小麦耐盐基因TaFLZ2及其应用的制作方法

本发明属于生物基因工程技术领域，涉及小麦耐盐基因taflz2及其应用。

背景技术：

土壤盐渍化严重影响作物的生长和产量，全球盐渍化土地面积约10亿公顷，我国盐渍化土地面积约1亿公顷[李彬，等，2005]。同时由于高温和干旱使得农业用水越发依赖于灌溉系统，最终导致了na⁺在土壤中的积累，给土地带来了次生盐渍化[jinetal.,2016]，使盐碱地面积有进一步增加的趋势，极大地阻碍了农业的发展。

小麦是我国第三大粮食作物，其产量对人类生活意义重大。克隆小麦耐盐基因，解析其耐盐的分子机制非常重要，它是解析小麦耐盐分子机理、培育耐盐小麦新品种、有效利用盐碱地、增加粮食产量的理论基础。同时对保障粮食安全和农业的可持续发展，以及社会的安全稳定都具有重要意义[zhuetal.,2016]。

flz是新发现的一类植物特有的基因家族[royetal.,2016]，由于发现时间较短，人们对flz基因家族的各项研究包括在模式生物拟南芥内都还未系统展开，因此对flz基因了解的还非常有限[muhammedetal.,2015a,b]。目前仅对3个flz基因的功能有所报道，其中两个来自拟南芥。一个是拟南芥的mard1(mediatorofaba-regulateddormancy1)，其参与了aba介导的种子休眠，在衰老过程中被诱导表达[heetal.,2004]；另一个是拟南芥的irm1(increasedresistancetomyzuspersicae1)，其转基因后可增强植物对蚜虫的抗性[chenetal.,2013]。第三个flz基因是2013年houetal.等从小麦中克隆的tasrhp，在拟南芥中过表达后提高了植株对盐和旱的抗性^[24]，但flz基因参与以上各种生物学过程的分子机制并不清楚。申请者在本发明中提供了一个小麦的flz基因taflz2，用crispr-cas系统定点编辑该基因后，降低了小麦的耐盐性，超表达该基因后显著提高植株(拟南芥和小麦)的耐盐能力。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种小麦耐盐基因taflz2及其应用。本发明中，首先根据小麦的表达谱芯片数据选出在小麦幼苗根中显著受盐诱导表达的基因(探针)，然后再根据探针序列设计基因特异性引物，从耐盐小麦全长cdna文库中克隆taflz2基因全长cdna，在拟南芥和小麦中进行功能验证。

本发明所提供的小麦耐盐基因名称为taflz2，所述基因cdna的核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明还提供了上述小麦耐盐基因taflz2的氨基酸序列，其编码蛋白如序列表中seqidno.2所示。

本发明还提供了含上述小麦taflz2基因的小麦超表达载体plgy-02/taflz2。

本发明所述基因taflz2在培育耐盐植物中的应用。所述植物优选是普通小麦。

任何一种可以将外源基因导入植物中表达的载体都可以应用，本发明优选的载体是plgy-02/taflz2。

本发明所述的基因可广泛用于培育耐盐农作物新品种。

本发明的有益效果：本发明首次克隆得到了小麦基因taflz2，并通过根瘤农杆菌介导的方法将该基因转入拟南芥和小麦，经过比较分析证明，超表达taflz2后转基因植株的耐盐能力明显提高。

附图说明

图1为taflz2基因的flz保守结构域；

图2为实施例2中琼脂糖凝胶电泳图；

图3为pcr反应结果图；图3中，左图为200mmnacl处理下taflz2在耐盐和盐敏小麦中的表达分析图；右图为100μmaba处理下taflz2在耐盐和盐敏小麦中的表达分析图；

图4转基因拟南芥株系的表型鉴定中，转基因拟南芥外源基因表达pcr分子鉴定；

图5中，b、d、f为未转基因拟南芥株系col-0和转基因株系(l1,l2)在正常ms(a)及添加2μmaba(d)和100mmnacl(f)条件下的表型；c,e,g分别对应于图b,d,f植株的初生根长统计；

图6中，h-j:col-0及taflz2转基因拟南芥生理指标测定，h：脯氨酸含量，i：pod酶活性，j：失水率。

图7为taflz2超表达小麦外源基因整合pcr分子鉴定(标记a)；

图8为taflz2敲除小麦测序分子鉴定(标记b)；

图9为正常及200mmnacl处理下对照、超表达及敲除小麦株系表型鉴定(标记c)；

图10中，左图为图9中的ck处理下三种小麦的根；右图为图9中的nacl处理下三种小麦的根；

其中，wt：未转基因对照，o1，o2：两个超表达株系，c1，c14：两个敲除系，wt；未转基因对照，ck：正常培养对照。

具体实施方式

实施例1

taflz2基因cdna序列的克隆

1.1taflz2基因全长cdna序列的克隆和序列测定

1.引物序列

根据芯片探针序列设计基因特异性的下游引物，与文库的5′端锚定引物进行配对,以小麦幼苗全长cdna文库为模板扩增基因的全长cdna。引物序列为：taflz2c：5′-tgagattttggccatctgcaatg-3′，nt3：5’-actaaagggaacaaaagctggag-3’。

2.pcr反应体系(50μl)

3.pcr反应程序为94℃,3min；94℃,45sec，58℃,1min，72℃,2min，循环35次；72℃,5min。

4.1％琼脂糖凝胶电泳

pcr扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后发现在500bp处有一条目的条带。

5.扩增片段的回收、与t载体的链接

对扩增条带采用tiangen公司的琼脂糖胶回收试剂盒，步骤按说明书进行。pcr产物与t-simple(天根)载体连接，连接体系为：

(1)轻轻混匀重组液，快速离心收集液。

(2)37℃反应30min后立即置于冰上冷却。

6.回收片段的克隆与测序

(1)目的片断的克隆与转化

①从-80℃冰箱中取出1管(100μl)e.colidh5a菌株(天根)感受态细胞，置冰上缓缓解冻30分钟；

②超净工作台上向管中加入5μl连接反应物，轻轻摇匀，置冰上30分钟；

③42℃水浴热激90秒，迅速置冰上3～5分钟；

④在超净工作台上向离心管中加入1mllb液体培养基(不含amp)，混匀后37℃振荡培养1小时(260rpm)；

⑤室温下5000rpm离心6分钟，弃掉900μl上清液，将剩余100μl上清液重新悬浮菌体，加入40μl的x-gal和4μl的iptg，混匀，然后用涂布器将其均匀涂到准备的平板上，放置30分钟；

⑥倒置平板于37℃恒温培养箱中过夜，待出现明显单菌落时拿出；

⑦用灭菌的牙签挑取单菌落于装有10mllb液体培养基(含60μg/mlamp)的试管中，37℃摇菌过夜。

(2)重组质粒的pcr鉴定及测序

本实验所用的t-simple载体的克隆位点的上游有t7启动子，下游有sp6启动子，所以可以用这两个启动子序列做引物对插入片段进行扩增，对重组质粒进行鉴定；

①pcr程序：94℃,10min；94℃,1min，58℃,1min，72℃,1min，循环35次；72℃,5min；

②pcr扩增产物用1％琼脂糖电泳检测，取阳性克隆的菌液送公司进行测序。测序结果见seqidno.1。用dnaman软件或ncbi在线软件将测序所得的核酸序列seqidno.1翻译成核酸序列，结果见seqidno.2。

实施例2

正常培养、nacl及aba处理条件下taflz2基因的表达分析

2.1材料处理

耐盐及盐敏小麦种子正常萌发，1周后去掉胚乳，hangload培养液继续培养1周。盐胁迫在液体培养基中施加200mmnacl，aba处理施加100μmaba，分别在处理后的0、0.5，3、12、24小时取幼嫩的叶片和根系。提取小麦总rna。

2.2trizol试剂(购自诺唯赞)提取小麦totalrna。

具体步骤按说明书进行。

2.3第一链cdna的合成

采用primescript^tmrt-pcrkit试剂盒，根据说明书进行操作。

2.4rt-pcr反应及电泳

2.4.1以正常培养条件下小麦cdna为模板，进行半定量rt-pcr反应。引物如下

taact-f：5’-gttccaatctatgagggatacacgc-3’

taact-r:5’-gaacctccactgagaacaacattacc-3’

taflz2-rtf：5′-tcgtgtacaagggagagcaag-3′

taflz2-rtr：5′-cctgcaagtacggtaagatctac-3′

2.4.2半定量rt-pcr体系

2.4.3pcr程序

94℃,3min；25～30cycles，94℃,20s，57℃,60s，72℃,45s；72℃5min。

根据内参actin的扩增情况确定pcr的循环数，调整cdna模板的加入量。

2.4.41％琼脂糖凝胶电泳。结果见图2。

2.5.qrt-pcr(realtimepcr)反应

1.以对照及处理条件下小麦根和叶的cdna为模板，以与半定量rt-pcr实验相同的引物进行qpcr反应。

2.反应体系同2.4.2

3.反应程序94℃for30s；40cyclesof94℃for15s,55℃for15s,and72℃for25s。qpcr结果如图3。

实施例3

pcambia-super1300/taflz2拟南芥超表达载体的构建

植物表达载体pcambia-super1300是含有35s启动子和nptⅱ基因的双元载体，在其多克隆位点上含有限制性内切酶xbai和kpni位点。根据基因taflz2的cdna序列，设计包含完整orf的基因特异性引物，引物序列为：

taflz2f:5′-tctagaatgatttcgaggtctcccagc-3′(xbai)，

taflz2r:5′-ggtaccctagcaaaaacttgagatttgcac-3(kpni)。

用该对引物扩增taflz2的cdna序列。然后分别用限制性内切酶xbai和kpni双酶切载体pcambia-super1300和目的基因片断。完全酶切的载体在1％琼脂糖凝胶上电泳分离后，经胶回收，然后与用相同酶双酶切的taflz2基因片段连结，构建获得植物表达载体pcambia-super1300/taflz2。

实施例4

plgy-02/taflz2转基因小麦超表达载体的构建

以plgy-02植物超表达载体为骨架，利用诺唯赞生物公司的ced在线infusion引物设计软件设计包含基因序列和载体序列的特异性引物(zinfusion1：tctagaggatccccgggtaccatgatttcgaggtctcccagc；

zinfusion2:ttcgagctctctagaactagtctagcaaaaacttgagatttgcacc，小写字母为载体序列)，利用该公司的重组酶系统，通过同源重组的方法构建taflz2的小麦超表达载体。以eha105农杆菌侵染盐敏小麦fielder愈伤组织的方法，获得taflz2过表达转基因小麦株系。

实施例5

taflz2crispr敲除载体的构建

以crispr载体pbue411载体为骨架，应用在线设计软件(http://crispr.dbcls.jp/)在taflz2基因的结构域区选取2个特异性的位点设计基因特异的sgrna序列，根据载体序列和设计好的sgrna序列设计构建taflz2的crispr载体的特异性引物

(mt1t2-f：aataatggtctcaggcggcgacaacaacggccggcgc，

mt1t2-f0：ggcgacaacaacggccggcgcgttttagagctagaaatagc，

mt1t2-r0：tcgatcttcttgcagcagcacgcttcttggtgcc，

mt1t2-r：attattggtctctaaactcgatcttcttgcagcagca)，pcr扩增回收靶序列后，通过边切边连的方式构建载体，最后pcr检测阳性克隆送公司测序验证载体构建的正确性。以fielder愈伤组织为受体进行遗传转化。

实施例6

转基因拟南芥表型鉴定

6.1转基因拟南芥的pcr鉴定

6.1.1拟南芥rna的提取

采用天根公司的rnaprep试剂盒提取未转基因col-0及转基因拟南芥的rna。

6.1.2反转录

采用天根的fastquantrtkit(withgdnaase)试剂盒将6.1.1中提取的rna反转录成cdna第一链。

6.1.3pcr扩增

以6.1.2中反转录的拟南芥cdna为模板，用基因特异性引物taflz2f和taflz2r(同实施例3)进行pcr扩增。

pcr体系同2.4。pcr反应程序为：94℃，3min；94，45sec，58℃，45sec，72℃，1min，循环35次；72℃，7min。pcr扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到在转基因拟南芥植株中扩增出一条目的条带，在未转基因植株中未见扩增条带(图4)。

6.2转基因拟南芥的表型鉴定

6.2.1拟南芥的种植

t3代单拷贝纯合转基因拟南芥株系的种子用7.5％次氯酸钠溶液(包括7.5％次氯酸钠和0.01％triton-x100)消毒15分钟，然后用无菌水漂洗5-6次，点播于ms平板上，于4℃春化2-3天，然后移植到营养钵中(营养土与蛭石按等比例混合)，23℃培养，16/8h光周期，光强30-40μmol·m^-2·s^-1。

6.2.2aba和nacl处理

aba处理：将萌发5天的拟南芥幼苗(对照及转基因株系)小心移至正常及含有2μmaba的ms培养皿中，竖直培养一周观察表型。结果表明正常ms培养基上，未转基因对照与taflz2转基因拟南芥未出现表型差异(图5b)，根长统计未见显著性差异(图5c)，而在aba处理下，转taflz2基因的拟南芥植株的根系明显短于未转基因对照的植株(图5d，e)。

nacl处理：将萌发5天的拟南芥幼苗(对照及转基因株系)小心移植正常或添加100mmnacl的ms培养皿中，竖直培养一周观察表型。结果表明正常ms培养基上，未转基因对照与taflz2转基因拟南芥未出现表型差异(图5b)，根长统计未见显著性差异(图5c)。而在含100mmnacl的培养基上，转taflz2基因的拟南芥植株的根系明显长于未转基因对照的植株(图5f，g)。

6.2.3对照及转基因拟南芥的生理指标测定

用磺基水杨酸法测定对照及转基因拟南芥中脯氨酸的含量。使用愈创木酚试剂测定对照及转基因拟南芥中过氧化物酶(pod酶)的活性。失水率测定方法如下:

①用小剪刀和小镊子分别从拟南芥野生型和转基因两类幼苗上剪取叶片，分别置于称量纸上称重。之后将叶片放于室温(25℃)下，每隔一个小时再称重，记录6个小时的失水结果。每一种样品做三个平行。

②绘制离体叶片失水率的折线图：先分别计算出拟南芥野生型和转基因两类幼苗离体叶片失水前及失水1-6小时后的叶片失水率，再作折线图，分析比较二者离体叶片的失水情况。失水率(％)＝(w1-w2)/w1。w1：离体叶片失水前的重量，w2：离体叶片失水后的重量。

结果表明，在正常培养条件下，转基因拟南芥(l1，l2)的脯氨酸含量(图6h)和pod酶活性(图6i)都明显高于未转基因对照(col-0)。而转基因拟南芥的失水率也明显较未转基因对照慢(图6j)。

实施例7

转基因小麦的表型鉴定

7.1超表达转基因小麦中taflz2整合的pcr鉴定

7.1.1对照及转基因小麦基因组dna的提取

采用ctab法提取小麦基因组dna。

7.1.2pcr扩增

引物序列为上游引物of：5’-tgcaggtcgactctagaggat-3(对应于载体序列)和下游引物taflz2r(对应于基因序列，引物序列同实施例3的taflz2r)。

pcr体系同2.4半定量rt-pcr中的pcr体系。pcr扩增程序同7.1中的pcr程序。

7.1.3pcr产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。结果见图7(a)。未转基因对照植株中没有扩增产物，而在转基因植株(o1,o2)中扩出了特异的目的条带。

7.2taflz2的crispr敲除小麦株系的检测

taflz2敲除小麦株系采用对转化小麦中的目标基因序列测序的方法进行鉴定。首先提取敲除小麦株系的基因组dna，然后利用hi-tom试剂盒(北京诺禾致源公司)对靶位点进行扩增，送公司测序。结果如图8(b)所示，不同的株系产生了不同的编辑类型，其中c1，c14两个株系为编辑纯合株系，即所有的拷贝都被编辑了。

7.3超表达及敲除小麦株系的表型鉴定

未转基因对照(wt)、taflz2超表达(o1，o2)及taflz2crispr敲除系(c1，c14)小麦株系的种子7.5％次氯酸钠消毒15分钟，无菌水冲洗5遍，25℃萌发。萌发10天的小麦幼苗移至1/2hogland液体培养基培养1天后，正常1/2hogland培养基或添加200mmnacl的1/2hogland培养基继续培养6天，观察表型并照相。结果如图9c所示，nacl处理后，taflz2超表达株系(o1，o2)的耐盐性明显高于未转基因对照植株(wt)(如附图10)，而敲除纯系(c1，c14)植株较未编辑(wt)植株更盐敏感(图9c)，而正常培养条件下三种小麦差异不明显(图9cck)。

序列表

sqidno.1

<110>济南大学

<120>小麦耐盐基因taflz2及其应用

<141>2019-12-13

<160>1

<210>1

<211>489

<212>cdna

<213>小麦

<221>小麦耐盐基因taflz2基因

<222>（1）…（489）

<400>1

1atgatttcgaggtctcccagcctcttccagatcgacgacggagaggcccaggatcaggat

61caggcggggacgccaacaatggcgaccgccggggagctcgtcgggctccggctgatcata

121cagccctcgccgaggcgacaacaacggccggcgctggccgtcctcaggaggtcttcggtg

181aggtccccggctgccgacctccaggagaacagcggctgccggccgttcgtgggccttgag

241ttcttgaagtgctgcctctgctgctgcaagaagatcgacggcgacatggacgtcttcgtg

301tacaagggagagcaagccttctgcagcgccgagtgccggtgtcagcagatggccagggag

361gagaggcgggagatcgagatcctggtcaggaagcggcgtgacgcgttccacagccgccgt

421gcagcaccgggcaagacgatcggaggaccggaccgccacgcgagggtgcaaatctcaagt

481ttttgctag

sqidno.2

<110>济南大学

<120>小麦耐盐基因taflz2及其应用

<141>2019-12-13

<160>1

<210>1

<211>162

<212>aa

<213>小麦

<221>小麦耐盐基因taflz2及其应用

<222>（1）…（162）

<400>1

1misrspslfqiddgeaqdqd

21qagtptmatagelvglrlii

41qpsprrqqrpalavlrrssv

61rspaadlqensgcrpfvgle

81flkcclccckkidgdmdvfv

101ykgeqafcsaecrcqqmare

121erreieilvrkrrdafhsrr

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