含有噻唑烷-4-酮的免疫调节剂及其应用的制作方法

本发明涉及药物领域，尤其涉及含有噻唑烷-4-酮的免疫调节剂及其应用。

背景技术：

自体免疫细胞疗法是肿瘤生物治疗的重要方法之一。自体免疫细胞疗法是将从自体外周血中分离出单个核细胞，在多种免疫活性因子的作用下，通过体外培养，有效活化和扩增为免疫活性细胞，包括nk细胞、cik细胞和nkt(naturalkillert)细胞等，再输入患者体内，使免疫细胞直接杀伤肿瘤细胞或病毒感染细胞，或调节和增强机体的免疫功能的治疗方法

nkt细胞是人外周血单个核细胞在体外经il-2等多种细胞因子刺激后，获得的以表达cd³⁺cd⁶⁺标志为主的免疫效应细胞，具有t淋巴细胞的杀瘤活性，为新一代杀伤效应细胞。nkt细胞的主要特征为t细胞受体(tcr)基因表达的恒定性、cd1d的限制性以及细胞因子产生的迅速、高水平性。nkt细胞既能增强免疫反应又能抑制免疫反应，从而在抗肿瘤、抗感染、抑制自身免疫性疾病及移植耐受中发挥重要作用。nkt细胞虽也以cd³⁺cd⁶⁺标志的细胞为效应细胞，但是和cik细胞的不同，nkt来源于外周血中cd^4-cd^8-标志的细胞。

孟明等人在《中华微生物学和免疫学杂志》2013年6月中提到了一种含噻唑烷-4-酮的免疫调节剂，其能够显著促进纯化的inkt细胞体外增殖，但是其增殖率仅有30％左右，因此，存在进一步的改进空间。本发明正是在该文献的基础上，通过对化合物进行改造，以便能够进一步提高含噻唑烷-4-酮的免疫调节剂对于inkt细胞的增殖效率。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种能够促进nkt细胞体外增殖的免疫调节剂。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：

本发明的目的之一是提供含有噻唑烷-4-酮的免疫调节剂或其对映异构体，

所述噻唑烷-4-酮的免疫调节剂具有如下的结构：

在上述结构式中，所述x为卤素。

出人意料的，本发明通过在噻唑烷-4-酮引入卤素取代基，特别是引入cl取代基，有效的提升了其对nkt细胞的增殖作用。

在本发明的一个优选实施方式中，所述x为选自cl或br的卤素。

本发明另一方面还涉及上述含有噻唑烷-4-酮的免疫调节剂的制备方法，所述方法是由下式所示的ch1a在通入cl2的情况反应得到。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的反应是在na2co3的存在下进行的。通过加入na2co3控制体系的ph维持在9～11之间，有助于反应的顺利进行。

本发明另一方面还涉及上述含有噻唑烷-4-酮的免疫调节剂的应用，特别是在制备免疫调节剂中的应用。

本发明另一方面还涉及上述含有噻唑烷-4-酮的免疫调节剂在促进nkt细胞增殖中的应用。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的nkt细胞是inkt细胞。

在本发明的另一个优选实施方式中，所述的细胞增殖是指体外细胞增殖。

本发明首次通过在噻唑烷-4-酮引入卤素取代基，特别是引入cl取代基，有效的提升了其对nkt细胞的增殖作用，有助于其作为免疫调节剂的应用。

附图说明

图1：化合物ch1a-cl的¹h-nmr图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以下是对本发明的解释而不是限定，本发明中所用的方法及其相关的试剂，可以有其他可选择和替代方案，能够达到相同技术结果即可。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照所属领域的常规操作进行，或按照制造厂商所建议的条件进行。

合成实施例1

选择下式左侧的ch1a作为反应原料，以水作为溶剂得到浓度为1mm的溶液，然后加入na2co3调整溶液的ph值为10.0，通入cl2反应20分钟，反应结束后停止通cl2，加入氯仿萃取，减压蒸馏，然后通过hplc以乙醇作为流动相进行分离得到目标产物，目标产物ch1a-cl的¹h-nmr如图1所示。

实施例2：细胞增殖实验

将inkt细胞以2×10⁶个/ml密度接种在96孔平底培养板上，每孔90微升，实验设阴性对照组(常规培养基)、阳性对照组(常规培养基中加入10μmol/l的ch1a)和实验组(常规培养基中加入10μmol/lch1a-cl)，每组设6个复孔，置于37℃，5％co2条件下培养60小时，每孔加入10μl5mg/ml的mtt溶液，继续培养4h，2500rpm离心10分钟，弃上清液，每孔加入100μldmso，震荡均匀后570nm处测定吸光度(a)值，根据公式计算增殖率：增殖率＝(a给药组-a阴性对照组)*100％。

实验结果显示，阳性对照组的细胞增值率为32±6％，而实验组的细胞增值率为45±5％，由此说明，ch1a通过氯化实现了更好的细胞增殖活性。

实施例3：荧光标记靶细胞阵列辅助t细胞分析法(fluorescenttargetarraythelperassay)

将inkt细胞的密度调整为1×10⁶/ml，加入5μmol/mlcfda-se，置于37℃水浴中标记15min，在标记过程中每隔一段时间混匀细胞1次；加入预冷的、含有血清的培养基中止标记，在4℃冰箱中静置5min，离心沉淀；用培养基再洗涤1次，尽量洗净未结合的游离的cfda-se。然后将目标细胞置于增殖体系中。将cfda-se标记后的inkt细胞用含100ml/l胎牛血清的rp-mi1640调整密度到2×10⁶/ml，培养于96孔板中，每孔90μl(1.8×10⁶个细胞)。实验设1l-2组(阴性对照组)、il-2+ch2a组(阳性对照组)及il-2+ch2a-cl组(实验组)。1l-2组加入10μlil-2(100ng/ml),il-2+ch2a组加入10μl1l-2(100ng/ml)和10μl最佳有效浓度的ch2a(50μmol/l),il-2+ch2a-cl组加入10μlil-2(100ng/ml)和10μl最佳有效浓度的ch2a-cl(50μmol/l)；每组设3个复孔，置于50ml/lco2,37℃培养箱孵育，68h时加入10μlbd公司的golgi反应终止液，72h时收集细胞。

利用流式细胞技术(fcm)检测细胞表面特异性黏附分子。以阴性对照组的inkt细胞的增值率为100％作为基准，与阴性对照组相比，阳性对照组(il-2+ch2a组)的细胞增值率增加了25±3％，实验组(il-2+ch2a-cl组)的细胞增值率增加了37±5％。

细胞孵育72h后，inkt细胞的增殖呈现不同分代状态。阴性对照组中，inkt细胞约96％停留在前3代(generation0～2)；阳性对照组中，在il-2+ch2a共同剌激下，60％为后4代(generation4～7)的inkt细胞；阳性对照组中，在il-2+ch2a-cl共同剌激下，82％为后4代(generation4～7)的inkt细胞。

以上具体实施方式仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神及原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。