本发明属于基因工程
技术领域：
：，涉及水稻钾离子转运蛋白基因oshak18的基因工程应用。
背景技术：
：：钾(k)作为植物生长必需的三大矿质营养元素之一，也是植物体内最丰富的一价阳离子，大约占植株干重的4-10％(leighandwyn,1984)，在植物的整个生长发育过程中都起着极为重要的作用，例如，维持离子平衡、调节渗透压、调节酶的活性、参与蛋白质代谢、促进光合作用效率、参与养分运输和重新分配等(armengaudetal.,2004；anschützetal.,2014)。同时，k在植物体内的高度移动性，在根部吸收的k会由木质部运输到地上部，然后80％左右的k又会通过韧皮部重新输送到地下部，实现k在植物体内循环分配再利用(deekenetal.,2002)。一般来说，植物细胞质内k的浓度保持在100mm左右；当植物k吸收不足时，很多生理生化过程都将受阻，植物的生长发育也会受到影响；在农作物中，低k直接影响到作物的产量(brittoetal.,2008)。由于全球钾矿资源大量耗竭和分布不均匀(mengelandkirkby,1987)，作物缺k成为全球粮食生产的限制因子。如何通过生物技术手段增强作物在低k环境下k的吸收，维持作物体内的k的稳态平衡，提高k利用效率，这对于提高作物产量和品质意义重大，也是降低农业生产成本和维持农业可持续发展的重要途径。除了矿质养分之外，在影响作物产量的因素当中，它们的株型无疑是决定性要素。如六十年代的绿色革命，就是通过对小麦和水稻的矮化育种，提高它们的抗倒伏性，并配合化肥和农药的施用提高产量，因此在全世界拯救了数十亿的饥饿人口。水稻地上部的株型由株高、有效分蘖数、分蘖角度及穗粒数等构成，其中有效分蘖数对产量有至关重要的影响(jiaoetal.,2010)。因此提高植株的有效分蘖数也是育种学家重点关注的要素。技术实现要素：本发明的目是提供水稻k+转运蛋白基因oshak18的工程应用，主要是增加分蘖，提高产量及提高钾养分效率的功能。本发明的目的通过如下技术实现：水稻钾离子转运蛋白基因oshak18，cdna序列如seqidno.1所示。一种重组表达载体，含有所述的水稻钾离子转运蛋白基因oshak18。所述的重组表达载体，优先出发载体为ptck303载体。所述的重组表达载体，进一步优选是所述的水稻钾离子转运蛋白基因oshak18插到ptck303载体kpni和spei酶切位点后用hindⅲ和kpni双酶切除ubiquitin并插入oshak18基因自身启动子所得。所述的水稻钾离子转运蛋白基因oshak18在增加作物的有效分蘖数和提高作物产量中的应用。所述的水稻钾离子转运蛋白基因oshak18在加强光合产物由地上部(源)向根(库)的转运中的应用。所述的水稻钾离子转运蛋白基因oshak18在创建提高水稻有效分蘖及产量、提高钾养分效率及加强光合产物由地上部(源)向根(库)的转运的新的水稻种质中的应用。所述的重组表达载体在增加作物的有效分蘖数和提高作物产量中的应用。所述的重组表达载体在加强光合产物由地上部(源)向根(库)的转运中的应用。所述的重组表达载体在创建提高水稻有效分蘖及产量、提高钾养分效率及加强光合产物由地上部(源)向根(库)的转运的新的水稻种质中的应用。本发明的有益效果：我们对clusteriii的一个成员oshak18的研究发现由oshak18自身启动子引导的转基因日本晴水稻品种在田间和桶培表现为株高降低，有效分蘖和总分蘖数较野生型材料有大幅度增加，且水稻单株产量提高了25％左右，对这一基因的开发利用可为实现水稻高产和养分高效的协同作用提供了一个新途径。另外，我们还发现oshak18转运体参于水稻体内钾由地上部向根部的循环，这一循环决定了光合产物向根部的运输和分配，这一功能也是目前对hak家族的基因功能的最新发现。因此，对此基因的应用有利于通过提高有效分蘖而提高水稻产量，并同时提高水稻的养分效率。1.本发明中，世界上首次发现由水稻k+转运蛋白基因oshak18构建的重组表达载体，通过农杆菌介导的水稻转基因技术转染到野生型水稻日本晴(oryzasativa.ssp.cv.japonica)中，我们发现oshak18转基因水稻材料的总分蘖、有效分蘖数和籽粒产量与野生型水稻相比显著提高。2.本发明中的oshak18基因来源于水稻，启动子也是oshak18基因上游的序列，不是外源基因，因此具有生物安全性，所构建的水稻k+转运蛋白基因oshak18植物表达载体可以直接用于农杆菌介导的植物遗传转化，获得oshak18基因增加植物有效分蘖的新种质。3.植物中有高达80％的k在植物体内通过循环而伴随其它物质(包括光合产物)的运输和分配，目前对k转运体参与这一运输的研究还很有限，而oshak18是hak/kt/kup家族成员中唯一被发现具有此功能的k转运体。4.在此基础上，我们提供了一种既能够通过提高水稻有效分蘖而提高产量，又能提高养分效率的新的水稻种质资源。附图说明图1oshak18转基因水稻材料的分子鉴定。图2oshak18转基因水稻的桶培和田间试验表型。图3oshak18转基因水稻成熟期k和可溶性总糖含量。图4ptck303表达载体图谱。具体实施方式实施例1oshak18基因的克隆1.模板：提取正常水培2周大小的日本晴野生型水稻叶片的rna并反转录成cdna，作为克隆oshak18基因的pcr扩增的模板。2.pcr引物设计：在aramemnon网站(http://aramemnon.botanik.uni-koeln.de/)找到oshak18的基因序列，利用引物设计软件primer5.0设计引物，在引物的5’端和3’端加上kpni(ggtacc)和spei(actagt)酶切位点序列，再加上ptck303质粒载体上的一段序列，构成一段46bp的同源重组引物(f1和r1)。上游引物f1：5'-tcgactctagaggatccccgggtaccatggagaccagaacaaatga-3'(seqidno.2)；下游引物r1：5'-tcatggtctttgtagtccatactagtcacgtagaaaacctgcccaa-3'(seqidno.3)。3.oshak18基因pcr扩增：pcrbuffer2.5μl，dntpmix2μl，上下游引物各1μl，模板1μl,kod高保真酶0.5μl，双蒸水17μl。pcr扩增程序如下：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃复性延伸2min，35个循环后，72℃10min充分延伸，10℃保持。扩增的pcr产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测oshak18基因的大小为2382b，序列如seqidno.1所示。实施例2植物表达载体ptck303-oshak18的构建及水稻转基因1.oshak18基因中间载体的构建：将oshak18基因pcr产物经琼脂糖电泳分离后切胶回收，将纯化后片段分别与peasy-blunt中间载体连接，酶连体系包含1μl的peasy-blunt载体，4μl的pcr纯化产物，25-28℃连接25min；再转入大肠杆菌dh5α感受态细胞中扩繁，提取该载体进行双酶切验证，再进一步测序验证。将测序正确的菌液加入等体积体积比30％甘油于-70℃保存备用，获得含有oshak18基因全长序列的重组质粒，命名为oshak18-p。2.oshak18基因表达载体的构建：用kpni和spei双酶切ptck303(eamensal,blanchardcl,dennises,etal.abidirectionalgenetrapconstructsuitablefort-dnaandds-mediatedinsertionalmutagenesisinrice(oryzasatival.)[j].plantbiotechnologyjournal,2004,2(5):367-380.)质粒载体，将切开的线性化的表达载体进行胶回收后，再与上述测序正确的含有目的基因的pcr线性产物进行同源重组反应。同源重组产物转化到大肠杆菌dh5α感受态细胞中，经抗生素筛选后，挑取阳性单克隆，保存阳性克隆，提取大肠杆菌质粒送公司测序，测序正确后得到ptck303+oshak18基因的ubiquitin强启动子超表达载体。在此基础上我们用hindⅲ和kpni双酶切此载体，得到一个载有oshak18基因但切除了ubiquitin的ptck303线性载体，胶回收该酶切产物。根据oshak18基因自身promoter启动子序列，截取一段长为1958bp的序列，用软件primer5.0设计一对扩增oshak18基因自身启动子(pro)的同源重组引物(f2和r2)，在引物的5’端和3’端加上kpni(ggtacc)和hindⅲ(aagctt)酶切位点序列，再加上ptck303质粒载体上的一段序列。通过pcr技术得到目的启动子线性片段，验证正确后，与切除了ubiquitin的ptck303-oshak18基因线性载体同源重组。同源重组产物转化到大肠杆菌dh5α感受态细胞中，经抗生素筛选后，挑取阳性单克隆，保存阳性克隆，提取大肠杆菌质粒送公司测序，测序正确后得到ptck303+oshak18基因的pro超表达载体，通过电击法将其转入eha105农杆菌感受态细胞中，经抗生素筛选，挑取阳性克隆，提取质粒回转大肠杆菌，提取质粒经测序验证无误后，将农杆菌菌液加入等体积30％甘油于-70℃冰箱保存，后续试验备用。上游引物f2：5'-gtaaaacgacggccagtgccaagctttgtcccacagatcttattgt-3'(seqidno.4)；下游引物r2：5'-tcatttgttctggtctccatggtaccgggttcagacttcagatcaa-3'(seqidno.5)。3.转基因水稻的获得：将以上获得的转有ptck303+oshak18的pro超表达载体的农杆菌，侵染水稻愈伤组织，共培养(暗培)2.5天后洗菌，将晾干的愈伤转入含500mg/l羧苄青霉素(car)和50mg/l潮霉素(hyg)的选择培养基上进行第一轮选择培养，28℃光照培养2周，将长有抗性愈伤的愈伤转到含500mg/l羧苄青霉素和80mg/l潮霉素的选择培养基上进行第二轮选择培养，28℃光照培养，直到长出颗粒性的抗性愈伤组织。挑取同一愈伤来的颜色鲜黄的抗性愈伤转入装有分化培养基的塑料广口瓶中分化培养，等待分化成苗(25-30d)，待苗长至2-3cm左右，放入生根培养基中壮苗。将分化好的苗从生根管挑出，加入适量无菌水，炼苗一周。洗去根部琼脂培养基，移栽到水稻营养液中生长并进行阳性苗鉴定，阳性苗转入大田至收获，得到t1代转基因种子。其中使用的培养基均为现有技术。4.oshak18转基因水稻材料超表达效果鉴定与株型筛选：将oshak18pro超表达株系及日本晴野生型水稻种子(t1代)用水发法发苗。挑选健康的种子，用30％的次氯酸钠溶液浸泡30分钟，然后用清水冲洗5遍后，放置于铺有20目尼龙网的纸杯中，用清水浸没种子的一半，再整体放入37℃烘箱中24-36h。出苗后10天，对所有超表达苗进行gus染色鉴定，挑选阳性苗移至周转箱中进行水培。用全irri营养液培养2周后，采用trizol试剂(invitogen)提取oshak18基因pro超表达各株系及日本晴野生型水稻组织中的总rna，通过反转录得到cdna，以此为模板，进行rt-pcr(半定量)鉴定oshak18基因在转录水平上的表达量。用于半定量的内参和oshak18基因的半定量引物见表1。表1用于rt-pcr的osactin和oshak18的引物序列为了检测转基因水稻中oshak18基因的超表达效果及筛选株型，我们采集水培2周后的野生型和转基因水稻样品地上部进行半定量pcr，分析其表达量(图1)。结果发现，转基因水稻地上部中的oshak18基因表达显著高于野生型。同时结合oshak18基因的表达量和株型，我们从12个转基因材料中选出3个有代表性的株系进行后续的生理实验，并重新编号为pro1，pro2，pro3。实施例3野生型和转基因水稻的桶培和田间表型及主要农艺性状指标统计为了研究oshak18在成熟期水稻表型及产量方面的作用，我们对野生型和转基因水稻材料进行桶培和大田试验，桶培实验和田间试验分别在南京农业大学牌楼试验基地和八卦洲试验基地进行。桶培试验的土壤取自南京市区的酸性黄棕壤，ph约为5.20，用醋酸铵浸提法测定其土壤速效钾浓度为133mg/kg(正常k含量，其余营养物质均为正常)，每桶装土10kg，选各株系长势一致的苗移栽至桶中，每桶一株，6个重复，直至培养到成熟收获。田间试验为小区种植，每个株系为7x7共49个重复。期间定期浇水、施肥、打药，直到水稻完全成熟。通过统计它们之间的株高、穗长、总分蘖、有效分蘖、每穗粒数、结实率、千粒重和单株产量等农艺性状的差异(图2和表2)，我们发现，oshak18自身启动子(pro)超表达将水稻的产量提高了25％左右。与野生型相比，转基因水稻的株高由平均的104cm降低到90cm左右，总分蘖数和有效分蘖数均显著增加，平均每株增加3-5个有效分蘖。oshak18超表达水稻的穗长、结实率、每穗粒数、千粒重以及谷草比与野生型相比均无显著性差异，故综合单株产量与野生型相比显著增加。因此，桶培和大田试验表明，转基因水稻的分蘖(总分蘖和有效分蘖)能力要强于野生型，从而达到水稻增产的作用。表2野生型和转基因水稻桶培和大田试验农艺性状指标统计实施例4野生型和转基因水稻成熟期钾和可溶性总糖的分配差异鉴于我们前期已经研究发现oshak18影响k在韧皮部的转运，因此我们进一步分析了该转运体是否影响糖分在水稻体内的分配。通过对田间成熟期的野生型和转基因水稻各部位的k和可溶性糖含量的统计分析，我们发现，叶片和叶鞘中k和可溶性总糖的含量均显著低于野生型，而在典型的库器官中这两者均显著高于野生型(图3)。此实验结果表明，在水稻成熟期，oshak18有助于水稻叶片、叶鞘中的k往根部、糙米及颖壳的转运，也有助于水稻叶片、叶鞘中的糖分往根部的转运。因此，我们认为oshak18能参与调控光合产物运输。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。参考文献leigh,r.a.,andwynjones,r.g.(1984)ahypothesisrelatingcriticalpotassiumconcentrationsforgrowthtothedistributionandfunctionofthisionintheplantcell.newphytol.97,1-13.armengaudp,etal.(2004)thepotassium-dependenttranscriptomeofarabidopsisrevealsaprominentroleofjasmonicacidinnutrientsignaling.plantphysiology,136:2556–2576.anschützu,etal.(2014)goingbeyondnutrition:regulationofpotassiumhomoeostasisasacommondenominatorofplantadaptiveresponsestoenvironment.journalofplantphysiology,171:670–687.deekend,etal.(2002)lossoftheakt2/3potassiumchannelaffectssugarloadingintothephloemofarabidopsis.planta,216:334–344.brittodt,etal.(2008)cellularmechanismsofpotassiumtransportinplants.physiologiaplantarum,133:637-650.mengelk,kirkbyea.(1987)principlesofplantnutition.internationalpotashinstitute:worblaufen-bernjiaoy,etal.(2010)regulationofosspl14byosmir156definesidealplantarchitectureinrice.naturegenetics,42(6):541-u36.序列表<110>南京农业大学<120>水稻钾离子转运蛋白基因oshak18的基因工程应用<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>2382<212>dna<213>水稻(oryzasatival.)<400>1atggagaccagaacaaatgagtattcccgtaagggggcaatgtgggagctggaaaggaat60cttgatcaacccatggatgcagaggctggaagactcaggaatatgtacagagaaaagacc120tatccaacaattttactgctacggctagctttccaaagccttggtgtggtatttggagac180ttaggcacatcacctctatatgttttctacaatatctttcctcatggaatagaagataca240gaacaagttattggagcactctctcttataatttactcccttacactcattccacttgtt300aaatatgttttcattgtcttgagagcaaatgacaatggccaaggaggaacatttgccctt360tattcactgctttgccgtcatgcaaagataaatattattccaaatcaacatagaaccgat420caagatctaacaacatacagtcgccgcacatatgaagaaaagtctcttgctgccaaaatc480caaagatggttagaggggcaccaattcagaaagaatttaattcttattcttgtactattt540ggaacttgtatggctgttggagatggaatactcactcctgccatatcagttctttctgcg600actggtggaatacaagttgaagaaggcagaatgagaaatgatgtggttgtaattatctcc660gtgctgatattgattggactgttcagcatgcagcactatggtactgataaagtcagctgg720ctctttgcaccaatagtatttgtttggttcatactcattgggattcttggtgctgtaaac780atttgcaaatatgaccattcagttcttaaggctttcaatcctgtctatgtatatcgttac840tttaaacgagggaagactagttggacttctttaggtggaattatgctcagcataacaggc900acagaagcattgtttgctgacctttcgtattttcctgtacaagctattcagattgctttc960actgtggttgtgttcccatgccttcttctgcaatatactggtcaggctgcgtttatagct1020gcaaacacaaaccaagtcagccatgccttctatatctcccttccagctcctatactttgg1080ccagcatttgccgttgcaacagcagctgcaatagttgctagtcaggccactatatctgca1140acatattcgattatcaagcaagcacttgccctagggtgctttccccgagtgaagatcatc1200catacttccaagaagtatctcggccagatatacagccctgatattaactggatcctcatg1260gttttctgcatagctgtcactgcagggttcaaaaaccaatcccagattgcaaatgcatat1320ggtactgctgtgatcatggttatgcttgtgacaacatttctgatgatccccatcatgctg1380ctggtgtggcgaagccattggaccctggtcgtcgccttcaccgtgctgtcattgcttgtg1440gagatcccctacttctcggccgtcgtgcgcaagatcgatcagggaggatgggttccgctg1500gttttcgcggcaggcttcatgatcatcatgtatgtctggcactacggcaccctgaagcgg1560tacgagtttgagatgcacagcaaggtgtccatggcctggatcctggggcttggtccgagc1620cttggccttgtcagggtccccggcattggcctggtctacaccgagctcgccagcggtgtt1680cctcacatcttctcgcacttcatcaccaacctcccggcgatccactcgacgctggtgttc1740gtctgcgtcaagtacctcccggtgtacaccgtgccaccggatgagaggttcctggtgaag1800cggatcggccccaagaacttccacatgttccggtgcgtggcgcggtacgggtacaaggac1860atccacaagaaggatgacgacttcgagaagatgttgttcgatagcctgattctgttcgtg1920aggctggagagcatgatggaggagtacagcgactccgacgagtacagcaccctgatgatg1980agcctcccaaataacccagggatcagcaatggcggcgtgaccaccaccggcaccaacaat2040gtcatggaggtgatgagctgcacgtcgacccatgactccattgtgccggtgaactccagg2100tccgacgacacgggcagcagccaggtgatgccggcgtcggggcagatggcgttccagagc2160gtcggcgacgagatcgcgttcctgaacgcgtgcagggacgccggggtggtgcacatcctc2220gggaacacggtgatcagagctcgcagggattcagggttcgtcaagaagattgtcatcaac2280tacatgtatgctttcctgaggaagatctgcagggagaacagtgccatcttcaatgtgcct2340catgagagcatgctcaatgttgggcaggttttctacgtgtaa2382<210>2<211>46<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tcgactctagaggatccccgggtaccatggagaccagaacaaatga46<210>3<211>46<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tcatggtctttgtagtccatactagtcacgtagaaaacctgcccaa46<210>4<211>46<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gtaaaacgacggccagtgccaagctttgtcccacagatcttattgt46<210>5<211>46<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tcatttgttctggtctccatggtaccgggttcagacttcagatcaa46当前第1页12当前第1页12