具有抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株及其分离方法及应用与流程

技术领域：

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株菌株及其分离方法与应用，特别是一种具有抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株及其分离方法及应用。

背景技术：
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马铃薯作为全球第四大重要的粮食作物，其主要生产国有中国、俄罗斯、美国等。中国是世界马铃薯总产量最多的国家之一。如2013年我国马铃薯总产达8892.5万t，占世界总产比达24.2％左右。

由致病疫霉(phytophthorainfestans)导致的马铃薯晚疫病是最普遍的且对经济影响巨大的马铃薯疫病。马铃薯致病疫霉能够导致马铃薯和番茄等重要农作物发生晚疫病，马铃薯晚疫病是一种由致病疫霉引起的,能够导致马铃薯块茎腐烂和茎叶死亡的毁灭性真菌病害。该病在马玲薯种植地普遍发生，尤其是多雨时，危害更甚，发生严重时，叶片萎蔫，整株死亡。由卵菌致病疫霉引起的马铃薯晚疫病曾导致全球马铃薯大面积减产，部分地区甚至绝产，造成巨大损失。据统计，在近些年我国马铃薯晚疫病有一年其发生面积达即234万hm2。由于马铃薯晚疫病危害，一般年份病株率为5％-20％，重发年份病株率为20％-50％，高的达80％-100％。它一般年份造成减产10％～20％，暴发年份可达50％～70％，甚至绝收。全球每年因马铃薯晚疫病造成的直接经济损失达数百亿美元，我国约10亿美元。占马铃薯总产值的15％。另外，马铃薯晚疫病对马铃薯品质也会构成严重影响。马铃薯晚疫病的传统防治方法主要有农业防治和化学防治。近年来,由于传统的农业防治方法不能从根本上控制病害的发生,防治效果并不稳定；而化学农药的长期使用会使病原菌产生抗药性,过量的使用农药还会破坏土壤,加重农药对环境的污染,造成过多的有毒有害物质残留在农作物体内。因此,对生物防治方法的研究越来越受人们重视,利用微生物之间的拮抗作用,选择对农作物不造成危害的微生物来抑制病菌的生长。如有专家研究发现，使用eb-28无菌体培养液对马铃薯晚疫病菌游动孢子释放具有良好的抑制作用，研究表明其抑制率达到了91.26％，在盆栽试验中，其对马铃薯晚疫病的防效达到74.22％,显著高于离体叶片试验。还有如学者任兴波等分离得到了马铃薯晚疫病菌的高效拮抗菌株yr-35变绿色粘球菌myxococcusvirescens，经实验表明该菌株对马铃薯晚疫病菌菌丝生长则具有较高的抑制率,但对马玲薯晚疫病致病疫霉不能够有较完整的全面的进行抑制与防治作用。

因此，如何来提供一种具有防治抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株，从而防止马铃薯晚疫病的产生，利用种植马铃薯的土壤中筛选出具有抑制马铃薯晚疫病菌效果的细菌，进而利用其菌株对马铃薯晚疫病致病疫霉的游动孢子释放、游动孢子萌发、孢子囊直接萌发及马铃薯晚疫病菌菌丝生长均具有较好的抑制效果的菌株，从而筛选出防治潜力较强的菌株即马铃薯晚疫病致病疫霉菌的拮抗菌，并为在种植马玲薯的过程中实际防治并抑制马铃薯晚疫病的产生，提高马玲薯的种植产量。

技术实现要素：
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本发明提供一种具有抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株及其分离方法及应用；所述菌株是以产生有致病疫霉的种植马铃薯的土壤制备土壤液，进行筛选得到抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株或叫拮抗菌，其对马铃薯致病疫霉菌丝生长、游动孢子释放、休止孢萌发和孢子囊萌发产生芽管均能产生不同程度的抑制作用。

本发明公开一种具有抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctccno:m2019525，保藏的培养物名称：短状杆菌wz-502brachybacteriumsp.wz-502；保藏日期，2019年7月5日，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。

本发明所述的一种具有抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株，其所述菌株的短状杆菌wz-502经过pcr进行扩增，其引物为27f(5′-agagtttgatcctggctcag-3′)、1541r(5′-ctacggctaccttgttacga-3′)，16srdna序列测序得1424bp，序列如下：

gacggggcggcgtgcttaccatgcaagtcgaacgatgacggtggtgcttgcaccgcctgattagtggcgaacgggtgagtaacacgtgagtaacctgccctccacttcgggataacctcgggaaatcgtggctaataccggatacgagcactcatcgcatggtgagtgctggaaagatttatcggtgggggatggactcgcggcctatcagtttgttggtgaggtgatggctcaccaagacgatgacgggtagccggcctgagagggcgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgaaagcctgatgcagcgacgccgcgtgggggatgacggccttcgggttgtaaacccctttcagtagggaagaagcgagagtgacggtacctgcagaagaagcgccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggcgcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagagcttgtaggtggcttgtcgcgtctgccgtgaaaacccgaggctcaacctcgggcgtgcggtgggtacgggcaggctagagtgtggtaggggagactggaactcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaagaacaccgatggcgaaggcaggtctctgggccattactgacactgagaagcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgttgggcactaggtgtgggggacattccacgttttccgcgccgtagctaacgcattaagtgccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgctgattaattcgatgcaacgcgaagaaccttaccaaggcttgacatgcactggacggctgcagagatgtggctttctttggactggtgcacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgttctatgttgccagcacgtgatggtggggactcataggagactgccggggtcaactcggaggaaggtggggacgacgtcaaatcatcatgccccttatgtcttgggcttcaagcatgctacaatggtcggtacaatgggttgcgaaactgtgaggtggagcgaatcccaaaaagccggcctcagttcggattggggtctgcaactcgaccccatgaagtcggagtcgctagtaatcgcagatcagcaacgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcaagtcacgaaagtcggtaacacccgaagccagtggcccatcctcgtgagggagcttcgaagtgaattcgggt。

本发明所述马铃薯晚疫病致病疫霉优选是以马铃薯晚疫病致病疫霉基因组dna为模板，采用its1和its4作为引物，进行pcr扩增；正向引物为its1，其序列为tccgtaggtgaacctgcgg；反向引物为its4，其序列为tcctccgcttattgatatgc。

本发明另一目的是公开一种具有抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株的分离方法，包括如下步骤，

1)先取基地中种植不同马铃薯的土壤，制备土壤液；

2)制土壤液，取步骤1)的土壤8-12g溶于90ml的无菌水中，在90-100℃水浴中加热15-25min，用无菌水将土壤液依次稀释成六个浓度梯度：10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6；

3)培养，将步骤2)每个浓度的土壤液涂布培养在事先倒好的lb固体培养基上，每个浓度重复3-6次，35-38℃条件下倒置培养2-3d，筛选初步细菌；

4)分离纯化，将步骤3)的初步细菌进行分离纯化，并采用平板对峙法对具有拮抗抑制作用的初步细菌再次复筛及并编号，即得到具有抑制马铃薯晚疫病致病疫霉的菌株的短状杆菌。

本发明一种具有抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株，应用于马铃薯晚疫病致病疫霉孢子囊释放游动孢子抑制作用。

一种具有抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株，应用于马铃薯晚疫病致病疫霉孢子囊直接萌发抑制作用。

一种具有抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株，应用于马铃薯晚疫病致病疫霉休止孢萌发抑制作用。

一种具有抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株，应用于马铃薯晚疫病致病疫霉菌丝生长抑制作用。

本发明具有抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株的应用，所述应用是控制抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株的菌液浓度为20-50ml·l-1。

本发明公开的一种具有抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株及应用，其可应用于对马玲薯致病疫霉及马玲薯晚疫病致病疫霉等有害菌的抑制防治作用即作为马玲薯致病疫霉的拮抗细菌。我国作为马铃薯种植和生产的大国，马铃薯晚疫病的发生，每年都会造成大面积的减产，对马铃薯晚疫病的防治也是迫在眉睫。当前化学农药防控是马铃薯晚疫病防治的主要方式,但长期大量使用化学农药可导致严重的环境污染、食品安全和人类健康等问题。而且由于病原菌快速产生的抗药性,使大量化学农药药效逐渐减弱甚至丧失。因此，本发明具有抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株及应用是保障马铃薯生产,减少经济损失和环境污染的重要措施。

利用微生物细菌的拮抗性质，即利用马铃薯致病疫霉的拮抗菌可抑制马铃薯致病疫霉，进而可防治马铃薯晚疫病的产生；报道有学者研究发现，6个相关具有拮抗的菌株不同菌液对马铃薯致病疫霉游动孢子释放、休止孢萌发和孢子囊直接萌发均有明显的抑制效果。且6株菌中wl2菌株显示出了最强的抑制活性。还有报道，地衣芽孢杆菌对马铃薯致病疫霉菌丝生长、游动孢子释放、休止孢萌发和孢子囊萌发产生芽管均能产生不同程度的抑制作用,但是对孢子囊直接萌发产生芽管的抑制作用不大。利用本发明方法在本发明的试验基地马铃薯种植的土壤中，筛选出了具有抑制马铃薯致病疫霉的短状杆菌，得到若干株具有明显抑制效果的拮抗细菌如wz-406、wz-502、wz-503，并通过进一步的实验，比较出它们在不同菌液浓度下，对致病疫霉的菌丝生长、游动孢子释放、休止孢萌发和孢子囊萌发表现出的较好的抑制作用。经本发明的实验表明，wz-502对致病疫霉具有显著的抑制效果，其对致病疫霉游动孢子释放、休止孢萌发和孢子囊萌发也具有较好的抑制作用。本发明的上述菌株对马铃薯晚疫病的具有显著的实际防治效果。

附图说明：

图1、为本发明具有抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株即短状杆菌wz-502的进化树；

图2、为本发明具有抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株即短状杆菌wz-502taq酶扩增16srdna的电泳图；

图3、为本发明具有抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株即短状杆菌wz-502的革兰氏染色(1000*)图；

图4、为本发明具有抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株即短状杆菌wz-502的菌落形态图；

图5、本发明具有抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株即短状杆菌wz-502对马玲薯晚疫病致病疫霉抑制效果图(左)及空白对照图(右)；

图6、为本发明分离出的马玲薯晚疫病致病疫霉的plb-2进化树图；

图7、为本发明分离出的马铃薯致病疫霉plb-2电泳图；图7的马铃薯致病疫霉的plb-2电泳图中，1、2为基因组总dna，3、taq酶扩增pcr，4、pfu酶扩增pcr；

图8、为本发明具有抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株即短状杆菌wz-502的16srdna序列图。

具体实施方式：

以下实施例进一步说明本发明的内容，仅仅是为清楚说明本发明所作的举例，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对所属领域的普通技术人员来说，对本发明方法、步骤或条件所作的变化、变动、修改或替换，仍属于本发明的范围。下述实施方式中所述马铃薯致病疫霉和马铃薯致病疫霉菌的意义相同，或者是说马铃薯晚疫病致病疫霉和马铃薯晚疫病致病疫霉菌意义相同；同时具有抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株和具有抑制效果的马玲薯晚疫病致病疫霉拮抗细菌意义相同，即是说具有抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株即为马玲薯晚疫病致病疫霉的拮抗细菌，短状杆菌wz-502或者叫wz-502意义相同。

实施例1

本发明试验通过从本发明的项目试验基地种植的马铃薯的土壤中筛选出具有抑制马铃薯致病疫霉效果的短状杆菌的菌株，并进一步探讨其菌株对马铃薯致病疫霉即马铃薯晚疫病致病疫霉菌游动孢子释放、休止孢萌发、孢子囊直接萌发及马铃薯晚疫病致病疫霉菌丝生长的抑制效果，且从中筛选出防治潜力较强的菌株。

本发明公开的一种具有抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctccno:m2019525，保藏的培养物名称：短状杆菌wz-502brachybacteriumsp.wz-502；保藏日期，2019年7月5日，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。

本发明所述菌株的短状杆菌wz-502经过pcr进行扩增，其引物为27f(5′-agagtttgatcctggctcag-3′)、1541r(5′-ctacggctaccttgttacga-3′)，16srdna序列测序得1424bp，序列如下：

gacggggcggcgtgcttaccatgcaagtcgaacgatgacggtggtgcttgcaccgcctgattagtggcgaacgggtgagtaacacgtgagtaacctgccctccacttcgggataacctcgggaaatcgtggctaataccggatacgagcactcatcgcatggtgagtgctggaaagatttatcggtgggggatggactcgcggcctatcagtttgttggtgaggtgatggctcaccaagacgatgacgggtagccggcctgagagggcgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgaaagcctgatgcagcgacgccgcgtgggggatgacggccttcgggttgtaaacccctttcagtagggaagaagcgagagtgacggtacctgcagaagaagcgccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggcgcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagagcttgtaggtggcttgtcgcgtctgccgtgaaaacccgaggctcaacctcgggcgtgcggtgggtacgggcaggctagagtgtggtaggggagactggaactcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaagaacaccgatggcgaaggcaggtctctgggccattactgacactgagaagcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgttgggcactaggtgtgggggacattccacgttttccgcgccgtagctaacgcattaagtgccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgctgattaattcgatgcaacgcgaagaaccttaccaaggcttgacatgcactggacggctgcagagatgtggctttctttggactggtgcacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgttctatgttgccagcacgtgatggtggggactcataggagactgccggggtcaactcggaggaaggtggggacgacgtcaaatcatcatgccccttatgtcttgggcttcaagcatgctacaatggtcggtacaatgggttgcgaaactgtgaggtggagcgaatcccaaaaagccggcctcagttcggattggggtctgcaactcgaccccatgaagtcggagtcgctagtaatcgcagatcagcaacgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcaagtcacgaaagtcggtaacacccgaagccagtggcccatcctcgtgagggagcttcgaagtgaattcgggt。

本发明具有抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株即短状杆菌wz-502的16srdna序列图,

下面即为本发明的具体的制备方法与应用说明：

材料与方法

1、材料与试剂

马铃薯晚疫病病株：采集于本发明的项目试验基地，具体为马铃薯地的江西省宜春市某乡；

燕麦培养基：燕麦50g·l-1，胡萝卜50g·l-1，琼脂粉20g·l-1，ph＝5.8；

lb固体培养基：胰蛋白胨10g·l-1，酵母浸粉5g·l-1，nacl10g·l-1，琼脂粉18g·l-1，调ph至7.2±0.1(液体培养基不加琼脂)；氨苄青霉素或链霉素：200mg·l-1。

2、实验方法

(1)马铃薯致病疫霉的分离与筛选

病害标样采集于本发明的项目试验基地，不同马铃薯品种的晚疫病样品的茎叶，分离采用组织分离法，接种致病疫霉即马铃薯致病疫霉(下同)于燕麦培养基，但制备燕麦培养基过程中需先将燕麦和胡萝卜粉碎，再过滤得其滤液；接种之前加入200mg·l-1的氨苄青霉素，用以杀灭细菌。在分离霉菌时，先将病叶用水冲洗干净，再用灭菌水冲洗，然后将病斑剪成1.0cm2大小的小块，用75％酒精浸泡30s，取出，用无菌水洗净。放置在不同的燕麦培养基平板上，在18℃培养5-6d后，用打孔器把白色毛绒状的致病疫霉接种到新鲜的燕麦培养基(链霉素200mg·l-1)，然后通过打孔、接种菌饼的方法对致病疫霉进行分离纯化，通过镜检观察致病疫霉孢子和生长形态，编号为plb-2。

(2)致病疫霉plb-2的形态鉴定

取出18℃培养7d左右的致病疫霉plb-2，首先观察其菌落特征，然后用显微形态鉴定的方法，观察其显微结构。运用插片法制作玻片，先将盖玻片倾斜45°插入培养基中，然后将其放回18℃的培养箱内培养1d，让菌丝蔓延至盖玻片上。继而进行镜检，用乳酸石碳酸棉兰染色液染色，在光学显微镜下进行观察其致病疫霉的菌丝、孢子囊和游动孢子形态结构。(3)致病疫霉plb-2的分子生物学鉴定

致病疫霉基因组dna的提取

先取200mg致病疫霉，用液氮研磨成粉末，再加入到1.5ml的离心管中。依据真菌基因组dna快速抽提，试剂盒由上海某公司的操作说明方法来进行dna的提取。取上述提取获得的dna2ul，采用核酸蛋白测定仪来测定样品中核酸浓度和纯度。样品a260/a280的比值在1.8到2.0之间。这表明样品中dna含量很高。再对dna进行琼脂糖凝胶电泳。

致病疫霉plb-2的its-rdnapcr扩增检测

以致病疫霉基因组dna为模板，选用its1和its4作为引物，进行pcr扩增。正向引物为its1，其序列为tccgtaggtgaacctgcgg；反向引物为its4，其序列为tcctccgcttattgatatgc。pcr反应体系20μl：0.6μlits1、0.6μlits4、10μl2×taqpcrmastermin、1μldna模板、7.8μlddh2o。扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸90s，72℃最后延伸10min。pcr扩增结束后，对扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像仪观察，比较分析电泳图谱，如图7所示的为马铃薯致病疫霉plb-2电泳图。

致病疫霉plb-2分子鉴定

将致病疫霉plb-2pcr产物寄去上海某生物公司进行测序，序列经ncbi数据库的blast工具进行基因序列比对。用mega10.0软件分析获得进化树，如图6所示的即为马铃薯致病疫霉的plb-2进化树图。

(4)本发明的具有抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株即短状杆菌wz-502筛选，下称致病疫霉拮抗细菌的筛选或叫拮抗细菌的筛选；

首先用取自本发明项目试验基地种植马铃薯的土壤制备土壤液，具体方法是：将10g土壤溶于90ml的无菌水中，在100℃水浴中加热10min，用无菌水依次稀释至10^-6梯度，涂布法至lb固体培养基上，每个浓度重复4次，37℃条件下倒置培养2-3d。然后进行分离纯化，采用平板对峙法对有拮抗作用的细菌再次复筛，复筛出三种具有抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株，并编号为wz-406、wz-502、wz-503三种拮抗细菌。

制备拮抗细菌原液，选取wz-406、wz-502、wz-503三种拮抗细菌的纯品，将其用接种环分别接种至三瓶lb培养基中，每瓶lb培养基接种一种细菌，然后放置在37℃，200r·min-1，24h，检测od值在1.5左右，细菌数目浓度3.65×10⁷cfu·ml^-1；之后放置在4℃冰箱中以待备用。

3、不同致病疫霉拮抗细菌原液浓度即具有抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株的细菌原液(下同)对马玲薯致病疫霉抑制效果的影响；

将三种具有拮抗作用的细菌的菌液稀释为4个浓度:50ml·l^-1、25ml·l^-1、12ml·l^-1、6ml·l^-1然后将不同浓度的菌液涂布于灭菌的凝固的燕麦固体培养基上，每处理重复3次，以不加入细菌原液为空白对照。将1块生长10d左右长势相近的致病疫霉菌饼(直径＝0.8㎝)放置在每个平板的中间，于18℃恒温培养箱中培养10d左右后测量菌落直径，并计算平均值。

(1)不同拮抗细菌原液浓度对马玲薯晚疫病致病疫霉孢子囊释放游动孢子的影响，

将具有拮抗作用的即具有抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株的细菌原液稀释为5个浓度：50ml·l^-1、25ml·l^-1、12ml·l^-1、6ml·l^-1、3ml·l^-1，将生长10d左右的致病疫霉的孢子囊刷落于无菌水中,制成孢子囊悬浮液，将其稀释至300ml，然后，分装成3瓶，每瓶100ml。运用血球计数板法，在显微镜下统计孢子囊总数约为3.25×106个·ml-1。将不同浓度的细菌原液与孢子囊悬浮液等体积(3ml)混合于灭菌的洁净干燥的培养皿内，每个浓度重复3次，以lb液体培养基为空白对照,放置黑暗条件下4℃保存3h，促使孢子囊释放游动孢子，同时统计50个孢子囊并计算游动孢子释放率。游动孢子释放率(％)＝空孢子囊数/总孢子囊数*100％。

(2)不同拮抗细菌原液浓度对马玲薯晚疫病致病疫霉孢子囊直接萌发的影响，

重新制备300ml孢子囊悬浮液，方法同上，运用血球计数板法，得到孢子囊总数约为1.5x106个·ml-1，将致病疫霉的孢子囊悬浮液与3株细菌不同浓度的菌液按1∶1(3ml∶3ml)混合，以与等体积无菌水混合作为对照。每处理重复3次，将其置于黑暗25℃下5h刺激孢子囊直接萌发。统计50个数目，计算不同菌液浓度下，孢子囊萌发的平均百分率。孢子囊萌发率(％)＝孢子囊萌发数/孢子总数×100％。

(3)不同拮抗细菌原液浓度对马玲薯晚疫病致病疫霉休止孢萌发的影响，

使用上面步骤中配置的100ml孢子囊悬浮液，在黑暗4℃条件下放置3h，促使孢子囊释放出游动孢子，配制成游动孢子悬浮液，镜检游动孢子释放数约为1.0x106个·ml-1。将游动孢子悬浮液与3株细菌不同浓度的菌液按1∶1(3ml∶3ml)混合，以与等体积无菌水混合作为对照，每处理重复3次。黑暗条件10℃下3h以刺激休止孢萌发。计算不同菌液浓度下，休止孢萌发的平均百分率。休止孢萌发率＝休止孢萌发数/游动孢子释放数x100％。

4、本发明的具有抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株即拮抗菌wz-502的形态和分子鉴定

如图3所示的为本发明拮抗细菌的革兰氏染色图或者叫具有抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株的革兰氏染色图，具体鉴定方法：将短状杆菌wz-502经多次平板划线分离纯化菌株，观察每种菌株的形态结构，随后使用革兰氏染色后用显微镜进行观察。同时参考《伯杰氏细菌鉴定手册》对其鉴定到属。最佳拮抗细菌wz-502的分子鉴定同上；致病疫霉的最佳拮抗细菌wz-502的16srdna扩增检测，引物为27f(5′-agagtttgatcctggctcag-3′)、1541r(5′-ctacggctaccttgttacga-3′)。16srdnapcr产物测序。

结果与分析

致病疫霉及其拮抗细菌的鉴定或叫致病疫霉及其拮抗细菌的形态鉴定，

运用组织分离法，将致病疫霉plb-2样品在燕麦培养基中培养，分离的致病疫霉plb-2在燕麦培养基上呈现纯白色，与现有技术的形态相同，菌丝分布均匀，呈白色丝状，菌落呈现圆形。运用插片法制作玻片进行镜检，用乳酸石碳酸棉兰染色液染色，在光学显微镜下观察，菌丝较细，无隔，有分支，大多数菌丝呈现多支形态，顶端有膨胀并着生孢子囊，孢子囊呈椭圆形。

利用本发明方法筛选得到的wz-406、wz-502、wa-503三株较好的拮抗细菌，如图4所示即为本发明的短状杆菌wz-502的菌落形态结构。其他如wz-406、wa-503拮抗菌其菌落形态与wz-502菌株的相似；观察wz-502菌落呈黄色，表面含水量较高、光滑，黏性较高，菌落边缘平整。如图3所示；随后使用革兰氏染色后用光学显微镜进行观察，结果wz-502菌株革兰氏染色呈现蓝紫色，表明此种拮抗细菌为革兰氏阳性菌；wz-502为短杆状结构。

致病疫霉plb-2的分子鉴定

将成功分离纯化后的致病疫霉plb-2提取基因组dna，对提取的dna进行its-rdnapcr扩增。然后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图7所示；表明其its-rdna的分子量在546bp，经过对其测序结果和blast比对，与phytophthorainfestans同源性达到100％如图6马铃薯致病疫霉plb-2进化树图，结合形态结果分析，鉴定分离的马铃薯致病疫霉plb-2为phytophthorainfestans。

本发明具有抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株即拮抗细菌wz-50216srdna鉴定，

本发明的具有抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株即拮抗细菌wz-502经过pcr扩增，16srdna序列测序得1424bp。经过对blast比对，其wz-502与副凝聚短状杆菌brachybacteriumparaconglomeratumstrainlmg19861(nr022502)同源性达100％，如图1所示，基于13个菌株采用nj法构建了系统发育树以确证wz-502菌株的分类归属，结果显示wz-502菌株应归为短状杆菌属brachybacterium。wz-502菌株与副凝聚短状杆菌nr022502处于同一分支，且同源性为99％，renske(2003)提出序列相似性在95％—99％之间，可鉴定为相同属。故鉴定wz-502为短状杆菌brachybacteriumsp.。

不同拮抗细菌原液浓度对致病疫霉抑制效果的影响

在相同条件、不同浓度的拮抗细菌菌液下，致病疫霉的生长受到不同程度的抑制，见表1和图5。其中wz-406的抑制效果不太明显，而wz-502则表现出良好的抑制作用，浓度为50ml·l-1时，其霉菌生长直径最小达1.1±0.10acm，几乎未见生长，差异非常显著，浓度为6ml·l-1时，致病疫霉菌落直径为5.1±0.10acm，与对照相比差异显著。

表1不同拮抗细菌菌液浓度对马铃薯致病疫霉生长的影响tab.1inhibitionofantagonisticbacteriaongrowthofmyceliaofp.infestans

图5、wz-502对致病疫霉的抑制效果及空白对照，图5左边为wz-502抑制效果，右边为空白对照图。

不同拮抗细菌原液浓度对致病疫霉孢子囊释放游动孢子的影响，

在相同条件、不同浓度的细菌原液的作用下，三种拮抗细菌对致病疫霉孢子囊释放游动孢子的抑制效果如下表2，在50ml·l-1的细菌原液浓度下，wz-502呈现出最高的抑制作用，游动孢子释放率只有15.38％，对照组的游动孢子释放率达46.15％，显示出明显的抑制效果，差异非常显著；wz-503效果其次，wz-406抑制效果最差。在12ml·l-1的细菌原液浓度下，wz-502还保持游动孢子释放率26％左右，与对照组的46.85％对比显著性差异。

表2拮抗细菌菌液浓度对致病疫霉游动孢子释放的影响

tab.2concentrationgradeeffectionofantagonisticbacteriaonreleaseofzoosporesfromsporangiaofp.infestans

说明：不同拮抗细菌原液浓度对致病疫霉孢子囊直接萌发的影响。

不同拮抗细菌原液对孢子囊萌发直接萌发的抑制作用见表3，结果显示，不同拮抗细菌原液对孢子囊直接萌发有一定的抑制作用。随着拮抗细菌原液浓度的增加,孢子囊萌发率逐渐减小,其相对抑制率也相应增加。当wz-502浓度为50ml·l-1时，对孢子囊直接萌发的相对抑制率最高,为13.11％，孢子囊萌发率与对照相比存在显著性差异。当wz-502浓度为12ml·l-1时，孢子囊直接萌发对孢子囊直接萌发的相对抑制率最高,为26.18％，孢子囊萌发率与对照相比存在显著性差异。

表3不同拮抗细菌菌液浓度对致病疫霉孢子囊直接萌发的影响

tab.3concentrationgradeeffectionofantagonisticbacteriaonongerminationofsporangiaofp.infestans

说明，不同拮抗细菌原液浓度对致病疫霉休止孢萌发的影响。

在不同拮抗细菌菌液浓度的作用下，三种拮抗细菌对致病疫霉休止孢萌发的抑制作用见表4，可以看出,当拮抗细菌菌液浓度较大时，对致病疫霉休止孢萌发的抑制效果较明显,当浓度为50ml·l-1和25ml·l-1时对致病疫霉休止孢萌发的相对抑制率较高。其中，wz-502抑制效果较为显著，呈显著性差异，wz-503其次，效果也明显。随着拮抗细菌菌液浓度不断降低，对休止孢萌发的相对抑制率也逐渐减小，但还是与对照相比差异显著。结果表明，不同拮抗细菌菌液浓度对休止孢萌发的影响很大，均显著性差异明显，菌株wz-502对马铃薯晚疫病的防治具有理论价值。

表4不同拮抗细菌菌液浓度对致病疫霉休止孢萌发的影响

tab.4concentrationgradeeffectionofantagonisticbacteriaonongerminationofzoosporesofp.infestans

说明，利用本发明方法分离出的具有抑制马玲薯晚疫病致病疫霉的菌株即短状杆菌wz-502对马玲薯晚疫病致病疫霉都具有抑制作用，仅是其作用大小不同，即以保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctccno:m2019525，短状杆菌wz-502效果最显著。

结论与讨论

作为马铃薯种植和生产的大国，马铃薯晚疫病的发生，每年都会造成大面积的减产，对马铃薯晚疫病防治的研究也是迫在眉睫。化学农药防控是马铃薯晚疫病防治的主要方式,但长期大量使用化学农药可导致严重的环境污染、食品安全和人类健康等问题。而且由于病原菌快速产生的抗药性,使大量化学农药药效逐渐减弱甚至丧失。因此，开发有效、安全及环保的生物农药是保障马铃薯生产,减少经济损失和环境污染的重要措施。近年来，植物病害生物防治以其无污染、无残留、无生态毒性和安全性好等优点在农业生产中得到广泛的认同。其中利用拮抗微生物抑制马铃薯致病疫霉进而防治马铃薯晚疫病也受到越来越多的关注。经研究发现，有些个拮抗菌株不同菌液对马铃薯致病疫霉游动孢子释放、休止孢萌发和孢子囊直接萌发均有明显的抑制效果。如有株菌wl2菌株显示出了最强的抑制活性，还有学者发现，地衣芽孢杆菌对马铃薯致病疫霉菌丝生长、游动孢子释放、休止孢萌发和孢子囊萌发产生芽管也能产生不同程度的抑制作用；但是对孢子囊直接萌发产生芽管的抑制作用不大。而运用对峙培养法、打孔法和离体组织切片法，研究了菌株sy11、m15和a5295抑制马铃薯致病疫霉的抑菌效果。发现sy11菌株对马铃薯晚疫病的防治效果最大。zegeye等发现，木霉菌比荧光假单胞菌对马铃薯晚疫病的防效更为明显。lamsal等研究表明，7株根际细菌对马铃薯致病疫霉的抑制率均在60％以上，其中ab15菌株的抑制作用最强。还有学者研究发现，内生细菌菌株265zy1、265zy3和265xy6对茄镰孢菌具有较强的拮抗能力，其抑菌率均接近75％。经形态观察及16srdna基因序列分析，265zy1鉴定为死谷芽孢杆菌(bacillusvallismortis)，265zy3鉴定为解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)，265xy6鉴定为甲基营养型芽孢杆菌(bacillusmethylotrophicus)。

本发明通过在本对试验基地马铃薯种植的土壤中，筛选出了具有抑制马铃薯致病疫霉的短状杆菌，得到具有明显抑制效果的拮抗细菌wz-502，并通过进一步的实验，比较出它们在不同菌液浓度下，对致病疫霉的菌丝生长、游动孢子释放、休止孢萌发和孢子囊萌发表现出的不同程度的抑制作用。实验表明，wz-502对致病疫霉具有显著的抑制效果，其对致病疫霉游动孢子释放、休止孢萌发和孢子囊萌发也有相对较好的抑制作用。该菌株对马铃薯晚疫病的具有实际的较好的防治效果。