一种基于稀土金属的酶响应型探针及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于稀土金属的酶响应型探针及其制备方法和应用。


背景技术：

2.酶是生物体新陈代谢的催化剂，对维持生物体各项生化生理反应的正常运作发挥着重要作用。随着人们对酶的进一步认知，发现了生物酶与细胞活动、病理反应、疾病发生等息息相关，大多数疾病的发生均与酶缺乏或合成障碍有关。因此，酶在疾病预防、早期诊断、药物反应等方面具有指示作用。碱性磷酸酶是一类重要的酶类疾病标志物，与癌症、骨骼疾病、肝胆疾病、糖尿病等重大疾病的发生、发展密切相关。碱性磷酸酶的浓度高低是相关疾病确诊的最直接证据，并且有助于临床治疗效果的跟踪，便于病情的缓解与处理。因此，实现对碱性磷酸酶标志物的高灵敏检测对建立精准的健康状况评估体系、疾病的预防、早期预警、诊断等具有极为重要的意义。
3.目前对碱性磷酸酶的检测方法主要有电化学法、表面增强拉曼光谱法、荧光分析法等。其中，荧光分析法因其对仪器的要求不高且操作简单、灵敏度高、具有良好的选择性等优势被广泛应用。但传统荧光分析法中所用的有机染料、量子点、金属有机框架材料等存在光化学稳定性差、毒性大、成本高、耗时长等问题，并且无法避免待测样品中复杂生物分子的干扰，使得这些方法无法实现对碱性磷酸酶浓度快速精准的直接检测。
4.与传统有机染料、量子点、金属有机框架材料等相比，稀土下转换发光材料具备长寿命荧光发射的独特优势，因此通过控制合适的延迟时间和数据采集时间可以有效去除来自待测样品及仪器内部的短寿命非特异性荧光和杂散光的干扰。另外，稀土下转换发光光谱带窄，有助于降低本底，提高分辨率；发射光谱位于可见光区域，可以通过肉眼直接观察发射光的强弱；稳定性优越，可以长时间保存备用，克服了有机染料光漂白与量子点光闪烁等问题。诸多优势使得稀土荧光探针非常适合于复杂生物体系中碱性磷酸酶浓度的直接检测。开发一种基于稀土共振能量传递的荧光检测方法，用于复杂体系中碱性磷酸酶水平的精准检测，达到便捷、精准、经济的检测目的，是本发明的重点和意义所在。


技术实现要素：

5.为改善上述问题，本发明提供了一种基于稀土金属的酶响应型探针，所述探针包括稀土金属离子组和磷脂分子。
6.根据本发明的实施方案，所述稀土金属离子组可以为选自镧(la)、铈(ce)、镨(pr)、钕(nd)、钷(pm)、钐(sm)、铕(eu)、钆(gd)、铽(tb)、镝(dy)、钬(ho)、铒(er)、铥(tm)、镱(yb)、镥(lu)、钇(y)和钪(sc)中的两种或两种以上的稀土离子构成的离子组；例如铈-铽(ce-tb)、铈-铕(ce-eu)、铈-镝(ce-dy)、铽-铕(tb-eu)、铈-钕(ce-nd)、铈-钆(ce-gd)、铈-铒(ce-er)、钆-铕(gd-eu)、钆-铽(gd-tb)、钆-镝(gd-dy)、钆-铽-铕(gd-tb-eu)或铈-镱-铒(ce-yb-er)离子组，优选为，铈-铽离子组。
5)，(1-4):(4-1):(1-4)，(1-3):(3-1):(1-3)，如1:1:1，1:2:1，2:1:1，1:1:2。
16.根据本发明，步骤2)中，所述缓冲溶液可以为n-甲基-d-葡萄糖胺(meg)缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(amp)缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸(tris-hcl)缓冲液；示例性地为tris-hcl缓冲液；所述缓冲液的ph可以为7.0-9.0，优选ph为9.0。
17.根据本发明，步骤2)中，所述磷脂分子溶液浓度可以为0.5-32mm；例如，1-30mm，1.5-28mm，2-25mm，例如，1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm。
18.根据本发明，步骤1)和步骤2)中配制所述溶液所用的溶剂可以为水。
19.根据本发明，步骤3)中，所述稀土离子溶液与所述磷脂分子溶液混合的体积比可以为1:5-5:1；例如，1:4-4:1、1:3-3:1、1:2-2:1、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1。
20.本发明提供所述基于稀土金属的酶响应型探针的用途，其可用于检测碱性磷酸酶。
21.本发明还提供一种碱性磷酸酶检测方法，包括如下步骤：
22.1)将所述基于稀土金属的酶响应型探针与缓冲液混合，得到探针溶液；
23.2)将碱性磷酸酶与缓冲液混合，得到碱性磷酸酶溶液；
24.3)将步骤1)的探针溶液与步骤2)的碱性磷酸酶溶液混合，恒温振荡，测定待测样品中碱性磷酸酶的荧光强度，根据标准曲线计算待测样品中碱性磷酸酶的浓度；
25.根据本发明的实施方案，所述恒温振荡的温度可以为25-40℃，例如为30-39℃，35-38℃，37℃，；所述恒温振荡的时间可以为0.5-5h，例如为3h。
26.根据本发明的实施方案，步骤1)中，所述探针溶液的浓度选自0.5-32mm；例如，1-30mm，1.5-28mm，2-25mm，例如，1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm。
27.根据本发明，步骤2)中，所述碱性磷酸酶溶液的浓度可以为0-5000u/l；例如为3000、2500、2000、1500、1250、1000、750、500、250、125、62.50、31.25、15.63、7.81、0u/l；
28.在本发明中，以“铈-铽”离子组为例，该离子组通过与磷脂分子配位拉近彼此间的距离，以f-d电偶极允许跃迁的ce
3+
作为敏化离子，敏化tb
3+
的发光，实现了铈离子到铽离子的高效能量传递过程。在敏化离子ce
3+
的激发光激发下，通过交叉弛豫，ce
3+
将能量传递给tb
3+
，使tb
3+
的高能级电子无辐射跃迁至5d4，进而分别辐射跃迁至7f6，7f5，7f4，使tb
3+
的荧光发射信号显著增强。进一步的研究发现，碱性磷酸酶的存在可以有效断裂atp中的磷脂键，从而使探针中铈-铽间距离变远，造成荧光猝灭。碱性磷酸酶的含量与荧光猝灭效果正相关，因此利用这种性质可以通过所述探针实现对碱性磷酸酶的定性定量检测。
29.有益效果
30.本发明的基于稀土金属的酶响应型探针具有以下技术效果：
31.(1)本发明设计的探针利用磷脂类分子与稀土离子间的强配位作用，可以有效缩短稀土敏化离子与稀土激活离子间的能量传递距离，实现稀土激活离子发光的有效增强。该探针荧光信号的酶响应性优越，可以有效提高检测灵敏度。
32.(2)根据本发明探针设计的检测方法与传统的荧光分析法相比，避免了使用有机染料、量子点、金属有机框架等材料具有的成本高、稳定性低、毒性大等缺点，通过磷脂分子与稀土离子构成的探针，实现对待测物的检测，具有绿色环保、成本低廉等优点。
33.(3)本发明利用稀土离子的长荧光寿命特性，克服了生物复杂体系中背景荧光、杂散光等干扰，可以用于碱性磷酸酶或磷脂类相关物质的检测，并进一步实现对血清或全血样品中碱性磷酸酶或磷脂类相关物质的检测，具备操作简便、抗干扰性好、快速灵敏、成本低，应用范围广泛等优点，可为解决复杂生物体系中酶类疾病标志物的实时监测提供理论依据和技术支持，具有一定的临床应用前景。
附图说明
34.图1为所述稀土金属的酶响应型探针用于alp检测的原理示意图；
35.图2示出了制备例1的酶响应型探针的物化表征结果；
36.图3示出了实施例1所述加入不同浓度碱性磷酸酶作用后混合液的(a)荧光光谱图和(b)荧光强度的alp浓度依赖型响应曲线；
37.图4示出了实施例3中所述酶响应型探针对碱性磷酸酶的特异性验证结果；
38.图5示出了实施例3中所述碱性磷酸酶在血清中的检测：(a)在血清中稳态和时间分辨模式下的荧光对比，(b)加入不同浓度碱性磷酸酶作用后混合液的荧光光谱图，(c)和(d)荧光强度的alp浓度依赖型响应曲线；
39.图6示出了制备例1的双离子探针与对照制备例的单离子探针的荧光强度对比结果。
40.术语和定义
41.本发明中“磷脂键”意指磷酸h3po4脱去一个、两个或三个羟基后与一个、两个或多个磷酸分子或其它含羟基的分子脱去羟基上的氢之后形成的化学键；所述含羟基的分子可以为腺苷、鸟苷、尿苷、黄苷、肌苷、胞苷、胸苷。
42.本发明中“磷脂分子”意指包含磷脂键的分子，所述分子可以为含磷脂键的磷酸苷，所述磷酸苷可以为三磷酸腺苷(atp)、二磷酸腺苷(adp)、一磷酸腺苷(amp)、三磷酸鸟苷(gtp)、二磷酸鸟苷(gdp)、一磷酸鸟苷(gmp)。
具体实施方式
43.下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。应理解，本发明的保护范围不仅限于以下实施例。根据本发明公开的内容，在阅读了本发明所记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样属于本发明所限定的范围。
44.除非另有说明，实施例中采用的原料或试剂均可商购获得，或者可通过已知的方法制备。
45.仪器：检测透射电镜图的仪器型号为jeol公司生产的jem-2010；检测荧光信号的仪器为biotek公司生产的型号为synergy 4的荧光酶标仪。
46.制备例1：基于稀土金属的酶响应型探针(双离子探针)的合成
47.所述探针通过室温搅拌法制备，以稀土硝酸盐、atp化合物为原料，制备方法如下：
48.(1)分别称取相同物质的量的ce(no3)3·
6h2o、tb(no3)3·
6h2o溶解在ph＝9.0的tris-hcl水溶液中，配制成稀土离子的总浓度为4mm的稀土离子溶液；
49.(2)称取atp溶解在tris-hcl水溶液中，配制成浓度为2mm的atp溶液；
50.(3)取步骤(1)中的稀土离子溶液各1ml均匀混合，滴加到1ml步骤(2)中的atp溶液中，室温搅拌反应一分钟。
51.制备得到的探针(也称为双离子探针)的表征结果见图2，其中，(a)、(b)为双离子探针的透射电镜图；(c)为双离子探针的xrd衍射图样；(d)为双离子探针的x射线光电子能谱分析；(e)为双离子探针的红外吸收谱。由结果可以看出制得的atp-ce/tb双离子探针尺度在20-50nm，且为无定形态(非晶态)。
52.对照制备例：基于稀土金属的酶响应型探针(单离子探针)的合成
53.atp-ce单离子探针的制备
54.(1)配制浓度为4mm的ce(no3)3·
6h2o稀土离子溶液(tris-hcl，ph＝9.0)；
55.(2)称取atp溶解在tris-hcl水溶液中，配制成浓度为2mm的atp溶液；
56.(3)取步骤(1)中的稀土离子溶液2ml缓慢滴加到1ml步骤(2)中的atp溶液中，室温搅拌反应一分钟；
57.(4)离心清洗，将沉淀复分散于超纯水中，低温保存备用。
58.atp-tb单离子探针的制备
59.(1)配制浓度为4mm的tb(no3)3·
6h2o稀土离子溶液(tris-hcl，ph＝9.0)；
60.(2)称取atp溶解在tris-hcl水溶液中，配制成浓度为2mm的atp溶液；
61.(3)取步骤(1)中的稀土离子溶液2ml缓慢滴加到1ml步骤(2)中的atp溶液中，室温搅拌反应一分钟；
62.(4)离心清洗，将沉淀复分散于超纯水中，低温保存备用。
63.图6示出了双离子探针与单离子探针的荧光强度对比。从该图中可明显看出atp-ce/tb探针荧光强度较单离子探针(atp-ce和atp-tb)的荧光强度具有明显增强。说明单离子发光微弱，双离子体系利用敏化大大提升发光强度从而拥有更高的检测灵敏度。
64.实施例1：碱性磷酸酶浓度的检测
65.(1)以聚苯乙烯96孔板为检测所用载体，在设置好的微孔中依次加入7行100μl制备例1中制备的探针溶液，每行浓度分别是32、16、8、4、2、1、0.5mm，每列依次加入100μl不同浓度的碱性磷酸酶(alp)水溶液，其浓度分别是3000、2500、2000、1500、1250、1000、750、500、250、125、62.50、31.25、15.63、7.81、0u/l；置于37℃恒温振荡3小时，分别测得7行15列混合液的荧光强度，并计算各组混合溶液的荧光猝灭效率；当荧光猝灭效率最大时混合液所对应的探针浓度为4mm，以碱性磷酸酶在混合液中的浓度对tb
3+
的荧光强度作图，可以得到碱性磷酸酶的浓度依赖型曲线，见图3。
66.图3a表明本发明建立的检测体系对一定浓度范围内的碱性磷酸酶具有响应，且碱性磷酸酶的浓度越高，所对应的混合液荧光强度越弱。图3b表明在一定浓度范围内荧光强度与碱性磷酸酶的浓度呈现良好的线性关系。
67.图3a和图3b的结果表明，本实施例的检测方法可以实现对碱性磷酸酶浓度的检测。
68.实施例2：对待测碱性磷酸酶的检测特异性验证
69.(1)实验所需的试剂、仪器、探针均与实施例1一致。
70.(2)实验选取血液中常见干扰物：精氨酸、甘氨酸、生物素、柠檬酸、乳糖、牛血清白蛋白(bsa)、葡糖氧化酶(god)、胆碱酯酶、金属离子(k
+
、ca
2+
、cl-、na
+
、mg
2+
)。
71.(3)在96孔板中对检测孔板进行分组设定之后，将100μl浓度为100mg/ml的上述干扰物水溶液和100μl浓度为100u/l的碱性磷酸酶水溶液加入到100μl含有探针(终浓度为4mm)的ph＝9.0的tris-hcl缓冲溶液中，将96孔板置于37℃恒温振荡反应3小时，将反应后的96孔板置于酶标仪中测定各组混合溶液的荧光强度，其对应的荧光强度值见图4。
72.由图4的柱形图可以看出，只有碱性磷酸酶能够使荧光显著猝灭，而其余干扰物对荧光强度的影响不明显，表明所述探针对碱性磷酸酶的检测具有很好的特异性，在实际检测中能够避免这些干扰物的影响。
73.实施例3：对于复杂体系样品中碱性磷酸酶回收率的考察
74.1.实验所需96孔板设定和仪器与实施例1相同，实验所需探针溶液与实施例1相同。
75.2.复杂体系检测的模型基质为健康人血清和全血样品。
76.对于血清或全血样品中碱性磷酸酶浓度的检测，利用加标回收率实验来验证其可行性，具体操作步骤如下：
77.取经过高温处理蛋白质灭活的两份健康人血清样品和一份健康人全血样品(其中的碱性磷酸酶已失活)，用tris-hcl缓冲溶液(ph＝9.0)将血清样品和全血样品均稀释50倍，并将其作为基质各加入一定量的碱性磷酸酶；在预设好的微孔中分别加入100μl浓度为4mm的探针溶液，加入50μl用血清样品和全血样品稀释后的碱性磷酸酶溶液，之后用tris-hcl缓冲溶液(ph＝9.0)将待测溶液定容至200μl。各混合液中探针的浓度为2mm，碱性磷酸酶浓度分别为50u/l、100u/l、200u/l。37℃恒温振荡反应3h后，置于酶标仪中测定混合液位于550nm处的荧光强度，然后代入标准曲线计算血清和全血样本加样后的碱性磷酸酶含量，计算加样回收率。具体结果详见表1，结果显示血清样本和全血样本的加样回收率数值均落在合理范围内，表明本实施例检测体系具有良好的精密度和重现性。
78.表1实施例3中碱性磷酸酶的检测结果
79.