人体皮肤菌群DNA的提取方法与流程

本申请涉及dna提取
技术领域：
，尤其涉及一种人体皮肤菌群dna的提取方法。
背景技术：
：人体的皮肤表面生活着许多肉眼看不到的微生物，而这些微生物与人体健康和疾病关系密切，特别是对皮肤的健康至关重要。为了研究皮肤到底存在哪些种类的微生物影响人体健康，用棉拭子擦拭皮肤取样后，进行皮肤菌群dna的提取是最关键的一步，直接关系到后续测序和分析结果。现有皮肤菌群dna多用商品化的试剂盒进行提取，但是皮肤菌群专用试剂盒价格昂贵，提取步骤繁琐，对样本质量要求较高，因此，发明一种简单、价格低廉、效果优越的人体皮肤菌群dna提取方法十分必要。技术实现要素：本申请提供了一种人体皮肤菌群dna的提取方法，以提供一种简单、价格低廉、效果优越的人体皮肤菌群dna提取方法。为了解决上述技术问题，本申请实施例公开了如下技术方案：本申请提供了一种人体皮肤菌群dna的提取方法，其特征在于，包括：将取样后的拭子置于细菌保存液中得到菌液a，将所述菌液a涡旋振荡使菌群脱离所述拭子得到菌液b；将所述菌液b通过离心使菌群沉降于第一离心管的底部；向所述第一离心管中加入预热的ctab溶液得到菌液c，将所述菌液c涡旋振荡、加热处理后得到菌液d；向所述菌液d中加入酚仿混合液，经涡旋振荡后得到菌液e；移取所述菌液e的上清液至第二离心管内，向所述第二离心管内加入试剂盒的缓冲液后混合均匀得到菌液f；将全部所述菌液f依次过试剂盒的吸附柱至菌群dna吸附于所述吸附柱上；向所述吸附柱内加入试剂盒的洗涤液后得到菌液g；将所述菌液g移至第三离心管内，向所述第三离心管内加入预热的洗脱液、离心后得到皮肤菌群dna。可选的，所述试剂盒为sanprep柱式dna胶回收试剂盒。可选的，所述将取样后的拭子置于细菌保存液中得到菌液a，将所述菌液a涡旋振荡使菌群脱离所述拭子得到菌液b，包括：将从皮肤表面取样后的拭子保存于细菌保存液中得到菌液a；将所述菌液a于涡旋振荡器最大档位涡旋振荡至菌群完全脱离所述拭子得到菌液b。可选的，所述将所述菌液b通过离心使菌群沉降于第一离心管的底部，包括：量取所述菌液b至第一离心管内，将所述第一离心管以转速为12000rpm离心至所述第一离心管的底部体系稳定。可选的，所述向所述第一离心管中加入预热的ctab溶液得到菌液c，将所述菌液c涡旋振荡、加热处理后得到菌液d，包括：向所述第一离心管内加入温度为65℃的ctab溶液得到菌液c；将所述菌液c于涡旋振荡器最大档位涡旋振荡10s后，置于95℃的金属浴中加热10min得到菌液d。可选的，所述向所述菌液d中加入酚仿混合液，经涡旋振荡后得到菌液e，包括：所述酚仿混合液包括饱和酚、氯仿及异戊醇，其中所述饱和酚、氯仿及异戊醇的质量份数比为25：24：1。可选的，所述移取所述菌液e的上清液至第二离心管内，向所述第二离心管内加入试剂盒缓冲液后混合均匀得到菌液f，包括：所述菌液e的上清液与所述试剂盒缓冲液的体积比为1:3；所述试剂盒缓冲液为bufferb2。可选的，所述将全部所述菌液f依次过吸附柱至菌群dna吸附于所述吸附柱上，包括：移取第一部分所述菌液f中吸附柱，所述吸附柱以转速为12000rpm离心；移取第二部分所述菌液f中吸附柱，所述吸附柱以转速为12000rpm离心。可选的，所述向所述吸附柱内加入试剂盒的洗涤液后得到菌液g，包括：所述洗涤液为washsolution。可选的，所述将所述菌液g移至第三离心管内，向所述第三离心管内加入预热的洗脱液、离心后得到皮肤菌群dna，包括：所述洗脱液的温度为65℃。与现有技术相比，本申请的有益效果为：本申请将ctab-酚仿法与试剂盒有机结合，既利用了ctab与蛋白和多聚糖形成复合物，酚仿将其抽提去除，留下dna，又利用了吸附柱多次洗涤，去除杂质，得到高质量的dna，以达到后续建库及高通量测序的要求；(1)操作简单：本发明与现有的皮肤菌群总dna提取试剂盒相比，操作简便，不需要特殊的仪器设备及配件。(2)价格低廉：现有皮肤菌群dna提取试剂盒价格昂贵，一般一个样本需要花费试剂200元左右，而用本发明方法提取，一个样本仅需50元左右；(3)效果优越：现有技术对于棉拭子采样的皮肤菌群总dna提取，效果不理想，绝大多数dna质量达不到pcr扩增的要求，而用本发明提取的dna都能pcr扩增出准确的目的条带，并且dna浓度纯度都能满足高通量测序要求。应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本申请。附图说明为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本申请提供的人体皮肤菌群dna的提取方法的流程示意图；图2为本申请实施例提供的提取方法dna与传统提取方法dna比照的电泳图。具体实施方式为了使本
技术领域：
的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。参考图1，图1为本申请提供的人体皮肤菌群dna的提取方法的流程示意图；从图中可以看出本申请提供了人体皮肤菌群dna的提取方法，包括：s110：将取样后的拭子置于细菌保存液中得到菌液a，将所述菌液a涡旋振荡使菌群脱离所述拭子得到菌液b。将从皮肤表面取样后的拭子保存于细菌保存液中得到菌液a；将所述菌液a于涡旋振荡器最大档位涡旋振荡至菌群完全脱离所述拭子得到菌液b。s120：将所述菌液b通过离心使菌群沉降于第一离心管的底部。量取所述菌液b至第一离心管内，将所述第一离心管以转速为12000rpm离心至所述第一离心管的底部体系稳定。s130：向所述第一离心管中加入预热的ctab(十六烷基三乙基溴化铵)溶液得到菌液c，将所述菌液c涡旋振荡、加热处理后得到菌液d。ctab可裂解细胞同时还可以蛋白和多聚糖形成复合物，涡旋振荡可以为破碎细胞壁、裂解细胞膜提供机械力。向所述第一离心管内加入温度为65℃的ctab溶液得到菌液c；将所述菌液c于涡旋振荡器最大档位涡旋振荡10s后，置于95℃的金属浴中加热10min得到菌液d。s140：向所述菌液d中加入酚仿混合液，经涡旋振荡后得到菌液e。所述酚仿混合液包括饱和酚、氯仿及异戊醇，其中所述饱和酚、氯仿及异戊醇的质量份数比为25：24：1。酚仿混合液可以抽提去除ctab与蛋白和多聚糖形成的复合物，此时体系总留下的为菌群dna。s150：移取所述菌液e的上清液至第二离心管内，向所述第二离心管内加入试剂盒的缓冲液后混合均匀得到菌液f。所述菌液e的上清液与所述试剂盒缓冲液的体积比为1:3；所述试剂盒缓冲液为bufferb2。所述试剂盒为sanprep柱式dna胶回收试剂盒。s160：将全部所述菌液f依次过试剂盒的吸附柱至菌群dna吸附于所述吸附柱上。移取第一部分所述菌液f中吸附柱，所述吸附柱以转速为12000rpm离心；移取第二部分所述菌液f中吸附柱，所述吸附柱以转速为12000rpm离心。取400ul混合液移至吸附柱(sanprep柱式dna胶回收试剂盒)中，静置2min，12000rpm离心30s，弃回收管内废液。重复一次，直至混合液全部过柱，此时细菌总dna全部吸附于吸附柱上。s170：向所述吸附柱内加入试剂盒的洗涤液后得到菌液g。所述洗涤液为washsolution。吸附柱中加入400ul的washsolution(sanprep柱式dna胶回收试剂盒)，12000rpm离心30s，弃回收管内废液，重复一次，12000rpm离心2min，并开盖静置5min，完全去除残留液体；s180：将所述菌液g移至第三离心管内，向所述第三离心管内加入预热的洗脱液、离心后得到皮肤菌群dna。所述洗脱液的温度为65℃。吸附柱多次洗涤，去除杂质，得到高质量的dna。在本实施例中，分别测试ctab法、试剂盒法以及本申请提供的方法获取的dna的浓度和纯度，结果如表一：表一ctab法本申请试剂盒法浓度3.5±0.5814.8±1.521+12.3纯度(a260/280)1.74±0.131.94±0.041.86±0.05从上表可以看出，本申请提取的dna的浓度和纯度均高于ctab法、试剂盒法，现有技术对于棉拭子采样的皮肤菌群总dna提取，效果不理想，绝大多数dna质量达不到pcr扩增的要求，而用本发明提取的dna都能pcr扩增出准确的目的条带，并且dna浓度纯度都能满足高通量测序要求。在本实施例中，以ctab法、试剂盒法以及本申请提供的方法获取的dna为模板，采集细菌16s全长pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。具体参考图2，其中m：dnamarker,1：ctab法，2：本申请提供的提取方法，3：试剂盒法。从图2中可以看出，本申请提供的dna经琼脂糖凝胶电泳显示出的带与ctab法、试剂盒法相比较更清晰。本申请将ctab-酚仿法与试剂盒有机结合，既利用了ctab与蛋白和多聚糖形成复合物，酚仿混合液将其抽提去除，留下dna，又利用了吸附柱多次洗涤，去除杂质，得到高质量的dna，以达到后续建库及高通量测序的要求；(1)操作简单：本发明与现有的皮肤菌群总dna提取试剂盒相比，操作简便，不需要特殊的仪器设备及配件。(2)价格低廉：现有皮肤菌群dna提取试剂盒价格昂贵，一般一个样本需要花费试剂200元左右，而用本发明方法提取，一个样本仅需50元左右；(3)效果优越：现有技术对于棉拭子采样的皮肤菌群总dna提取，效果不理想，绝大多数dna质量达不到pcr扩增的要求，而用本发明提取的dna都能pcr扩增出准确的目的条带，并且dna浓度纯度都能满足高通量测序要求。实施例：皮肤拭子取样后，将棉拭子保存于细菌保存液中，于涡旋振荡器最大挡位涡旋振荡10s，使细菌从拭子上完全脱离；取600ul菌液于无菌1.5ml离心管中，12000rpm离心15min，使细菌全部沉降于管底部，将液体尽可能全部除去；向管中加入300ul事先65℃预热的2xctab溶液，最大挡位涡旋振荡10s，然后置于金属浴95℃加热10min；向管中加入300ul酚仿混合液(饱和酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1)最大挡位涡旋振荡，使溶液充分混匀，蛋白抽提完全；12000rpm离心5min，小心吸取200ul上清移至新的无菌1.5ml离心管中，加入3倍体积(600ul)的bufferb2(sanprep柱式dna胶回收试剂盒)，颠倒混匀；取400ul混合液移至吸附柱(sanprep柱式dna胶回收试剂盒)中，静置2min，12000rpm离心30s，弃回收管内废液。重复一次，直至混合液全部过柱，此时细菌总dna全部吸附于吸附柱上；吸附柱中加入400ul的washsolution(sanprep柱式dna胶回收试剂盒)，12000rpm离心30s，弃回收管内废液，重复一次，12000rpm离心2min，并开盖静置5min，完全去除残留液体；吸附柱移至新的1.5ml离心管中，加入60ul事先65℃预热的te洗脱液，静置2min，12000rpm离心1min。即得到皮肤菌群dna。由于以上实施方式均是在其他方式之上引用结合进行说明，不同实施例之间均具有相同的部分，本说明书中各个实施例之间相同、相似的部分互相参见即可。在此不再详细阐述。本领域技术人员在考虑说明书及实践这里发明的公开后，将容易想到本申请的其他实施方案。本申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本申请的一般性原理并包括本申请未公开的本
技术领域：
中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本申请的真正范围和精神由权利要求的内容指出。以上所述的本申请实施方式并不构成对本申请保护范围的限定。当前第1页12