用于犬细粒棘球绦虫的LAMP检测引物组、试剂盒及方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于犬细粒棘球绦虫的lamp检测引物组、试剂盒及方法。

背景技术：

棘球蚴病，又称包虫病，是由棘球绦虫幼虫—棘球蚴寄生于人和动物体内而引起的一种危害严重的人畜共患寄生虫病。棘球绦虫的成虫寄生于终宿主犬科动物的小肠内,虫体成熟后,虫卵和成熟的孕节片可随粪便排出体外。若被中间宿主(主要是啮齿类动物以及一些家畜如羊、牛、马、猪等)食入活虫卵后,形成幼虫寄生于肝脏、肺脏、腹腔等,犬又通过吞食带有幼虫的内脏而感染。犬作为包虫病的终末宿主，是该病最重要的传染源。

目前，对棘球绦虫的检测主要有传统常规粪便检测法、粪抗原elisa检测法和pcr分子生物学检测方法。常规粪便检测法繁琐费时，检出率低，且无法从犬粪便中区分细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的虫卵，存在感染操作人员的风险；粪抗原elisa检测法和pcr均具有较好特异性和敏感性，但是费时费力、所需仪器复杂，不利于基层流行病学的调查和大量样品的检测。因此，建立一种快速、简便、灵敏的能用于细粒棘球绦虫的流行病学调查及现场诊断方法具有非常重要的意义。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供用于犬细粒棘球绦虫的lamp检测引物组、试剂盒及方法。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一组用于犬细粒棘球绦虫的lamp检测引物组，其包括：与犬细粒棘球绦虫的cox2基因序列结合的外侧引物对f3和b3，及与犬细粒棘球绦虫的cox2基因序列结合的内侧引物对fip和bip，其特征在于：所述f3和b3的核苷酸序列如seqidno.1和seqidno.2所示，所述fip和bip的核苷酸序列如seqidno.3和seqidno.4所示。

如上所述的用于犬细粒棘球绦虫的lamp检测引物在制备检测犬细粒棘球绦虫的lamp试剂盒或检测试剂中的应用。

本发明还提供了含如上所述用于犬细粒棘球绦虫的lamp检测引物的检测试剂盒。

优选地，所述检测试剂盒为lamp试剂盒，除了包含上述引物组外，还包括：环介导等温扩增缓冲液、阳性对照、阴性对照和/或显色液。

所述阳性对照为犬细粒棘球绦虫dna阳性样本或国内分离到的犬细粒棘球绦虫dna提取样本或含seqidno.5所示或cox2序列。

优选地，所述环介导等温扩增缓冲液为包括有tris-hcl、kcl、(nh4)2so4、tween-20、mgso4、甜菜碱(betaine)、脱氧核苷酸(dntps)、bstdna聚合酶的水溶液。

所述显色液包括sybrgreeni和羟甲基萘酚蓝(hnb)。进一步地，优选地，每2μl显色液所含有溶质的物质的量为：sybrgreeni0.16μmol，羟甲基萘酚蓝0.3μmol。

进一步，本发明还提供一种采用上述引物的快速检测犬细粒棘球绦虫的lamp检测方法，是用如上所述的犬细粒棘球绦虫的lamp检测引物对来自患病或死亡动物的待测样品dna进行环介导等温扩增反应，检测扩增产物，确定患病或死亡动物中是否携带犬细粒棘球绦虫；所述环介导等温扩增反应的条件为：63℃、30～60分钟。

如上所述的lamp检测方法可以通过仪器判读也可以直接检视判断样本是否含有犬细粒棘球绦虫，所述直接检视的方法为：检测时，同时设置以含犬细粒棘球绦虫的dna为阳性对照和以水进行检测的阴性对照；

观察反应后溶液，装有阳性对照的反应管有亮绿色可见荧光，装有阴性对照的反应管仍为棕黄色无荧光液体；如果装有待检测样品的反应管仍为棕黄色无荧光液体，则说明待检样品中犬细粒棘球绦虫检测结果为阴性；如果装有待检测样品的反应管有亮绿色可见荧光，则说明样品中犬细粒棘球绦虫检测结果为阳性。

具体地，如上所述采用上述引物的快速检测犬细粒棘球绦虫的lamp检测方法，其包括如下步骤：

s1、取犬粪便待检样本，提取dna；

s2、进行环介导的等温扩增，采用如上所述的引物组对提取的dna进行扩增；

s3、结果判定：通过仪器判读或通过直接检视判断样本是否含有犬细粒棘球绦虫，

如果装有待检测样品的反应管仍为棕黄色无荧光液体，则说明待检样品中犬细粒棘球绦虫检测结果为阴性；

如果装有待检测样品的反应管有亮绿色可见荧光，则说明样品中犬细粒棘球绦虫检测结果为阳性。

如上所述的lamp检测方法，优选地，在步骤s2中，在步骤s2中，同时设置以含犬细粒棘球绦虫的dna为阳性对照和以水进行检测的阴性对照。如上所述的lamp检测方法，优选地，在步骤s2中，所述环介导的等温扩增的扩增体系为在有23μl的lamp反应液的反应管中加入2μl所述dna，2μl显色液，扩增反应是在63℃恒温30～60分钟。

如上所述的lamp检测方法，优选地，所述23μl的lamp反应液，包括有tris-hcl0.5μmol、kcl0.25μmol、(nh4)2so40.25μmol、tween-200.025μl、mgso40.2-20μmol、甜菜碱20μmol、4种脱氧核苷酸各0.035μmol、bstdna聚合酶16u，所述内侧引物对fip和bip各0.04-0.06μmol，所述外侧引物对f3和b3各0.004-0.008μmol。

进一步，优选地，所述23μl的lamp反应液，可采用如下组份用量：tris-hcl0.5μmol、kcl0.25μmol、(nh4)2so40.25μmol、tween-200.025μl、mgso40.2μmol、甜菜碱20μmol、4种脱氧核苷酸各0.035μmol、bstdna聚合酶16u，所述内侧引物对fip和bip各0.04μmol，所述外侧引物对f3和b3各0.004μmol。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的一组用于犬细粒棘球绦虫的lamp检测试剂盒，可用于检测或筛查患病或死亡动物或离体样本或饲料等样品中是否携带犬细粒棘球绦虫，其使用方便，操作简便，成本低，所需条件仅在水浴锅或金属恒温加热器即可进行。本发明的检测方法具有灵敏度高、效率高、反应时间短、特异性高、操作简便、安全性好、结果判定简单等优点，且广泛适用于基层。

附图说明

图1为犬细粒棘球绦虫lamp检测方法的敏感性，n：阴性对照；标号1-6的溶液浓度分别为10⁰、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵copise/ml。

图2为犬细粒棘球绦虫pcr检测方法的敏感性，其中，m：100bpdnaladderdnaplusmass(5μl)；n：阴性对照；条带1-6：lamp反应中模板菌体含量为10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰copise/ml。

图3为犬细粒棘球绦虫lamp检测方法的特异性，其中，m：2kplusdnamarker；条带1-5：分别为阴性对照，阳性对照，犬蛔虫、弓形虫、钩虫dna。

图4为犬细粒棘球绦虫pcr检测的特异性，其中，m：2kplusdnamarker；条带1-5分别为阴性对照，阳性对照，犬蛔虫、弓形虫、钩虫dna。

图5为犬细粒棘球绦虫lamp检测临床样品在日光下可视化判读结果。

图6为犬细粒棘球绦虫lamp检测临床样品在紫外光下可视化判读结果。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1质粒的制备

使用犬细粒棘球绦虫dna，根据pcr方法扩增得到基因组cox基因序列，再与t载体连接后即形成所需要的mn基因的质粒，一个质粒分子对应一个拷贝的cox基因。将质粒转入感受态细胞，在合适的条件下培养感受态细胞，质粒可随着感受态细胞的繁殖而复制。最后从感受态细胞中提取纯化质粒。得到的质粒可通过分光光度计法测定并计算拷贝数浓度。

用双蒸水将质粒稀释到所需要的浓度，检测时加入各浓度质粒2μl，每个反应中对应含有10⁵拷贝/μl、10⁴拷贝/μl、10³拷贝/μl、10²拷贝/μl、10拷贝/μl、1拷贝/μl的质粒样本。(可参考《分子克隆试验指南》第三版，所需要的试剂和仪器均为市面可购买的。)

实施例2犬细粒棘球绦虫lamp检测方法

本发明针对犬细粒棘球绦虫，设计用于lamp检测时经过大量实验验证，最后确定用于lamp检测犬细粒棘球绦虫包括两对引物，其主要是针对犬细粒棘球绦虫的如seqidno.5所示(cox2基因序列)作为国内分离的犬细粒棘球绦虫的保守区域。其中，一对引物是与犬细粒棘球绦虫的cox2基因序列结合的内侧引物对，包括上游引物(fip)和下游引物(bip)；一对引物是与犬细粒棘球绦虫的cox2基因序列结合的外侧引物对，包括上游引物(f3)和下游引物(b3)。具体核苷酸序列为：

f3(seqidno.1)：5'-gctgttaaatttggtagtgagaa-3'

b3(seqidno.2)：5'-ctaccacaaaataatccccaat-3'

fip(seqidno.3)：5'-tcaaggcacacaaaactaatacaactttttcagattatagagttggtatgaac-3'

bip(seqidno.4)：5'-ttctgagactattaaggtggttggtttttcggaaacgaatcatagcca-3'。

用于犬细粒棘球绦虫的lamp检测引物的检测试剂盒，包括有上述引物，环介导等温扩增缓冲液、阳性对照、阴性对照和显色液，其中，所述环介导等温扩增缓冲液包括有tris-hcl、kcl、(nh4)2so4、tween-20、mgso4、甜菜碱、脱氧核苷酸、bstdna聚合酶的水溶液；每2μl显色液所含有溶质的物质的量为：sybrgreeni0.16μmol，羟甲基萘酚蓝0.3μmol。

采用上述试剂盒进行检测时，包括如下检测步骤：

(1)dna的提取

取犬粪便待检样本，使用试剂盒提取dna(本发明中使用的是transzol(trangen)dna提取试剂盒)。

(2)环介导的等温扩增

①在装有23μl的lamp反应液的反应管中加入2μl犬粪便待检dna样本。

②于水浴锅或金属恒温加热器上63℃(所有反应温度均为63℃)放置60分钟，取出。

(3)结果判定

可以通过直接检视判断样本是否含有犬细粒棘球绦虫。如果装有待检测样品的反应管仍为棕黄色无荧光液体，则说明待检样品中犬细粒棘球绦虫检测结果为阴性。如果装有待检测样品的反应管有亮绿色可见荧光，则说明样品中犬细粒棘球绦虫检测结果为阳性。其中，23μl的lamp反应液，所述溶质的物质的量如下：

tris-hcl0.5μmol、kcl0.25μmol、(nh4)2so40.25μmol、tween-200.025μl、mgso40.2-20μmol、甜菜碱20μmol、4种脱氧核苷酸各0.035μmol、bstdna聚合酶16u，所述内侧引物对的上游引物和下游引物各0.04-0.06μmol，所述外侧引物对的上游引物和下游引物各0.004-0.008μmol。

为确保结果的准确性，在检测是设定有阳性对照和阴性对照，其中，阳性对照为以含犬细粒棘球绦虫的dna作为模板进行检测，阴性对照为以水作为模板进行检测。结果判定时：观察反应后溶液，装有阳性对照的反应管有亮绿色可见荧光，装有阴性对照的反应管仍为棕黄色无荧光液体；如果装有待检测样品的反应管仍为棕黄色无荧光液体，则说明待检样品中犬细粒棘球绦虫检测结果为阴性；如果装有待检测样品的反应管有亮绿色可见荧光，则说明样品中犬细粒棘球绦虫检测结果为阳性。

实施例3犬细粒棘球绦虫的检测

本实施例中23μl环介导等温扩增反应液包括：4μl125mmol/ltris-hcl，2μl100mmol/lmgso4，2μl125mmol/lkcl，2μl125mmol/l(nh4)2so4，0.4μl50mol/lbetaine，0.025μltween-20，100mmol/ldntps各0.35μl，2μl12u/μlbstdna聚合酶大片段(newenglandbiolabs)，1μl40mmol/lfip，1μl40mmol/lbip，1μl5mmol/lf3，1μl5mmol/lb3，加灭菌双蒸水补至23μl，再加模板2μl。分别对上述各浓度的质粒样本进行检测，检测步骤如下：

(1)环介导等温扩增

在3支装有23μl的lamp反应液的反应管中各加入2μl实施例1中得到10⁴拷贝/μl的质粒样本，做为检测组1；在3支装有23μl的lamp反应液的反应管中各加入2μl实施例1中得到10³拷贝/μl质粒样本，做为检测组2；在3支装有23μl的lamp反应液的反应管中各加入2μl步骤一得到10²拷贝/μl质粒样本，做为检测组3；在3支装有23μl的lamp反应液的反应管中各加入2μl实施例1中得到10拷贝/μl质粒样本，做为检测组4；在3支装有23μl的lamp反应液的反应管中各加入2μl实施例1中得到1拷贝/μl质粒样本，做为检测组5；在3支装有23μl的lamp反应液的反应管中各加入犬细粒棘球绦虫dna阳性样本，做为阳性对照组；在3支装有23μl的lamp反应液的反应管中各加入2μl灭菌双蒸水，做为阴性对照组。

上述反应管同时在水浴锅上63℃放置60分钟，取出。

(2)直接检视

结果表明，阳性对照组的三个反应管均有亮绿色可见荧光，阴性对照组的三个反应管均为棕黄色无荧光液体。检测组1的三个反应管均有亮绿色可见荧光，检测组2的三个反应管均有亮绿色可见荧光，检测组3的三个反应管均有亮绿色可见荧光，检测组4的三个反应管均有亮绿色可见荧光，检测组5的三个反应管均为棕黄色无荧光液体。

实施例4灵敏度检测

将已知含量的犬细粒棘球绦虫cox基因质粒dna进行连续10倍倍比稀释10⁵～10⁰拷贝的质粒后作为模板，采用的lamp扩增体系为23μl环介导等温扩增反应液包括：2μl16u/μlbstdna聚合酶大片段(newenglandbiolabs)；12.5ullampbuffer：40mmol/ltris-hcl(ph8.8)，16mmol/lmgso4，20mmol/lkcl，20mmol/l(nh4)2so4，1.6mol/lbetaine，0.2％tween-20，2.5mmol/ldntps；1μl40mmol/lfip，1μl40mmol/lbip，1μl5mmol/lf3，1μl5mmol/lb3；加灭菌双蒸水补至23μl；模板加入2μl。

进行检测，同时用pcr检测方法(pcr程序见下)对已知犬细粒棘球绦虫浓度梯度的dna进行检测。

pcr程序：

f：5'-gctgttaaatttggtagtgagaa-3'，

r：5'-ctaccacaaaataatccccaat-3'

25μl反应体系：模板2μl，2×easytaqpcrsupermix(全式金生物)，上下游引物0.5μl，双蒸水补足至25μl。

反应程序：94℃变性5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。

用1％琼脂糖凝胶电泳确定pcr检测的敏感性，仪器判读可知，lamp检测犬细粒棘球绦虫的最低检测为10¹拷贝结果如图1所示，pcr检测犬细粒棘球绦虫的最低检测为10³拷贝结果如图2所示，lamp检测犬细粒棘球绦虫的敏感性是pcr的100倍。

实施例5特异性检测

采用实施例3中的lamp扩增体系及方法，对细粒棘球绦虫，多房棘球绦虫、犬复孔绦虫、泡状带绦虫dna，阴性对照为水，阳性对照为实施例1制备的质粒，以这些为模板，进行lamp检测，同时以实施例4中的pcr检测方法进行检测。lamp检测方法的结果如图3所示，pcr方法检测结果如图4所示，说明本发明方法特异性强，与目前的pcr特异性相同。

实施例6临床检测本实施例中23μl环介导等温扩增反应液包括：2μl16u/μlbstdna聚合酶大片段(newenglandbiolabs)；12.5μllampbuffer：40mmol/ltris-hcl(ph8.8)，16mmol/lmgso4，20mmol/lkcl，20mmol/l(nh4)2so4，1.6mol/lbetaine，0.2％tween-20，2.5mmol/ldntps；1μl40mmol/lfip，1μl40mmol/lbip，1μl5mmol/lf3，1μl5mmol/lb3；加灭菌双蒸水补至23μl。再在上述反应体系中加入1μlsybrgreeni和1μl羟甲基萘酚蓝(hnb)。判断结果时，若在紫外线下观察则阳性结果结果颜色为绿色，而阴性结果颜色为紫色。对临床采集的120份样本提取dna进行检测。结果表明，lamp与pcr方法检出阳性样本数分别为86份和65份，lamp方法检出率明显高于pcr方法。lamp方法检测样品的可视化显色结果如图5和图6。

lamp检测方法不需要昂贵的pcr仪，只需普通的金属或水浴锅即可，并且检测结果通过观察可见的荧光即可判定，操作简单方便。

与pcr检测方法相比，本发明的方法可应用于基层现场进行的犬细粒棘球绦虫即时检测。

序列表

<110>北京市动物疫病预防控制中心

<120>用于犬细粒棘球绦虫的lamp检测引物组、试剂盒及方法

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gctgttaaatttggtagtgagaa23

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ctaccacaaaataatccccaat22

<210>3

<211>53

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tcaaggcacacaaaactaatacaactttttcagattatagagttggtatgaac53

<210>4

<211>48

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ttctgagactattaaggtggttggtttttcggaaacgaatcatagcca48

<210>5

<211>1000

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ttggagtttttgtgtgttacattaataagggtgttattgtaagatgatgtgatttaggac60

ttaatagtaatgttaaatgagtttgttgatgtgaagagagtttagctcaggtacacaccg120

cccgtcaccctcggttgttattgaggtaagtcgtaacaaggtaactttaaatgaatttga180

agttaattattaggttgtcctagttgtagtgaaattgtcgttgttatattatgatattgt240

gtgttatattgtggcggtttgtgtatttattgtttgttttgtgtatgttttgttgtgttg300

gaatgtggtgtttggcgttggtactgttaaatttggtagtgagaatcagattatagagtt360

ggtatgaactgttattcctactgtggttgtattagttttgtgtgccttgaaagttaaatt420

tattactagtgatttagattgtttttcttctgagactattaaggtggttggtcatcagtg480

atattggacttacgagtattttggcggtggctatgattcgtttccgattggggattattt540

tgtggtagataagcctttgcggatggtttatggtgtaccatatcatttggttgtaacttc600

aagtgatgtaattcattcgttttctgttccttcattgaatttgaagatggatgctgttcc660

tggtcgtcttaatcatttgtttttttgtctttctcaacatgggtcttttgttggttattg720

tgctgaattgtgtggtgttaatcatagagttatgcctattgttgtggaggttgttggggg780

ttgttgttagtgtggttggtgtatgtctgttttagtataatttgtattacgttggctttt840

cgtgctgtagatggttgtttaattagacagattttatgttgttggaagtttttatagtta900

tgtatttttgtgtattggtgttattttgttttactagccattgtatttattattgtgtta960

tgttggtggtgaatgcgttattggctagttgtatttgtta1000