一种葡萄糖的快速检测方法与流程

本发明涉及糖类分析检测技术领域，具体涉及一种葡萄糖的快速检测方法。

背景技术：

血清中葡萄糖含量是衡量人体健康状态的一个重要指标，土壤中葡萄糖含量是衡量土壤特性的常用指标，污水中葡萄糖指标对污水净化具有重要作用，食品与药品中葡萄糖含量更是成分分析常用的指标，因此，葡萄糖检测技术在医学、生物技术、土壤检测、工业废水处理、食品及药品加工领域被广泛使用。开发操作简便，高灵敏度的葡萄糖检测技术已成该领域的关注重点。

目前检测葡萄糖的方法主要有比色法、电化学方法、高效液相色谱法等，其中：高效液相色谱法样品预处理程序繁琐、仪器昂贵，成本高；电化学法是近年来应用最多的的葡萄糖检测技术，具有操作简便、线性范围宽及灵敏度高的特点，但电化学法对检测物的选择性较差，需要特殊的电极和电化学仪器辅助检测，大多数电化学传感器的储存期较短，成本相对较高。

与电化学法相较，比色法具有成本低、显色时间短、现象明显、条件稳定、方便快捷，不需要特殊的电极和电化学仪器等突出优势，在分析检测领域中占据着越来越重要的地位。比色化学传感器是运用紫外-可见分光光度计或者光电比色计，以朗伯比尔定律为理论基础，确定样品中待测物质含量的一种简便的分析方法。比色化学传感器大致分为两类：一类是目视比色化学传感器，也就是人们使用眼睛观察，找到与样品溶液颜色相近的标准溶液，从而方便快捷地确定样品中待测物质的含量范围，但是由于人眼的分辨率不高，容易受到不同环境的影响，因此此种方法的准确度相对较低。另一种是分光光度法，利用物质在特定波长处吸光度的大小，根据朗伯比尔定律确定待测物质的含量大小，此种方法相对于目视比色法有较高的准确度。

葡萄糖氧化酶法(gox法)测定葡萄糖特异性强，检测时间短，环境友好，样品用量少，是比色法测定葡萄糖比较常用的方法。但所需葡萄糖氧化酶及过氧化物酶存活的条件较为苛刻，需要低温保存在一定浓度的pbs溶液中，长时间暴露在室温或者较高温度下，酶会以较快的速度失活分解，阻碍了酶的反复利用，而且葡萄糖氧化酶价格昂贵、制备复杂，gox法测定葡萄糖的酶用量多，检测成本较高。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种葡萄糖的快速检测方法，实现了对葡萄糖的高效、灵敏检测；有效解决了葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖所存在的酶用量多、酶易失活等问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种gox&auncs@zif-8复合物，所述gox&auncs@zif-8复合物由如下方法制备而成：

将醋酸锌溶液、葡萄糖氧化酶(gox)溶液、金纳米簇(auncs)溶液和2-甲基咪唑溶液按体积比为(3-5)：(3-5)：(3-5)：(3-5)混合，搅拌1-3min，然后静置10-16h；离心洗涤，制备得到gox&auncs@zif-8复合物。

优选的，所述醋酸锌溶液的浓度为0.03-0.05mol/l；所述葡萄糖氧化酶溶液的浓度为0.4-0.6mg/ml；所述金纳米簇溶液的浓度为0.6-0.9mg/ml；所述2-甲基咪唑溶液的浓度为0.13-0.17mol/l。

优选的，所述金纳米簇溶液由如下方法制备而成：

(1)将haucl4水溶液加入到剧烈搅拌状态下的牛血清蛋白(bsa)溶液中，持续搅拌3-8min；

(2)向步骤(1)获得的溶液中加入naoh溶液，持续剧烈搅拌20-28h；

(3)将步骤(2)获得的溶液在超纯水中透析40-50h，制备得到金纳米簇溶液。

更优选的，所述haucl4水溶液的浓度为8-12mmol/l；bsa溶液的浓度为40-60mg/ml；naoh溶液的浓度为0.5-1.5mol/l。

更优选的，haucl4水溶液、bsa溶液和naoh溶液加入的体积比为(4-6)：(4-6)：(0.4-0.6)。

本发明的第二方面，提供上述gox&auncs@zif-8复合物在如下1)或2)中的用途：

1)葡萄糖检测；

2)制备定性或定量检测葡萄糖的试剂。

本发明的第三方面，提供一种葡萄糖的快速检测方法，包括以下步骤：

(1)将gox&auncs@zif-8复合物溶于双重去离子水中，得到浓度为30-50mg/ml的gox&auncs@zif-8复合物溶液；将gox&auncs@zif-8复合物溶液和待测溶液混合后水浴；

(2)向水浴后的体系中加入醋酸缓冲溶液和tmb溶液，调节体系的ph为1-3，10-15min后，测量体系的uv-vis光谱，从而实现对待测溶液中葡萄糖的检测。

优选的，步骤(1)中，所述水浴的温度为20-40℃，水浴时间为15-20min。

优选的，步骤(2)中，所述醋酸缓冲溶液的ph为1-3，浓度为0.1mol/l；所述tmb溶液的浓度为7-9mmol/l。

优选的，步骤(2)中，uv-vis光谱范围为400-800nm。

优选的，步骤(2)中，所述对待测溶液中葡萄糖的检测为定性检测或定量检测；

当为定性检测时，按照如下确定所述待测溶液中是否含有葡萄糖：

若加入待测溶液后所测定的紫外-可见吸收强度值高于对照值，则所述待测溶液中含有或候选含有葡萄糖；若加入待测溶液后所测定的紫外-可见吸收强度值低于或等于对照值，则所述待测溶液中不含葡萄糖；

所述对照值是用不含葡萄糖的溶液代替所述待测溶液进行步骤(1)-(2)所测得的紫外-可见吸收强度值。

当为定量检测时，按照如下确定所述待测溶液中葡萄糖的含量：将测得的紫外-可见吸收强度带入线性方程，获得待测溶液葡萄糖含量；

进一步地，所述线性方程按照如下方法获得：用系列已知浓度的葡萄糖标准品代替所述待测溶液进行步骤(1)-(2)，测得各浓度的葡萄糖标准品对应的紫外-可见吸收强度，从而获得紫外-可见吸收强度与葡萄糖浓度之间的线性方程。

本发明的有益效果：

(1)本发明首次利用温和环保的方式制备具有高催化能力的纳米级gox&auncs@zif-8复合物；所述gox&auncs@zif-8复合物，与auncs及gox两种游离酶的均匀混合物相比，生物催化级联增强约19.3倍，酶稳定性高，酶用量小，成本低，实现了对葡萄糖的高效、灵敏检测，而且检测条件温和、操作简便、靶向性强。解决了色谱法存在的样品预处理程序繁琐和仪器昂贵；电化学法存在的靶向性差，传感器稳定性差，需要特殊的电极及电化学设备；传统酶法比色传感器成本高，酶用量多，酶易于失活等问题。

(2)本发明合成的gox&auncs@zif-8复合物可重复使用，每次检测结束可即刻对gox&auncs@zif-8复合物收集，保存备用。

(3)本发明的测定方法可迅速检测到试样中是否含有葡萄糖，检测限为0.02μmol/l，可以准确用于血清、土壤、食品等葡萄糖含量的检测，适于推广应用。

附图说明

图1：本发明检测葡萄糖的原理图。

图2：本发明gox&auncs@zif-8复合物的合成效果表征；其中，a：纯zif-8和本发明合成gox&auncs@zif-8复合物的xrd图谱，b：不同催化剂作用下oxtmb在652nm处的吸光度随时间的变化。

图3：本发明gox&auncs@zif-8复合物与游离gox&auncs的稳定性比较；图中，a：室温下ph7.4磷酸盐缓冲盐水中培养的gox&auncs@zif-8复合物与游离gox&auncs长期储存稳定性比较；b：室温下在含0.25wt％胰蛋白酶或1wt％的edta的ph7.4磷酸盐缓冲盐水中培养的gox&auncs@zif-8复合物与游离gox&auncs稳定性比较。

图4：本发明构建的模拟酶检测体系对葡萄糖检测的线性考察；其中，a：不同浓度葡萄糖的紫外-可见分光光度检测结果，曲线自下往上代表的葡萄糖浓度分别为0μmol/l、0.2μmol/l、0.5μmol/l、1μmol/l、5μmol/l、10μmol/l、15μmol/l、20μmol/l、25μmol/l、30μmol/l、35μmol/l、40μmol/l；b：紫外-可见光吸收强度与葡萄糖浓度之间的线性关系。

图5：本发明构建的模拟酶检测体系对葡萄糖的靶向性。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，与电化学法相较，比色法具有成本低、显色时间短、现象明显、条件稳定、方便快捷，不需要特殊的电极和电化学仪器等突出优势，在分析检测领域中占据着越来越重要的地位。葡萄糖氧化酶法(gox法)测定葡萄糖特异性强，检测时间短，环境友好，样品用量少，是比色法测定葡萄糖比较常用的方法。但所需葡萄糖氧化酶及过氧化物酶存活的条件较为苛刻，需要低温保存在一定浓度的pbs溶液中，长时间暴露在室温或者较高温度下，酶会以较快的速度失活分解；另外，所需葡萄糖氧化酶的量较多，检测成本较高。

基于此，本发明的目的在于构建一种新的葡萄糖的快速检测方法，有效解决了葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖所存在的酶用量多、酶易失活等问题。

本发明检测葡萄糖的原理如图1所示，葡萄糖首先被gox氧化以产生葡萄糖酸和h2o2，之后，auncs催化h2o2还原产生·oh，导致形成有色产物oxtmb。我们发现有色产物oxtmb在a652nm处具有最大吸收峰，据此实现葡萄糖特异性检测。

本发明通过在室温下简单混合gox、auncs、zn²⁺和2-甲基咪唑在水溶液中制备gox&auncs@zif-8复合物；本发明对gox&auncs@zif-8复合物的合成效果进行了表征(图2)；测定了合成的复合材料gox&auncs@zif-8的sem图像，发现gox&auncs@zif-8是良好分散的纳米颗粒，平均尺寸为1μm；比较了gox&auncs@zif-8与纯zif-8的的xrd图谱(图2a)，发现两者图案重叠，证明gox和auncs的掺入对zif-8的晶体结构没有影响；测定了gox&auncs@zif-8在488nm处的荧光显微镜图像，观察到auncs的红色荧光，证明auncs被复合物成功包覆。

本发明比较了使用不同催化剂检测体系在oxtmb的652nm处的时间依赖性吸光度变化(图2b)，发现当auncs@zif-8和游离gox被引入系统时，速率约等于游离gox和auncs混合物的速率，zif-8涂层对gox和auncs的催化活性无明显影响。当将gox@zif-8和游离auncs引入系统时，速率是游离gox和auncs的4.0倍，而gox&auncs@zif-8(即图2b中的5)作为催化剂时，其生物催化级联与游离gox和auncs混合物相较增强约19.3倍。结果表明，zif-8的包封显著提高了gox@auncs的催化活性。

本发明还对gox&auncs@zif-8的稳定性进行了表征：酶在生物系统中的稳定性对于葡萄糖检测至关重要,本发明比较了室温下在ph＝7.4磷酸盐缓冲盐水溶液中孵育的auncs及gox两种游离酶的均匀混合物与gox&auncs@zif-8复合物的长期稳定性如图3a，室温下存储2天后，gox&auncs@zif-8可保持初始总活性的90％，而auncs及gox两种游离酶的均匀混合物则只保持初始总活性的10％。本发明还在含有0.25wt％胰蛋白酶或1wt％edta的ph＝7.4磷酸盐缓冲盐水溶液中孵育的游离酶及gox&auncs@zif-8复合物的稳定性，如图3b所示，同样发现gox&auncs@zif-8的优异的储存稳定性，由于酶与zif-8支持物的交联作用使得，在37℃下胰蛋白酶消化30分钟后，gox&auncs@zif-8和auncs及gox两种游离酶的均匀混合物分别保持约90％和约60％的初始总活性，而在1wt％edta存在下的gox&auncs@zif-8复合物保留其原始活性的80％，auncs及gox两种游离酶的均匀混合物则失去其原始活性的100％,证明zif-8支架对酶具有优异的保护作用，gox&auncs@zif-8的储存稳定性显著高于auncs及gox两种游离酶的均匀混合物。

本发明还验证了gox&auncs@zif-8对葡萄糖的选择性，比较了gox&auncs@zif-8对同等浓度果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖及葡萄糖溶液的催化效果，发现gox&auncs@zif-8对葡萄糖的选择具有显著的靶向性(图5)。因此，本发明优选zif-8作为gox@auncs的包覆材料获得新的纳米酶体系gox&auncs@zif-8。

由此，本发明首次使用高孔隙率的2-甲基咪唑锌盐maf-4(zif-8)包裹牛血清白蛋白功能化的金纳米簇(auncs)与葡萄糖氧化酶(gox)形成gox&auncs@zif-8纳米级葡萄糖检测联酶系统，可用于对样品中葡萄糖的快速、灵敏检测。

本发明还对葡萄糖检测体系的ph和温度条件进行了考察，分别比较了检测体系溶液的ph值(1，2，3，4，5，6，7，8，9)、溶液温度(10，20，30，40，50，60℃)对gox&auncs@zif-8的催化活性影响效果，确定gox&auncs@zif-8催化活性较优时的ph值及温度范围。gox&auncs@zif-8适合ph范围为(1-3)，适合温度范围为(20-40℃)。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

为避免水中金属离子等杂质影响体系检测效果，除tmb用乙醇作溶剂，其余所有溶剂均使用双重去离子水，双重去离子水是去离子水经过双重蒸馏获得。

实施例1：gox&auncs@zif-8的合成

(1)auncs的合成：

将5ml溶液温度为37℃、浓度为10mmol/l的haucl4水溶液，加入到5ml浓度为50mg/ml、温度37℃处于剧烈搅拌状态下的bsa溶液中。5分钟后，加入浓度为1.0mol/lnaoh溶液0.5ml，混合物溶液稳定在37℃下持续剧烈搅拌24小时。当溶液的颜色从浅黄色变为深棕色时搅拌停止，将溶液在超纯水中透析48小时以除去未反应的杂质。

(2)gox&auncs@zif-8的合成：

室温下将5ml浓度为0.04mmol/l醋酸锌溶液，5ml浓度为0.5mg/ml的gox溶液，4ml浓度为0.8mg/ml的auncs溶液和5ml浓度为0.16mmol/l的2-甲基咪唑溶液混合，将混合溶液搅拌1分钟后静置12小时，以3000r/min离心洗涤15分钟，离心洗涤步骤重复5次，制备得到gox&auncs@zif-8。

实施例2：葡萄糖检测线性方程的建立

(1)分别配制浓度为40mg/ml的gox&auncs@zif-8(实施例1制备)溶液，浓度为0μmol/l、0.2μmol/l、0.5μmol/l、1μmol/l、5μmol/l、10μmol/l、15μmol/l、20μmol/l、25μmol/l、30μmol/l、35μmol/l、40μmol/l的葡萄糖溶液。

(2)将500μl步骤(1)获得的gox&auncs@zif-8溶液分别与步骤(1)配制的不同梯度1ml葡萄糖溶液混合均匀，37℃水浴30分钟。

(3)将300ml浓度为0.1mmol/l醋酸缓冲溶液(ph＝3.0)和100μl浓度为8mmol/l的tmb溶液依次加入步骤(2)获得的溶液中，10分钟后，测量溶液的uv-vis光谱，并获得652nm处不同浓度葡萄糖的紫外-可见吸收强度。

(4)根据步骤(3)获得的数据绘制紫外-可见吸收强度(y)与葡萄糖浓度(x)的线性关系图(图4b)，并获得线性方程：

y＝0.015x+0.167；(r²＝0.999)；检测限为0.02μmol/l。

实施例3：样品中葡萄糖含量的检测

(1)配制浓度为40mg/ml的gox&auncs@zif-8(实施例1制备)溶液。

(2)将500μl步骤(1)获得的gox&auncs@zif-8溶液与1.0ml待测样品溶液混合均匀，37℃水浴30分钟。

(3)将300ml浓度为0.1mmol/l醋酸缓冲溶液(ph＝3.0)和100μl浓度为8mmol/l的tmb溶液依次加入步骤(2)获得的溶液中，10分钟后，测量溶液的uv-vis光谱，获得a652nm紫外-可见吸收强度。

(4)将步骤(3)获得的紫外-可见吸收强度代入线性方程y＝0.015x+0.167(实施例2获得)，计算待测样品葡萄糖含量。

实施例4：葡萄糖检测方法靶向性考察

为了评估本发明葡萄糖检测方法的靶向性，本发明研究了果糖、甘露糖、麦芽糖和乳糖对葡萄糖检测的影响。具体做法是配制同等浓度的果糖、甘露糖、麦芽糖和乳糖对葡萄糖溶液，采用实施例3方法测定其a652nm紫外可见吸收强度，结果检测体系对葡萄糖有显著的选择性(图5)。我们还考察了分别将果糖、甘露糖、麦芽糖和乳糖作为干扰物添加到葡萄糖溶液中检测体系的检测结果，发现果糖、甘露糖、麦芽糖和乳糖的添加不会显著影响紫外可见吸收强度，与单纯的葡萄糖溶液定量测量的结果完全一致。即当葡萄糖与其他糖类共存时，本发明检测体系依然可以实现对样品中葡萄糖的精准检测。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。