一种区分检测苯硫酚的试剂及其合成方法和应用与流程

本发明涉及苯硫酚检测，具体属于一种苯并噻唑衍生物合成方法及其在区分检测苯硫酚中的应用。

背景技术：

苯硫酚，在有机合成中发挥重要的作用，并广泛用于制备农用化学品，药品和各种工业产品。但是，硫酚比脂族硫醇更具毒性。在鱼类中的硫酚的平均致死剂量(lc50)为0.01-0.4mm。此外，长时间活动于含有苯硫酚的水、土壤、空气等环境中，会导致一系列严重的健康问题，包括中枢神经系统受损，呼吸急促，肌肉无力，后肢瘫痪，昏迷，甚至死亡。针对以上存在的问题，设计选择性好、灵敏度高、具有低细胞毒性的荧光探针用于区分检测检测环境样品和活细胞和组织内苯硫酚水平的变化，是非常有意义的。

在本发明中，合成了一种基于苯并噻唑的化合物，通过探针与苯硫酚在反应前后荧光强度的变化，实现对苯硫酚的区分检测。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种区分检测苯硫酚的试剂及其合成方法和应用，所述试剂可用于苯硫酚检测，检测方法简单，操作方便，选择性好，灵敏度高。

本发明提供的一种区分检测苯硫酚的试剂，它是一种苯并噻唑衍生物，中文名称为(e)-2-(苯并噻唑-2-基)-6-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-4-甲基苯基2,4-二硝基苯磺酸酯，英文名称为(e)-2-(benzothiazol-2-yl)-6-(2-(3-(dicyanomethylene)-5,5-dimethylcyclohex-1-en-1-yl)vinyl)-4-methylphenyl2,4-dinitrobenzenesulfonate，命名为syn，结构式为：

本发明提供的一种区分检测苯硫酚的试剂syn的合成方法，步骤为：

(1)按摩尔比1：1：0.01将2-氨基硫酚、5-甲基水杨醛和硝酸银添加到dmso中混合，室温下避光搅拌2小时；然后用二氯甲烷稀释3倍，用盐水洗涤，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，浓缩并用体积比1:6的乙酸乙酯/石油醚通过柱色谱法纯化，获得浅黄色固体即为2-苯并噻唑-2-基-4-甲基苯酚；

(2)按摩尔比1.8：3.9将化合物2-苯并噻唑-2-基-4-甲基苯酚和六亚甲基四胺溶解在三氟乙酸中，在搅拌下回流过夜；反应完成并冷却至室温后，使用氢氧化钾调节ph值到固体完全沉淀，过滤，用水洗涤，真空干燥并通过体积比1:5的乙酸乙酯/石油醚柱色谱法纯化，获得黄色固体的化合物3-(苯并噻唑-2-基)-2-羟基-5-甲基苯甲醛；

(3)按摩尔比1：1将化合物3-(苯并噻唑-2-基)-2-羟基-5-甲基苯甲醛和化合物2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯-1-基)丙二腈加入到乙醇中，在搅拌下加入0.1当量哌啶混合，加热回流10小时；反应完成并冷却至室温后，将混合物过滤，用乙醇洗涤，并在真空下干燥，得到橙红色固体化合物(e)-2-(3-(3-(3-苯并噻唑-2-基)-2-羟基-5-甲基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯-1-亚丙基)丙二腈；

(4)按摩尔比1：1.5将化合物(e)-2-(3-(3-(3-苯并噻唑-2-基)-2-羟基-5-甲基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯-1-亚丙基)丙二腈和2,4-二硝基苯磺酰氯加入到无水ch2cl2中混合，然后将混合物冷却至0℃，并在搅拌下逐滴加入3倍当量的et3n，在0℃下搅拌1h后，反应完成，将混合物过滤，分别用甲醇和ch2cl2洗涤，并在真空下干燥，得到呈黄色固体化合物(e)-2-(苯并噻唑-2-基)-6-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-4-甲基苯基2,4-二硝基苯磺酸酯。所述的试剂syn可用于苯硫酚检测的区分检测。

本发明提供的一种检测4-甲基苯硫酚的方法，步骤为：

(1)、配制ph＝7.4、浓度10mm的hepes缓冲溶液，将其与甲醇、乙腈按照体积比1:1:1配制成ch3oh/ch3cn/hepes溶液，配制0.2mm4-甲基苯硫酚的乙腈溶液，将苯并噻唑衍生物syn溶于dmso配制成2mm的溶液；

(2)、取2ml的ch3oh/ch3cn/hepes溶液、10μlsyn的dmso溶液加到一个荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着4-甲基苯硫酚的乙腈溶液的加入，686nm处的荧光强度逐渐增强；

(3)、加2mlch3oh/ch3cn/hepes溶液到荧光比色皿中，同时再加入10μlsyn的dmso溶液并使体系混合均匀，逐渐加入0.2mm4-甲基苯硫酚的乙腈溶液，所加4-甲基苯硫酚的乙腈溶液的体积为0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60μl，同时在荧光光谱仪上测定686nm处荧光强度为345.3、426.6、604.1、773.8、970.4、1147、1272、1397、1561、1776、1904、2033和2145，以4-甲基苯硫酚浓度为横坐标，以荧光强度f为纵坐标绘制图，得到4-甲基苯硫酚浓度的工作曲线；线性回归方程为：f686＝315.6c+314.6，c的单位为10^-6mol/l；

(4)、测定样品溶液时，将测得的荧光强度代入线性回归方程，即可求得4-甲基苯硫酚的浓度。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：

1、本发明苯并噻唑衍生物合成简单，成本低廉；

2、本发明苯并噻唑衍生物能实现对苯硫酚的区分检测，检测结果灵敏度高，响应时间短，选择性好；

3、本发明检测手段简单，只需要借助荧光光谱仪即可实现；

4、本发明采用红色通道检测，检测信号明显且专一性强。

附图说明

图1实施例1制备的苯并噻唑衍生物syn的核磁氢谱图

图2实施例1制备的苯并噻唑衍生物syn的核磁碳谱图

图3实施例1制备的苯并噻唑衍生物syn的质谱图

图4苯并噻唑衍生物syn与4-甲基苯硫酚作用的荧光发射图

图5苯并噻唑衍生物syn与各种分析物的荧光柱状图

图6苯并噻唑衍生物syn测定4-甲基苯硫酚的工作曲线

图7苯并噻唑衍生物syn测定4-甲基苯硫酚样品的荧光发射图

图8苯并噻唑衍生物syn测定4-甲基苯硫酚细胞成像图

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1

syn的制备和表征

在50ml的圆底烧瓶中，将2-氨基硫酚(5mmol，0.625g)和5-甲基水杨醛(5mmol，0.681g)添加到15mldmso中，并添加硝酸银(0.05mmol，0.009g)在搅拌下，使混合物在室温下在黑暗中反应2小时。反应完成后，将其用二氯甲烷(50ml)稀释3倍，用盐水洗涤，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，浓缩并通过柱色谱法纯化(乙酸乙酯/石油醚＝1：6)获得化合物浅黄色固体(0.893g，74.07％)，即为2-苯并噻唑-2-基-4-甲基苯酚。¹hnmr(600mhz,chloroform-d)δ8.01(d,j＝8.1hz,1h),7.93(d,j＝7.9hz,1h),7.56-7.48(m,2h),7.43(t,j＝7.5hz,1h),7.21(d,j＝8.3hz,1h),7.04(d,j＝8.4hz,1h),2.37(s,3h).¹³cnmr(150mhz,chloroform-d)δ169.41,155.79,151.84,133.79,132.60,128.72,128.34,126.67,125.47,122.12,121.52,117.68,116.33,20.51。

在25ml的单颈烧瓶中，将化合物2-苯并噻唑-2-基-4-甲基苯酚(1.8mmol，0.455g)和六亚甲基四胺(3.9mmol，0.546g)溶解在15ml三氟乙酸中。将混合物在搅拌下回流过夜。反应完成并冷却至室温后，使用氢氧化钾调节ph值，直到固体完全沉淀、过滤、用水洗涤，真空干燥并通过柱色谱法纯化(乙酸乙酯/石油醚＝1:5)获得黄色固体的化合物3-(苯并噻唑-2-基)-2-羟基-5-甲基苯甲醛(0.315g，64.90％)。¹hnmr(600mhz,chloroform-d)δ10.49(s,1h),8.09(d,j＝7.9hz,1h),7.97(d,j＝8.0hz,2h),7.73(s,1h),7.57(t,j＝7.7hz,1h),7.48(t,j＝7.6hz,1h),2.44(s,3h).¹³cnmr(150mhz,chloroform-d)δ158.55,150.89,135.37,132.97,129.10,127.02,125.96,123.61,122.26,121.63,118.50,20.35。

将化合物3-(苯并噻唑-2-基)-2-羟基-5-甲基苯甲醛(1mmol，0.269g)和化合物2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯-1-基)丙二腈(1mmol，0.186g)加入到10ml乙醇中，在搅拌下加入哌啶(0.15ml)，并将混合物加热回流10h。反应完成并冷却至室温后，将混合物过滤，用乙醇洗涤，并在真空下干燥，得到化合物(e)-2-(3-(3-(3-苯并噻唑-2-基)-2-羟基-5-甲基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯-1-亚丙基)丙二腈，为橙红色固体(0.263g,60.1％)。¹hnmr(600mhz,chloroform-d)δ8.01(d,j＝8.1hz,1h),7.95(d,j＝8.0hz,1h),7.60-7.54(m,2h),7.53(d,j＝3.9hz,2h),7.47(t,j＝7.1hz,1h),7.18(d,j＝16.2hz,1h),6.89(s,1h),2.63(s,2h),2.57(s,2h),2.42(s,3h),1.12(s,6h).¹³cnmr(150mhz,chloroform-d)δ169.49,169.10,154.72,154.55,132.58,131.43,130.82,129.96,129.83,128.82,126.93,125.86,124.56,123.54,122.15,121.63,117.04,113.67,112.88,78.27,77.24,43.08,39.11,32.10,28.06,20.63。

将化合物(e)-2-(3-(3-(3-苯并噻唑-2-基)-2-羟基-5-甲基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯-1-亚丙基)丙二腈(1mmol，0.44g)和2,4-二硝基苯磺酰氯(1.5mmol，0.4g)加入到20ml无水ch2cl2中，然后将混合物冷却至0℃，并在搅拌下逐滴加入et3n(3mmol，0.42ml)。在0℃下搅拌1h后，反应完成，将混合物过滤，分别用甲醇和ch2cl2洗涤，并在真空下干燥，得到呈黄色固体的探针(e)-2-(苯并噻唑-2-基)-6-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-4-甲基苯基2,4-二硝基苯磺酸酯(0.61g，90.1％)。¹hnmr(600mhz,dmso)δ8.89(d,j＝2.0hz,1h),8.13(s,1h),8.04(s,2h),7.85(s,1h),7.83–7.78(m,2h),7.51(s,1h),7.46(s,1h),7.38(d,j＝7.3hz,1h),7.24(d,j＝9.4hz,1h),6.93(s,1h),2.65(s,2h),2.48(s,3h),2.42(s,2h),1.02(s,6h).¹³cnmr(151mhz,dmso-d6)δ170.52,142.38,139.44,135.61,134.08,133.20,132.75,132.23,132.15,130.56,128.62,128.39,127.46,127.05,126.42,125.12,123.65,122.65,120.81,114.00,113.12,78.74,42.49,38.40,32.12,27.83.esi-msm/z:[syn+h]⁺calcdfor668.12682；found668.12698。(分别见图1、图2、图3)

实施例2

配制ch3oh/ch3cn/hepes(10mm)(1:1:1,v/v/v,ph＝7.4)溶液，配制2mmsyn的dmso溶液，配制0.2mm对甲基苯硫酚乙腈溶液；取2mlch3oh/ch3cn/hepes(1:1:1,v/v/v,ph＝7.4)溶液、10μlsyn的dmso溶液加到一个荧光比色皿中，取对甲基苯硫酚的水溶液，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，加样的同时在荧光分光光度仪上检测，随着对甲基苯硫酚的加入，686nm的荧光强度逐渐增强。荧光发射图见图4。

实施例3

配制ch3oh/ch3cn/hepes(10mm)(1:1:1,v/v/v,ph＝7.4)溶液，配制2mmsyn的dmso溶液，配制2mm对甲基苯硫酚乙腈溶液；在荧光比色皿中，各加入2ml的ch3oh/ch3cn/hepes(1:1:1,v/v/v,ph＝7.4)溶液和10μlsyn的dmso溶液，再分别加入10倍当量的其它分析物(1)cys，(2)hcy，(3)gsh，(4)so3^2-，(5)s^2-，(6)f^-，(7)cl^-，(8)oac^-，(9)i^-，(10)苯胺，(11)苯酚的水溶液，以及2倍当量苯硫酚同系物的乙腈溶液(12)4-氨基苯硫酚(20μm)、(13)苯硫酚(20μm)和(14)4-甲基苯硫酚(20μm)。在荧光分光光度仪上检测，绘制不同分析物对应的686nm处荧光强度柱状图(见图5)。对甲基苯硫酚、对氨基-苯硫酚、苯硫酚可使得检测体系在686nm处荧光强度明显升高，其它的分析物基本没有引起检测体系荧光强度的变化。

实施例4

配制ch3oh/ch3cn/hepes(10mm)(1:1:1,v/v/v,ph＝7.4)溶液，配制2mmsyn的dmso溶液，配制0.2mm对甲基苯硫酚乙腈溶液；在13个比色皿中各加入2ml的ch3oh/ch3cn/hepes(1:1:1,v/v/v,ph＝7.4)溶液和10μlsyn的dmso溶液，然后分别加入对甲基苯硫酚溶液的体积为0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60μl，同时在荧光光谱仪上测定686nm处荧光强度为345.3、426.6、604.1、773.8、970.4、1147、1272、1397、1561、1776、1904、2033和2145，以对甲基苯硫酚浓度为横坐标，以荧光强度f为纵坐标绘制图，得到对甲基苯硫酚浓度的工作曲线；线性回归方程为：f686＝315.6c+314.6，c的单位为10^-6mol/l，见图6。

实施例5

配制ch3oh/ch3cn/hepes(10mm)(1:1:1,v/v/v,ph＝7.4)溶液，配制2mmsyn的dmso溶液，配制2mm对甲基苯硫酚乙腈溶液；在荧光比色皿中，各加入2ml的ch3oh/ch3cn/hepes(1:1:1,v/v/v,ph＝7.4)溶液和10μlsyn的dmso溶液，取对甲基苯硫酚的溶液40μl，用微量进样器加到此比色皿中，同时在荧光光谱仪上测定686nm荧光强度为1568，通过实施例4的线性回归方程，求得c＝3.97×10^-6mol/l，与理论值的相对偏差为0.75％，见图7。

实施例6

配制ch3oh/ch3cn/hepes(10mm)(10mm)(1:1:1,v/v/v,ph＝7.4)溶液，配制2mmsyn的dmso溶液，配制0.2mm对甲基苯硫酚乙腈溶液；把10μlsyn的dmso溶液加入到2ml的hepes中；将探针溶液加入hela细胞培养皿中，使得其浓度为10μm，与hela细胞在37℃下，反应15min，体系在荧光成像仪下几乎没有荧光；然后再加入外源的对甲基苯硫酚，使其浓度为10μm，在37℃下，反应1min，体系在荧光成像仪下显示红色荧光,见图8。