制备右旋酰胺酮洛芬的方法与流程

本发明涉及生物工程领域，具体地，本发明涉及制备右旋酰胺酮洛芬的方法。

背景技术：

酮洛芬是2-芳基丙酸类非甾体抗炎药(nsaids)，此类药物均具有一个手性中心，只有右旋体才具有抗炎抗风湿和镇痛作用，左旋体几乎没有药理活性且毒副作用大。

目前，市售(s)-(+)－酮洛芬主要合成方法有传统的化学合成法、手性拆分以及生物酶合成法。

化学合成法主要是不对称合成可通过6步反应，由烯丙醇通过sharpless环氧化制备得到(2s，3s)环氧化合物，再加入手性位移试剂，经过对映体选择性氢解后生成二醇，在ruo4/naio4的催化下，最终得到右旋酮洛芬，ee值达到98％这种方法的产率和对映体选择性较为理想，但是均需要用到传统的化学催化剂以促使反应快速进行，而大部分催化剂毒性较高、易燃且会造成环境污染，还有可能引入有害的副产物。

另有手性拆分方法，有专利(专利01，cn101928214a)采用国内廉价易得的(-)-葡辛胺作为拆分剂拆分(rs)-酮洛芬，按一定比例混合后升温回流后降温结晶，对酮洛芬利用率达70％。目前也有采用高分子印迹聚合物、色谱法对酮洛芬对映体进行拆分。也有研究利用微生物酶法进行酮洛芬拆分。也有研究利用紫外诱变得到的微生物菌株在一定条件下进行发酵，利用菌体拆分(rs)-酮洛芬。也有研究利用诺维信脂肪酶435催化酮洛芬酯拆分，该研究中，大肠杆菌表达来自于古细菌的嗜热酯酶，利用菌体催化酮洛芬乙酯反应生成右旋酮洛芬。然而，利用酯酶的缺点在于拆分率和产物ee值都不理想，底物浓度偏低问题也难以解决。

生物酶合成法可以一定程度是解决底物浓度和产物ee值偏低的问题。目前已有利用腈水合酶和酰胺酶双酶体系制备光学纯酮洛芬的报道。但现有技术的转化率或光学纯度均较低，仍达不到生产要求。

技术实现要素：

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本申请的发明人对腈水合酶进行了筛选，发现在特定菌中的腈水合酶对右旋氰基酮洛芬的特异性识别能力强，右旋酰胺酮洛芬的转化率和ee值高。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种用于右旋酮洛芬的合成的酶组合。根据本发明的实施例，所述组合包括：腈水合酶和酰胺酶，所述腈水合酶来源于rhodopseudomonas。发明人发现，来源于rhodopseudomonas的腈水合酶对右旋氰基酮洛芬的特异性识别能力更强，使用来源于rhodopseudomonas的腈水合酶和酰胺酶的双酶体系制备右旋酮洛芬，可大大提高右旋酰胺酮洛芬的转化率，提高右旋酰胺酮洛芬和右旋酮洛芬的ee值。

根据本发明的实施例，上述酶组合还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本年发明的实施例，所述腈水合酶具有seqidno:1～3所示的氨基酸序列。

mdgahdmggmdgfgpvvpeaneplfhaawerrafaltlamarpggwnldmtrfarenrspldylsksyyqiwlaglerlmaerglvtsdeiaaarplhprrdvaalsaddaapmlargapterpapapahfaigdrvrarnihphthtrlpryvrghvgvvelvhgahifpdshalgageqpqwlytvtfdgrelwgddcdpslrisvdawesylepvr(seqidno:1)。

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其中，seqidno:1表示来源于rhodopseudomonas的腈水合酶的α亚基(αsubunit)的氨基酸序列，seqidno:2表示来源于rhodopseudomonas的腈水合酶的β亚基(βsubunit)的氨基酸序列，seqidno:3表示来源于rhodopseudomonas的腈水合酶的副蛋白(accessoryprotein)的氨基酸序列。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种制备右旋酰胺酮洛芬的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括使氰基酮洛芬在腈水合酶的催化下进行酰胺化反应，以便获得右旋酰胺酮洛芬，所述腈水合酶来源于rhodopseudomonas。

发明人发现，来源于rhodopseudomonas的腈水合酶对右旋氰基酮洛芬的特异性识别能力更强，使用来源于rhodopseudomonas的腈水合酶制备右旋酰胺酮洛芬，可大大提高右旋酰胺酮洛芬的转化率和ee值。

根据本发明的实施例，上述制备右旋酰胺酮洛芬的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述腈水合酶具有seqidno:1～3所示的氨基酸序列。

根据本发明的实施例，所述腈水合酶是以腈水合酶发酵菌体的形式提供的。

根据本发明的具体实施例，所述腈水合酶发酵菌体是通过如下方式获得的：将转化有质粒的大肠杆菌菌体进行活化处理，所述质粒中携带表达腈水合酶的核酸序列；将活化处理后菌液进行基础发酵培养，以便获得od600为30～35的基础发酵培养菌液；将所述基础发酵培养菌液进行诱导培养，所述诱导培养是在iptg和cocl2存在的条件下进行的，所述诱导培养的时间为14～16h。

根据本发明的实施例，所述氰基酮洛芬与腈水合酶发酵菌体的质量比为1：(1～3)，如1：1，1：2，1：2.5，1：3。

根据本发明的实施例，进一步包括将所述腈水合酶发酵菌体进行干燥处理，以便获得菌体干粉。

根据本发明的实施例，所述氰基酮洛芬与腈水合酶发酵菌体干粉的质量比为(4～6)：1，如4：1，5：1，6：1，进而催化反应效率进一步提高。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种制备右旋酮洛芬的方法。根据本发明的实施例，依据前面所述的方法获得右旋酰胺酮洛芬；使所述右旋酰胺酮洛芬在酰胺酶的催化下进行脱氨基反应，以便获得右旋酮洛芬。

根据本发明实施例的上述制备右旋酮洛芬的方法可表示如下：

来源于rhodopseudomonas的腈水合酶对右旋氰基酮洛芬的特异性识别能力更强，使用来源于rhodopseudomonas的腈水合酶制备右旋酮洛芬，可大大提高右旋酰胺酮洛芬的转化率，提高右旋酮洛芬的ee值。

附图说明

图1是根据本发明实施例的蛋白诱导表达的凝胶电泳图；

图2是根据本发明实施例5的腈水合酶nh2菌体催化合成右旋酰胺酮洛芬产物样品的hplc检测结果；以及

图3是根据本发明实施例6的腈水合酶nh2喷干酶粉催化合成右旋酰胺酮洛芬产物样品的hplc检测结果。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明在大肠杆菌中表达腈水合酶nh2，利用大肠杆菌菌体进行酶催化反应，其中：

腈水合酶nh2氨基酸序列来源于rhodopseudomonas。

下面将更加详细地描述本发明的实施例。

实施例1腈水合酶nh2大肠杆菌表达菌株构建

根据rhodopseudomonas腈水合酶nh2氨基酸序列，其中，α亚基(αsubunit)的氨基酸序列如seqidno:1表示，β亚基(βsubunit)的氨基酸序列seqidno:2表示，副蛋白(accessoryprotein)的氨基酸序列如seqidno:3所示。在每一个亚基前加入rbs位点。基因克隆在pet28a的ncoi和hindiii位点，核酸序列根据大肠杆菌密码子进行优化，优化后的核酸序列如下所示，并交由通用生物系统(安徽)有限公司进行合成。

atggatggcgcgcatgatatgggcggcatggatggctttggcccggttgttccggaagcaaatgaaccgctgtttcatgcagcatgggaacgccgcgcttttgctctgaccctggcaatggcacgtccgggtggttggaatctggatatgacccgctttgctcgcgaaaatcgcagtccgctggattatctgagcaaaagctattatcagatttggctggctggcctggaacgcctgatggcggaacgcggtctggttacctcagatgaaattgcagcagctcgcccgctgcatccgcgccgcgatgttgcagccctgagcgcagatgatgcagctccgatgctggcccgtggcgcgccgaccgaacgcccggcaccggcaccggcacattttgcgattggtgatcgtgttcgcgctcgcaatattcatccgcatacccatacccgcctgccgcgctatgttcgcggtcatgttggtgttgttgaactggttcatggcgcgcatatttttccggatagccatgcactgggcgctggcgaacagccgcagtggctgtataccgttacctttgatggccgcgaactgtggggtgatgattgcgatccgtctctgcgcattagcgttgatgcatgggaatcttatctggaaccggttcgctaaaaggagatatagatatgctgcgtcgtatgagcgaacatcagcatggtcatagccatgatcatgatcatgatcattctgaactgtctgaaaccgaactgcgcgtgcgcgccctggaaaccattctgaccgaaaaaggttatgtggaccctgcggcgctggatattctgattgaaacctatgaaaccaaagttggcccgcgcaatggcgctcgcgtggtggccaaagcctggaccgatccggcatatcgtgcccgtctgctgcaggatgcaaccgcagcgattgcggaactgggttataccggccgtcagggtgaacatattgtggctgtggaaaataccccggctacccataatatggttgtttgtaccctgtgtagctgctatccgtggccggtgctgggcctgccgccggtttggtataaaagcgctccgtatcgctcacgcgcagttaaagaaccgcgtgcagttctggccgattttggcgtgaccctgccggatgataccgcaattcgcgtgtgggattcaaccgccgaaattcgctatctggtgattccgatgcgcccggatggtaccgaaggttttaccgaagatcagctggccgatctggttacccgcgattcaatgattggtaccggtgttgctcagccgccggccgaaaatagctgaaaggagtactagatatgaccgctgatgctgctgctgtggctgctcgctctgtgccgggcctgccgcgcgatgatgatggcccggtgtttcgtgaaccgtgggaagcccatgcctttgccctggcggtgaccctgcatgcgcgtggtctgtttacctggccggaatgggccgccgccctggcagatgaaattacccgcgctcagcagcgcggcgatccggatgatggtcatacctattatcagcattggctggccaccctggaacgcctgattgcagataaaggtgtggcgagtgccgcgacccaggcgcgttatcgtgatgcttgggatcatgctgcggatcgcaccccgcatggtcgtccgattatgctgcagccggatgattttgccgccaccccgtaa(seqidno：4)。

seqidno:4所示核酸序列导入大肠杆菌中，可在大肠杆菌中表达seqidno:1～3所示的腈水合酶nh2的α亚基、β亚基以及副蛋白。

合成得到的质粒干粉分别加入50μl蒸馏水溶解，取1μl转化bl21(de3)感受态细胞，转化液涂布lb+kan平板(10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，10g/l氯化钠，50μg/ml卡那霉素，15g/l琼脂粉)，37℃过夜培养。

实施例2腈水合酶nh2的摇瓶诱导表达

分别挑取转化平板上的单菌落至5mllb+kan液体培养基(10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，10g/l氯化钠，50μg/ml卡那霉素)，37℃250rpm/min条件下过夜培养，约12h。

取过夜活化好的菌液，3ml转接至新鲜的300mllb+kan液体培养基，37℃250rpm/min条件下培养直至od达到0.5-0.8。

取培养好的nh2菌液，加入终浓度为1mm的iptg以及终浓度为1mm的cocl2，30℃250rpm/min条件下培养5h。

诱导结束后，收集全部菌液在8000prm/min、4摄氏度条件下离心收集菌体。取适当菌体进行超声波破壁处理，10000rpm/min、4℃离心10min，取上清液检测蛋白表达情况。

蛋白诱导情况见图1。

实施例3腈水合酶nh2的50l罐上发酵

取实施例2中过夜活化好的菌液，1ml转接至新鲜的1000mllb+kan液体培养基，37℃250rpm/min条件下培养约10h后接种50l发酵罐(发酵培养基：一水葡萄糖121g，酵母浸粉500g，酵母蛋白胨250g，nacl100g，na2hpo425g，mgso4.7h2o20g，kh2po4100g，(nh4)2so450g，一水柠檬酸55g，naoh75g，gpe消泡剂25ml。118℃灭菌30min，消后体积25l)。

基础培养阶段：控制培养温度37.0℃，通气量1:1vvm，通过搅拌和通气调节发酵液溶氧水平高于50％，罐压40～70kpa。

补葡萄糖阶段：发酵液ph值反弹至7.15时开始补加葡萄糖溶液，初始补糖速率6.6g/l.h，每0.5h提升0.7g/l.h，葡萄糖补加速率提升至10.0g/l.h，维持此速率补加至诱导阶段。补葡萄糖阶段培养温度34.0℃，通气量1:1.3vvm，通过搅拌和通气调节发酵液溶氧水平高于30％。

诱导阶段：发酵液od600值在30～35时，开始进行诱导，诱导时一次性打入终浓度1mmiptg溶液和终浓度1mmcocl2溶液。诱导前降低培养温度至30℃，诱导后葡萄糖补加速率3.3～3.6g/l.h，发酵液溶氧水平20％～50％。维持该速率直至发酵结束，诱导约15h。发酵结束后离心发酵液收集菌体，菌体置于-20℃保存。

实施例4腈水合酶nh2的酶粉制备

喷干酶粉的制备：利用实施例3中获得的腈水合酶nh2发酵液，量取500ml发酵液，于喷雾干燥箱(设置参数为进口温度170℃、出口温度80℃、进料流量700ml/h)中进行喷干，获得腈水合酶nh2喷干酶粉。喷干酶粉置于4℃保存。

冻干酶粉的制备：利用实施例3中获得的腈水合酶nh2发酵液，量取500ml发酵液样品离心，将菌体用生理盐水洗涤菌体后移去多余生理盐水，加入5％蔗糖溶液作保护剂。重悬菌体并置于冷冻舱里的隔板上，在超低温冰箱(－70℃)中预冷12h。随后在冷冻干燥机中冷冻干燥48h即得冻干酶粉。冻干酶粉置于4℃保存。

实施例5腈水合酶nh2菌体催化合成右旋酰胺酮洛芬

取实施例3中10g腈水合酶nh2菌体均匀分散到100ml0.1mph＝7.0磷酸钠缓冲液中，30℃下温浴10min，再将4g氰基酮洛芬底物溶于10ml乙酸乙酯滴加入反应瓶，保温反应。反应18h取样2ml，加4ml二氯甲烷萃取，取萃取相50ul，干燥，hplc检测各组分含量。

样品处理：采用乙腈溶解，配制成1mg/ml。

检测条件：采用hplc正相，色谱柱(welchtopsil5uc18100a，4.6×150mm)，检测波长：250nm，柱温：25℃，进样量5μl,流动相：磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾68.0g，加水溶解并稀释至1000ml，用磷酸调节ph值至3.5±0.1)-乙睛-水(2：43：55)，洗脱条件：等度洗脱，运行时间：25min。

e.e＝(右旋kpa含量-左旋kpa含量)/(右旋kpa含量+左旋kpa含量)

转化率＝右旋kpa含量/初始kpn含量

kpn为底物氰基酮洛芬，kpa为产物酰胺酮洛芬。

结果如图2所示，产物右旋kpa的e.e值为98.3％，转化率为48.5％。

实施例6腈水合酶nh2喷干酶粉催化合成右旋酰胺酮洛芬

取实施例4中1.2g腈水合酶nh2喷干酶粉均匀分散到100ml0.1mph＝7.0磷酸钠缓冲液中，30℃下温浴10min，再将6g氰基酮洛芬底物溶于10ml乙酸乙酯滴加入反应瓶，保温反应。反应20h取样2ml，加4ml二氯甲烷萃取，取萃取相50ul，干燥，hplc检测各组分含量。样品处理以及检测方法同实施例5。样品处理以及检测方法同实施例5。

hplc图见附图3，产物右旋kpa的e.e值为98.1％，转化率为48.68％。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

sequencelisting

<110>东莞市东阳光生物合成药有限公司

<120>制备右旋酰胺酮洛芬的方法

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<223>来源于rhodopseudomonas的腈水合酶的α亚基（α

subunit）的氨基酸序列

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<223>来源于rhodopseudomonas的腈水合酶的β亚基（?subunit）的氨基酸序列

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<220>

<223>来源于rhodopseudomonas的腈水合酶的副蛋白（accessory

protein）的氨基酸序列

<400>3

metthralaaspalaalaalavalalaalaargservalproglyleu

151015

proargaspaspaspglyprovalphearggluprotrpglualahis

202530

alaphealaleualavalthrleuhisalaargglyleuphethrtrp

354045

proglutrpalaalaalaleualaaspgluilethrargalaglngln

505560

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<223>可在大肠杆菌中表达seqid

no:1~3所示的腈水合酶nh2的α亚基、β亚基以及副蛋白的核酸的核苷酸序

列

<400>4

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