，分别是3.4kb的s链和7.2kb的l链，编码5个结构蛋白。s链的两个基因编码核蛋白np、糖蛋白gp1和gp2。l链的两个基因编码病毒聚合酶蛋白(l)和z蛋白。gp1与gp2蛋白，是由g因编码的前体糖蛋白gpc经翻译后裂解而来，以四聚体形式构成表面纤突，与病毒的中和作用有关。lasv根据gpc和np基因分为五个基因型和多个血清型，不同型病毒之间可能有一定的交叉保护，但无法达到完全保护。

应用病毒样颗粒和重组病毒载体作为疫苗逐渐商业化，特别是在生物安全要求高的急性烈性病毒疫苗中受到格外重视。

随着基因工程技术的发展，特别是1982年，paoletti和moss首次成功应用痘苗病毒作为载体在哺乳动物中表达外源基因以来，该载体被广泛用于重组活病毒载体疫苗的研究。1987年，表达狂犬病病毒g基因的重组痘苗病毒首先获准在野生动物中使用，并成功控制了欧洲和北美地区野生动物狂犬病；1994年美国批准批量生产表达新城疫病毒的hn和f蛋白基因的重组痘苗病毒疫苗，成为第一个商业活载体疫苗；1995年美国农业部正式批准重组鸡痘病毒活载体苗vaxfp-n的商品化。

随着重组痘病毒在兽医药领域的成功应用，现开始倾向于开发具有宿主特异性的痘病毒载体，如金丝雀痘病毒、猪痘病毒、羊痘病毒等；而在医药领域，痘病毒因其具有重要的经济价值、良好的安全性而成为重组病毒载体热点之一，1996年美国启动了用于治疗恶性黑色素瘤的重组痘苗病毒aldesleukin的i期临床试验，并于2001年完成了该项目的ii期临床试验，迄今，全球有百余项以重组痘苗病毒为生物制剂的研究处于医学临床试验阶段，涉及癌症、烈性传染病等多种疾病的预防和治疗领域，如2019年4月t601(重组溶瘤痘苗病毒注射液)取得临床批件。

痘苗病毒基因组由线性、双股dna所组成的，at含量约为75％，病毒核酸无感染力。和其他痘病毒一样，痘苗病毒基因组包括中间编码区和两端相同的反向末端重复序列，其编码147个开放阅读框，编码密度为93％。痘苗病毒作为病毒载体的优点:作为预防或治疗性生物制剂的安全性已被大量的动物和人体试验证明；基因组容量大，可以插入25kbp的外源基因；重组痘病毒表达的蛋白存在加工、修饰及转移过程，抗原性保存较好；宿主范围广，痘病毒能感染包括人、鼠等在内的大多数哺乳动物，也可以在相应的疫苗生产细胞系中繁殖，特别适合作为预防人兽共患传染病及自然疫源性传染病的载体。另外，痘病毒特别适合在发展中国家推广使用，痘病毒较为稳定，冻干成本低、易于保存，从而易于生产和使用，重组痘苗病毒疫苗还易于区分自然感染和免疫接种个体。

目前尚没有一种以重组病毒为载体的拉沙热病毒空衣壳候选疫苗，能交叉保护任一基因型或血清型的拉沙热病毒感染，对于保护多种基因型或血清型的拉沙热病毒感染的疫苗尚未见报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题为获得表达拉沙热病毒空衣壳的重组痘苗病毒，尤其是表达的拉沙热病毒空衣壳免疫动物后能提供对多种基因型或血清型的拉沙热病毒感染的保护。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种重组病毒的构建方法。

本发明重组病毒的构建方法，包括如下步骤：

将转移质粒与痘病毒共转染宿主细胞，得到重组病毒；

所述转移质粒包含以痘病毒严格的非必需区基因的上、下游同源臂为基础构建的重组dna分子，所述重组dna分子包括拉沙热病毒结构蛋白z基因、拉沙热病毒结构蛋白gpc基因和拉沙热病毒结构蛋白np基因。

本发明构建方法中，所述拉沙热病毒结构蛋白z基因、拉沙热病毒结构蛋白gpc基因和拉沙热病毒结构蛋白np基因均位于所述痘病毒严格的非必需区基因的上、下游同源臂之间。这样，所述拉沙热病毒结构蛋白z基因、拉沙热病毒结构蛋白gpc基因和拉沙热病毒结构蛋白np基因可以通过以同源重组的方式插入到痘病毒严格的非必需区基因的上、下游同源臂之间。所述拉沙热病毒结构蛋白z基因、拉沙热病毒结构蛋白gpc基因和拉沙热病毒结构蛋白np基因构建在独立的表达盒中，每个表达盒的启动子可为pe/l，终止子可为t5nt。

上述构建方法中，所述拉沙热病毒结构蛋白z基因编码的蛋白质的氨基酸序列为seqidno.2，所述拉沙热病毒结构蛋白gpc基因编码的蛋白质的氨基酸序列为seqidno.3和所述拉沙热病毒结构蛋白np基因编码的蛋白质的氨基酸序列为seqidno.4。

上述构建方法中，所述拉沙热病毒结构蛋白z基因的编码序列为seqidno.1第508-807位的反向互补序列、所述拉沙热病毒结构蛋白gpc基因的编码序列为seqidno.1第888-2363位和所述拉沙热病毒结构蛋白np基因的编码序列为seqidno.1第2412-4088位。

上述构建方法中，所述重组dna分子中各基因的顺序依次为拉沙热病毒结构蛋白z基因、拉沙热病毒结构蛋白gpc基因和拉沙热病毒结构蛋白np基因。

上述构建方法中，所述重组dna分子还包含两个loxp位点和位于loxp位点之间的筛选标记蛋白基因。所述筛选标记蛋白基因构建在一个独立的表达盒中，所述表达盒的启动子为pe/l，终止子为t5nt，所述loxp位点分别位于所述表达盒的两侧。

具体的，所述筛选标记蛋白基因可以为绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因或黄色荧光蛋白基因。在本发明具体的实施方式中，所述loxp位点的序列如seqidno.1第4096-4129位所示，所述筛选标记蛋白基因为seqidno.1第4170-4889位所示的绿色荧光蛋白基因(egfp)。

上述构建方法中，所述构建方法还包括将pvax1-cre质粒和重组病毒共转染宿主细胞，得到不含筛选标记蛋白基因的重组病毒。

本发明中利用cre/loxp系统实现对外源筛选标记egfp基因的敲除。

上述构建方法中，所述痘病毒严格的非必需区基因为胸苷激酶tk基因。在本发明具体的实施方式中，所述胸苷激酶tk基因的上游同源臂的核苷酸序列如seqidno.1第1-500位所示，所述胸苷激酶tk基因的下游同源臂的核苷酸序列如第4930-5945位所示。

上述构建方法中，所述痘病毒可为痘苗病毒天坛株。

上述构建方法中，所述宿主细胞为mrc-5(no.ccl171)细胞、vero(no.ccl81)细胞、鸡胚原代上皮细胞或bhk-21(no.ccl10)细胞。

上述构建方法构建得到的重组病毒也在本发明的保护范围之内。

本发明进一步提供了重组病毒产生的重组拉沙热病毒样颗粒(即拉沙热病毒空衣壳)。

上述重组拉沙热病毒样颗粒在制备拉沙热疫苗中的应用也在本发明的保护范围之内。

上述重组拉沙热病毒样颗粒在制备预防和/或治疗拉沙热的产品中的应用也在本发明的保护范围之内。

上述重组拉沙热病毒样颗粒在制备预防和/或治疗痘病毒所引起的疾病的产品中的应用。

其中，所述痘病毒可以为痘苗病毒亚属的病毒，所述痘苗病毒亚属的病毒包括天花病毒、痘苗病毒和猴痘病毒，所述天花病毒引起的疾病为天花，所述猴痘病毒引起的疾病为猴痘。

本发明进一步还提供了一种转移载体。

本发明所述转移质粒包含以痘病毒严格的非必需区基因的上、下游同源臂为基础构建的重组dna分子，所述重组dna分子包括拉沙热病毒结构蛋白z基因、拉沙热病毒结构蛋白gpc基因和拉沙热病毒结构蛋白np基因。

上述转移质粒中，所述拉沙热病毒结构蛋白z基因编码的蛋白质的氨基酸序列如seqidno.2所示，所述拉沙热病毒结构蛋白gpc基因编码的蛋白质的氨基酸序列如seqidno.3所示和所述拉沙热病毒结构蛋白np基因编码的蛋白质的氨基酸序列如seqidno.4所示。

上述转移质粒中，所述拉沙热病毒结构蛋白z基因的编码序列为seqidno.1第508-807位的反向互补序列、所述拉沙热病毒结构蛋白gpc基因的编码序列为seqidno.1第888-2363位和所述拉沙热病毒结构蛋白np基因的编码序列为seqidno.1第2412-4088位。

上述转移质粒中，所述重组dna分子中各基因的顺序依次为拉沙热病毒结构蛋白z基因、拉沙热病毒结构蛋白gpc基因和拉沙热病毒结构蛋白np基因。

上述转移质粒中，所述重组dna分子还包含两个loxp位点和位于loxp位点之间的筛选标记蛋白基因。具体的，所述筛选标记蛋白基因可以为绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因或黄色荧光蛋白基因。在本发明具体的实施方式中，所述loxp位点的序列如seqidno.1第4096-4129位所示(与第4897-4930位所示序列相同)，所述筛选标记蛋白基因为seqidno.1第4170-4889位所示的绿色荧光蛋白基因(egfp)。

在本发明具体的实施方式中，所述转移质粒为转移质粒pbstklsvlp，该转移质粒以pbluescript为骨架载体，克隆入以痘病毒严格的非必需区基因即胸苷激酶tk基因的上、下游同源臂为基础构建的重组dna分子构建得到转移质粒，中间依次插入四个独立的以pe/l为启动子和以t5nt为终止子的外源基因表达盒，所述外源基因分别为优化后的拉沙热病毒结构蛋白z、gpc、np的基因及外源筛选标记蛋白egfp的基因(其中，筛选标记蛋白egfp的基因表达盒的两侧还含有loxp基因)，分别表达拉沙热病毒结构蛋白z、gpc、np及筛选标记蛋白egfp。

所述转移质粒pbstklsvlp的部分核苷酸序列如seqidno.1所示，其中，seqidno.1第1-500位为tk基因的上游同源臂l序列，seqidno.1第501-507位为终止子t5nt序列的反向互补序列、seqidno.1第508-807位为优化后的拉沙热病毒结构蛋白z的基因的反向互补序列、seqidno.1第808-847位为启动子pe/l序列的反向互补序列、seqidno.1第848-887位为启动子pe/l序列、seqidno.1第888-2363位为优化后的拉沙热病毒结构蛋白gpc的基因序列、seqidno.1第2364-2370位为终止子t5nt序列、seqidno.1第2371-2410位为启动子pe/l序列、seqidno.1第2411-4088位为优化后的拉沙热病毒结构蛋白np的基因序列(seqidno.1第2412-4088位为优化后的拉沙热病毒结构蛋白np的基因序列的编码序列)、seqidno.1第4089-4095位为终止子t5nt序列、seqidno.1第4096-4129位为loxp基因、seqidno.1第4130-4169位为启动子pe/l序列、seqidno.1第4170-4889位为外源筛选标记蛋白egfp的基因序列、seqidno.1第4890-4896位为终止子t5nt序列、seqidno.1第4897-4930位为loxp基因、seqidno.1第4931-5945位为tk基因的下游同源臂r序列。

本发明重组病毒通过敲除痘病毒严格的非必需区提高了临床应用的安全性，能稳定存在且在早、晚期全程高效产生拉沙热病毒空衣壳；将该疫苗免疫小鼠和恒河猴，均能产生高滴度的抗拉沙热病毒抗体，阻断不同型拉沙热病毒假病毒对敏感细胞的感染。

附图说明

图1为本发明转移质粒结构示意图。

图2为本发明egfp基因删除与否的重组痘苗病毒图；左图为删除egfp基因的重组痘苗病毒，右图为含有egfp基因的重组痘苗病毒。

图3为sds-page电泳图；其中，样品1为痘苗病毒天坛株，样品2为不含有egfp基因的重组痘苗病毒，m为marker。

图4为western-blot检测图；其中，样品1为痘苗病毒天坛株，样品2为不含有egfp基因的重组痘苗病毒。

图5为本发明微量快速荧光灶抑制试验法中的假病毒荧光图；左图为对照血清中和后的假病毒，右图为重组病毒免疫小鼠血清中和后的假病毒。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中涉及到的细胞、毒株与载体的来源：

mrc-5(no.ccl171)细胞、vero(no.ccl81)细胞主要是制备人用疫苗的病毒种子；原代鸡胚上皮细胞、bhk-21(no.ccl10)细胞主要是制备兽用疫苗的病毒种子。mrc-5(no.ccl171)细胞、vero(no.ccl81)细胞、bhk-21(no.ccl10)购自atcc，原代鸡胚上皮细胞购买spf鸡胚后根据现有方法制备。

受体菌e.colijm109、dh5α购自北京全式金生物技术有限公司。

痘苗病毒天坛株为中国疾病预防控制中心病毒学研究所的产品，记载于非专利文献“阮力.痘苗病毒天坛株载体研究与应用概述[j].微生物与感染,2013,8(01):2-8.”中。

质粒pbluescript购自agilent公司，货号为212250。

质粒pvax1购自invitrogen公司，货号为v260-20。

pvax1-cre质粒购自biovectorsciencelab公司，货号为99249。

三质粒慢病毒包装体系(包括拉沙热病毒gpc核酸疫苗、plv、phelper1.0)购自北京英茂盛业生物科技有限公司，货号为klv3501。

293v慢病毒包装细胞购自北京英茂盛业生物科技有限公司，货号为c1201。

下述实施例中涉及到感受态细胞的制备与转化、质粒的提取、限制性内切酶消化dna片段的回收、dna片段的连接、重组质粒的筛选与鉴定、pcr等基因工程实验参照《分子克隆》第2版相关章节进行。假病毒的制备和纯化参照试剂盒说明书进行。

实施例1痘苗病毒穿梭载体/转移质粒pbstklsvlp的构建

本发明转移质粒pbstklsvlp的结构示意图如图1所示，该转移质粒是以pbluescript为骨架载体，克隆入基因构件(即重组dna分子)构建，具体步骤如下：

一、痘苗病毒基因插入区的筛选，即痘苗病毒天坛株内严格非必需区tk基因的确定

1、外源基因插入区初步筛选

根据genbank公布的痘苗病毒天坛株全基因序列(genbank号为af095689.1)，对基因间区进行筛选，在分析、评估的基础上，初步确定将天坛株的非必需区l79784-80283、r80841-81855(tj2r)，也可选择其他非必需区如l138353-138861、r139585-140607(ta35l)核苷酸之间作为外源基因插入区。

2、获得痘病毒严格的非必需区基因tk基因的上游同源臂臂l和下游同源臂r

根据genbank中公布的痘苗病毒天坛株全基因序列(genbank号为af095689.1)，对痘苗病毒天坛株胸苷激酶tk基因及其侧翼序列进行分析和同源性比较后，根据同源序列的长度与重组效率的关系，选择两段长度大于等于500bp的核苷酸序列，并添加合适的酶切位点，获得上游同源臂l(seqidno.1第1-500位)和下游同源臂r(seqidno.1第4931-5945位)。

二、获得转移质粒pbstklsvlp中的基因构件

全基因合成转移质粒pbstklsvlp中的基因构件，基因构件是以痘病毒严格的非必需区基因即胸苷激酶tk基因的上、下游同源臂(tkl和tkr)为基础，中间依次插入四个独立的以pe/l为启动子和以t5nt为终止子的外源基因表达盒，外源基因分别优化后的拉沙热病毒结构蛋白z、gpc、np的基因及外源筛选标记蛋白egfp的基因(其中，筛选标记蛋白egfp的基因表达盒的两侧还含有loxp基因)，分别表达拉沙热病毒结构蛋白z、gpc、np及筛选标记蛋白egfp构建的重组dna分子；所述转移质粒pbstklsvlp中基因构件的序列如seqidno.1所示，其中，seqidno.1第1-500位为tk基因的上游同源臂l序列，seqidno.1第501-507位为终止子t5nt序列的反向互补序列、seqidno.1第508-807位为优化后的拉沙热病毒结构蛋白z的基因的反向互补序列、seqidno.1第808-847位为启动子pe/l序列的反向互补序列、seqidno.1第848-887位为启动子pe/l序列、seqidno.1第888-2363位为优化后的拉沙热病毒结构蛋白gpc的基因序列、seqidno.1第2364-2370位为终止子t5nt序列、seqidno.1第2371-2410位为启动子pe/l序列、seqidno.1第2411-4088位为优化后的拉沙热病毒结构蛋白np的基因序列(seqidno.1第2412-4088位为优化后的拉沙热病毒结构蛋白np的基因序列的编码序列)、seqidno.1第4089-4095位为终止子t5nt序列、seqidno.1第4096-4129位为loxp基因、seqidno.1第4130-4169位为启动子pe/l序列、seqidno.1第4170-4889位为外源筛选标记蛋白egfp的基因序列、seqidno.1第4890-4896位为终止子t5nt序列、seqidno.1第4897-4930位为loxp基因、seqidno.1第4931-5945位为tk基因的下游同源臂r序列。所述拉沙热病毒结构蛋白z基因编码的蛋白质的氨基酸序列如seqidno.2所示，所述拉沙热病毒结构蛋白gpc基因编码的蛋白质的氨基酸序列如seqidno.3所示和所述拉沙热病毒结构蛋白np基因编码的蛋白质的氨基酸序列如seqidno.4所示。

三、将seqidno.1所示的基因构件克隆入质粒pbluescript的多克隆位点，构建得到pbstklsvlp，采用分光光度法测定核酸的浓度，且0d260/280在1.8～2.0之间，-20℃保存备用。

实施例2重组痘苗病毒的筛选和鉴定

一、细胞培养、消化传代及细胞计数

mrc-5(no.ccl171)细胞用含5％fcs的完全mem培养液，于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养。待mrc-5细胞在培养瓶中长成单层后，在无菌的条件下将培养瓶内的mem完全培养液倾出，加少量的0.25％胰酶溶液洗两次，然后加少量胰酶静置消化至壁上细胞全部脱落下来，每个培养瓶中加一定体积的5％fcs的mem完全培养液，吹打混匀后，分装于六孔板的培养孔中或培养瓶中，置37℃、5％二氧化碳培养箱中培养，得到细胞悬液。

取细胞悬液0.1m1，适当稀释后滴入血细胞计数板内，按白细胞计数法计四个角的四大格内细胞总数。计数时仅计数细胞核和细胞浆完整的细胞，成堆的细胞按一个细胞计算。将4大方格内的细胞总数按红细胞目视计数法的计算公式换算成每毫升细胞悬液中的细胞数。

二、痘苗病毒天坛株病毒滴度测定

制备mrc-5单层细胞，以3万个/m1细胞覆盖于96孔细胞培养板，每孔100μl培养至细胞长成融合单层。弃去培养液，以不含血清的mem培养液洗细胞两次，将痘苗病毒天坛株以不含血清的mem维持液作10倍比稀释，然后每孔依次接100μ1病毒稀释液，每个梯度设三个重复，同时设空白对照，37℃、5％二氧化碳温箱吸附2小时。然后加入100u1含5％fcs的mem完全培养液(内含1％的低熔点琼脂)，在37℃、5％二氧化碳温箱继续培养96小时，得到病毒增殖液。

在倒置荧光显微镜下直接观察每个稀释度的蚀斑形成情况，按公式计算出每毫升病毒液中所含的蚀斑形成单位(plaqueformingunits,pfu)。

三、转染与同源重组

培养板的细胞孔中接种步骤一得到的mrc-5的细胞悬液，当细胞长至80％融合时，感染0.1moi的步骤二得到的痘苗病毒天坛株的病毒液，37℃、5％二氧化碳感染1～2小时(每半小时轻轻摇晃培养板一次)；取100μ10pti-mem加入实施例1制备的转移质粒pbstklsvlp10μg混匀，得到混合物a；另在100μlopti-mem中，加入8μ1脂质体，轻轻混匀，室温静置5min，得到混合物b。然后将混合物b缓慢滴加于混合物a中，轻轻混匀，室温作用20分钟后加入培养板的细胞孔中培养得到的细胞中，37℃、5％二氧化碳培养6小时，更换新鲜配制的含5％fcs的mem，继续培养24小时，然后弃去感染液加入1％低熔点琼脂糖的mem培养基，72小时后，得到病毒蚀斑，于倒置荧光显微镜下观察否有绿色荧光出现。

以未转染转移质粒pbstklsvlp的痘苗病毒天坛株为阴性对照，同样于倒置荧光显微镜下观察否有绿色荧光出现。

荧光检测结果表明，转染转移质粒pbstklsvlp的痘苗病毒天坛株有绿色荧光出现，即能够高效表达外源基因，而阴性对照无荧光出现，初步确定获得了重组痘苗病毒。

四、重组痘苗病毒的基因组测序鉴定

将以上具有荧光的病毒蚀斑，反复冻融，裂解细胞，释放出病毒，3000～6000rpm离心去除细胞或细胞碎片。取上清采用《柱式病毒基因组抽提试剂盒》(qiagen)提取重组痘苗病毒基因组，方法参见试剂盒说明书。送生工生物工程股份有限公司测序，确定整合位点和序列正确与否。

基因组测序检测结果表明，拉沙热病毒结构蛋白z基因、拉沙热病毒结构蛋白gpc基因和拉沙热病毒结构蛋白np基因以及egfp基因已整合进痘苗病毒天坛株tk基因的上、下游同源臂之间，确定获得了含有egfp基因的重组痘苗病毒。

五、转染与egfp基因删除

培养板的细胞孔中接种步骤一得到的mrc-5的细胞悬液，当细胞长至80％融合时，感染0.1moi的步骤四获得的重组痘苗病毒，37℃、5％二氧化碳感染1～2小时(每半小时轻轻摇晃培养板一次)，然后用pvax1-cre质粒转染细胞。取100μ10pti-mem加入pvax1-cre质粒dna10μg混匀；另在100μlopti-mem中，加入8μ1脂质体，轻轻混匀，室温静置5min。然后将后者缓慢滴加于前者中，轻轻混匀，室温作用20分钟后加入细胞孔中，37℃、5％二氧化碳培养6小时，更换新鲜配制的含5％fcs的mem，继续培养24小时，然后弃去感染液加入1％低熔点琼脂糖的mem培养基，72小时后，得到病毒蚀斑，于倒置荧光显微镜下观察蚀斑是否有绿色荧光出现。

荧光检测结果如图2所示，结果表明，与步骤四获得的含有egfp基因的重组痘苗病毒相比，无绿色荧光出现，初步确定获得了删除egfp基因的重组痘苗病毒。

六、重组痘苗病毒的鉴定

收获以上没有荧光的病毒蚀斑，反复冻融，裂解细胞，释放出病毒，3000～6000rpm离心去除细胞或细胞碎片。取上清采用《柱式病毒基因组抽提试剂盒》(qiagen)提取重组痘苗病毒基因组，方法参见试剂盒说明书。送生工生物工程股份有限公司测序，确定egfp基因删除与否及其余序列正确与否。

基因组测序检测结果表明，egfp基因被删除，且不影响其他基因，确定获得了不含有egfp基因的重组痘苗病毒。

实施例4重组痘苗病毒表达的拉沙热病毒结构蛋白及空衣壳组装检测

一、sds-page电泳

制备单层vero(no.ccl81)细胞，弃去上清，加入1％实施例3得到的不含有egfp基因的重组痘苗病毒，温度37℃感作2小时，充分吸附后，加入含6～8％胎牛血清的199培养基继续培养，直至14小时后病变明显，用pbs清洗细胞后，加无血清培养基继续培养24小时，反复冻融3次，收获感染重组病毒的vero细胞和上清，取上清90μ1，加入4×sds-page上样缓冲液，混匀，煮沸10分钟，制备电泳样品，12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，结束后，染色1小时，脱色过夜，观察图谱。

将不含有egfp基因的重组痘苗病毒替换为痘苗病毒天坛株，同样的方法进行试验，作为对照。

电泳结果如图3所示，结果显示:重组痘苗病毒株在75kd、60kd、12kd附近位置有与gpc、np和z蛋白大小相当的条带，而痘苗病毒天坛株中无对应条带。

二、western-blot检测

将不含有egfp基因的重组痘苗病毒的sds-page电泳胶，100v45分钟转印pvdf膜，5％脱脂乳pbs封闭过夜，pbs作为稀释液，1:50的拉沙热患者康复血清，温度37℃结合1小时，pbs充分洗涤，二抗hrp-山羊抗人igg(1:1000稀释)温度37℃结合1小时，dab显色，观察图谱。

将不含有egfp基因的重组痘苗病毒替换为痘苗病毒天坛株，同样的方法进行试验，作为对照。

western-blot检测如图4所示，结果显示：重组痘苗病毒(样品2)在75kd、60kd、12kd附近位置有与gpc、np和z蛋白大小相当的条带，而痘苗病毒天坛株(样品1)中无对应条带，结果表明重组痘苗病毒与拉沙热患者康复血清能有效识别，而痘苗病毒天坛株不能与拉沙热患者康复血清进行识别。

三、电镜检测空衣壳

将步骤一感染重组痘苗病毒的vero细胞，pbs洗涤3次，预留pbs约1ml，反复冻融3次，收集1ml细胞培养物，温度4℃条件下12,000rpm离心1min，取上清液约lml，加入10μl康复血清，温度37℃作用30分钟，迅速放置温度4℃平衡1小时，温度4℃条件下12，000rpm离心30min，弃上清液900ul，留100u1上清溶解沉淀作为电镜样品，磷钨酸负染色，于透射电境下观察。

将不含有egfp基因的重组痘苗病毒替换为痘苗病毒天坛株，同样的方法进行试验，作为对照。

免疫电镜检测显示：不含有egfp基因的重组痘苗病毒样本中能观察到长度7-10nm左右大小的病毒样颗粒，痘苗病毒天坛株对照样品中观察不到相应颗粒。

上述检测结果均支持不含有egfp基因的重组痘苗病毒不但表达了拉沙热病毒结构蛋白，而且能组装为空衣壳，因此，本发明重组痘苗病毒的构建方法成功筛选到了在宿主细胞体内表达、组装拉沙热病毒空衣壳的重组痘苗病毒。

实施例5拉沙热病毒假病毒的制备与检测

一、拉沙热病毒假病毒的制备与检测

按照三质粒慢病毒包装体系操作说明书，将拉沙热病毒gpc核酸疫苗、plv、phelper1.0三个质粒转染293v慢病毒包装细胞，包装拉沙热病毒假病毒，获得拉沙热病毒假病毒，建立假病毒库，使用vero细胞测定效价，假病毒滴度1×10^5-7ffu/ml。

二、免疫健康动物

采用皮下免疫策略，免疫经检疫合格的spf级balb/c小鼠5只，每只10^3-5pfu实施例3得到的不含有egfp基因的重组痘苗病毒，间隔21～28天，采集血清，-70℃以下保存备用。

以没有免疫的经检疫合格的spf级balb/c小鼠的血清作为对照。

采用皮下免疫策略，免疫经检疫合格的恒河猴5只，每只10^4-6pfu实施例3得到的不含有egfp基因的重组痘苗病毒，间隔21～28天，采集血清，-70℃以下保存备用。

以没有免疫的经检疫合格的恒河猴的血清作为对照。

三、拉沙热病毒中和抗体效价测定

采用微量快速荧光灶抑制试验法测定抗拉沙热病毒特异性免疫球蛋白中和抗体效价，具体方法如下：

(1)取一块96孔板横向使用，每块板可做6份待测血清，对待检血清进行系列稀释。96孔板每孔加入50μl稀释液；a1-a12:每孔加入相应样品50μl，由a行混匀后吸50μl至b行混匀，依次混匀稀释至g行，吸取g行的抗体50μl弃掉；h1-h6加入相应待测血清样品50μl，混匀；细胞对照孔补加抗体稀释液50μl，混匀。

(2)将拉沙热病毒假病毒稀释至100ffu/0.05ml，取50μl垂直悬滴入96孔板(血清、细胞对照除外)的各孔中；另取1.5ml25000ffu/0.05ml病毒于小离心管中，4℃暂存，待回测病毒滴度；

(3)将细胞培养板轻拍混匀，至37℃中和1小时；

(4)病毒滴度回测：取4支小管，每管加0.9ml稀释液，吸取0.1ml100ffu/0.05ml拉沙热病毒假病毒加入第1管中，混匀后作为10ffu/0.05ml，依次10倍稀释至1ffu/0.05ml；另取一96孔板，将每个稀释度的病毒每孔加入0.1ml，并做8个复孔；同时留出4孔做为细胞对照孔，每孔加入0.1ml病毒稀释液；

(5)用消化液消化细胞，制备成2×10⁵个/ml的细胞悬液，每孔分别加入0.1ml细胞悬液，混匀，放入35℃，5％co2孵箱中孵育培养；放荧光显微镜计数荧光灶值，并记录病毒滴定结果，以抑制50％荧光灶的血清最高稀释度的倒数为终点效价，2天后判定最终结果。

结果判定依据：当最高稀释度血清的2孔中有1孔出现荧光灶，另一孔不出现荧光灶，该稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价；当高稀释度2孔出现荧光灶，相邻低稀释度2孔完全不出现荧光灶，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价；当两个相邻稀释度血清均出现1孔荧光灶，另1孔不出现荧光灶，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价。注意：如果病毒回滴结果不在32～320ffu/0.05ml的范围内，实验无效，重复实验。

结果如图5所示，得到的小鼠血清中和拉沙热病毒假病毒的抗体效价分别为1：512、1：256、1：128、1：512和1：256。

恒河猴血清中和拉沙热病毒假病毒的抗体效价分别为1：256、1：128、1：512、1：256和1：528。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

sequencelisting

<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120>一种表达拉沙热病毒空衣壳的重组病毒及其制备方法

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