一种基于DNA条形码的枸杞快速鉴定方法与流程

本发明属于枸杞种属鉴定
技术领域：
，具体涉及一种基于dna条形码的枸杞快速鉴定方法。
背景技术：
：枸杞富含枸杞多糖、甜菜碱、类胡萝卜素、多种不饱和脂肪酸等多种有效成分，具有抗氧化、抗肿瘤、延缓衰老、增强免疫力、软化血管、降低血脂等功效，是中国重要的药食同源功能型特色植物资源。枸杞育种在整体上与其他作物育种相比，还存在许多不足和缺陷，主要体现在以下几点:(1)实用生产型品种相对偏少，在生产中大面积推广应用的品种仅有宁杞1号、宁杞4号、宁杞5号和宁杞7号等4个新品种，并且其用途相对单一，不能很好地适应枸杞产业多元化发展的方向；(2)育种手段相对单一，育种周期长、速度慢。近年来，分子标记技术发展很快，对于深入了解植物基因的多态性、有针对性地选择亲本、对杂种后代进行早期鉴定等方面，都能提供更为有效的判断依据，从而提高育种效率。通过群体选优、杂交育种、细胞融合等技术，建立多样化育种理论体系和技术体系，培育多用途的枸杞新品种，对于提升枸杞产业的研究水平和枸杞产业可持续发展意义重大。dna条形码(dnabarcoding)是利用1个或少数几个dna片段对目标物种进行识别和鉴定的一项新技术，它具有操作简便、准确性高、鉴定快速等特点，已成为现代生物分类学研究中引人关注的新方向和研究热点。近些年来，国内外学者对适合用于鉴定植物的dna条形码基因序列进行了积极的探索与研究。公开号为cn110229927a的发明专利《一种基于dna条形码鉴定黑果枸杞的方法及其应用》，提供一种基于dna条形码鉴定黑果枸杞的方法。所述鉴定黑果枸杞的dna条形码基因序列为lrits2(thesecondinternaltranscribedspacer，第二个核糖体rna内转录间隔区)/lrpsba-trnh(叶绿体基因psba和trnh之间的一段非编码区)。所述鉴定黑果枸杞的dna条形码序列lrits2/lrpsba-trnh可以同时应用或任选其中之一。本发明能高效、精准地鉴定黑果枸杞原料。防止类似的混淆品或伪品，同时，可用于果粉、果实碎末等的鉴定，为保障食品安全和消费者权益具有重要的应用价值和较大的社会效益。文章《基于matk条形码序列鉴定枸杞属种质资源》，公开了通过dna条形码技术，以matk基因为条形码编码序列对枸杞属种质资源10份试验材料进行鉴定分析，从而在分子水平上获得鉴定枸杞属植物的理论依据。首先利用clustalx软件比对序列，然后用mega7.0获得序列信息并比较序列间的差异，最后基于k2p模型构建系统发育树。matk序列总长为936bp，保守位点933个，变异位点3个，gc含量均值为33.3％，碱基转换颠换值为1.8，其系统发育树分成了两大支，黑果、黄果变和昌吉枸杞聚为一大支，其余品种聚为一大支，各分支内部均具有较高的自展支持率。因此，matk序列可以作为初步鉴定枸杞属植物的dna条形码。技术实现要素：本发明针对现有技术中枸杞种质资源遗传背景不清、优异资源挖掘和利用滞后等问题，依托国内唯一的枸杞种质资源圃和在长期开展枸杞新品种选育获得的育种材料的基础上，提供一种用于枸杞快速鉴定的dna条形码及方法，提供了基于叶绿体间隔序列，同时提供了黑果枸杞、黄果枸杞、圆果枸杞、红枝枸杞等品种，宁夏枸杞地方品种、北方、新疆、云南、河北等地方品种以及杂交群体、航天诱变群体、倍性群体等不同枸杞来源中具有代表性种质的枸杞的分子标记快速鉴定方法，可应用于枸杞种属的鉴定。本发明的目的是提供一种基于dna条形码鉴定枸杞品种、确定枸杞种间关系的方法，同时基于该方法获得trnl-trnf条形码数据库，能够有效地对枸杞种属进行鉴定，并确定枸杞的种间关系，为枸杞品种提供有效的依据。本发明的技术方案如下：本发明的第一个目的是提供一种基于dna条形码的枸杞快速鉴定方法，所述dna条形码为trnl-trnf条形码。所述可鉴定的枸杞品种包括宁杞1号(l.barbarumlinn)、宁杞2号、宁杞3号、宁杞4号、宁杞5号、宁杞6号、宁杞7号、宁农杞9号、黄果变枸杞(l.barbarumlinn.var.auranticarpumk.f.chingvar.nov.)、黑果枸杞(lyciumruthenicummurr.)、宁农杞5号(l.barbarumlinn)、北方枸杞(lyciumchinensemill.var.potaninii(pojark.)a.m.lu)、大麻叶枸杞(damaye(l.barbarumlinn))、白花枸杞(baihua(l.barbarum))中国枸杞(l.chinensemill.var.)、云南枸杞(lyciumyunnanensekuangeta.m.lu)、蔓生枸杞(manshenggouqi(l.barbarum))、紫柄枸杞(ziguogouqi(l.barbarum))、红枝枸杞(lyciumdasystemum)、小麻叶枸杞(xiaomaye(l.barbarumlinn))、新疆枸杞(lyciumdasystemumpojark)、蒙杞1号、宁杞菜1号、黑杂航天诱变种枸杞、航天诱变种枸杞、圆果枸杞、种质名称为9001号枸杞、宁夏黄果枸杞、昌吉枸杞、河北枸杞等品种。优选地，所述基于dna条形码鉴定枸杞品种的方法，步骤如下：1)从枸杞样品中提取基因组dna；2)以所述基因组dna为模板，用如核苷酸序列seqidno.35和seqidno.36所示引物扩增trnl-trnf条形码的序列片段，得到pcr产物；3)对所述pcr扩增产物进行测序；4)构建系统进化树，鉴定枸杞。优选地，所述步骤1)中，提取样本的dna采用试剂盒进行抽提。更优选地，所述步骤1)中，试剂盒为dnasecureplantkit。更优选地，所述采用试剂盒进行dna抽提的步骤如下：(1)dna的提取取待试验的枸杞样本的鲜嫩叶片为样品，将采到的样品放入5ml冻存管，做好标记后立刻放入液氮，-80℃保存。总dna的提取采用新型植物基因组dna提取试剂盒(dnasecureplantkit)提取，提取方法如下：①取100g样品于多功能高效生物样品制备仪研磨，22次/s，研磨2min。立刻加入400ul缓冲液lp1和6ulrnasea(10mg/ml))，旋涡振荡1min，室温放置10min。②加入130ul缓冲液lp2，充分混匀，旋涡振荡1min。③12000rpm离心5min，将上清移至新的离心管中。④加入1.5倍体积的缓冲液lp3，(使用前请先检査是否已加入无水乙醇)，立即充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀。⑤将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30s，倒掉废液，吸附柱cb3放入收集管中。⑥向吸附柱cb3中加入600ul漂洗液pw(使用前请先检査是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。(注意：如果吸附柱膜呈现绿色，向吸附柱cb3中加入500ul无水乙醇，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管)⑦重复操作步骤6。⑧将吸附柱cb3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置15min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。⑨将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100ul洗脱缓冲液te，室温放置2min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。⑩重复操作步骤9。将dna产物保存在-80℃。以防dna降解。(2)dna浓度与纯度检测①琼脂糖凝胶电泳检测用1.2g琼脂糖和100ml1*tae缓冲液配置1.2％琼脂糖凝胶，在pcr管中加入4ulddh2o+1uldna样品(未稀释)+1ul6*loadingbuffer的检测体系，进行琼脂糖凝胶电泳。在紫外凝胶成像系统下观察检测结果。②紫外分光光度计检测提前预热紫外分光光度计，在pcr管中加入99ulddh2o+1uldna样品(未稀释)进行检测。检测结果显示其样品浓度和od260/od280比值，od260/od280比值应为1.7-1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用ddh2o，比值会偏低，因为ph值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。优选地，所述步骤2)中，pcr扩增的反应体系为：①94℃预变性2min；②94℃变性30s，55℃退火30s(退火温度可在58-60℃之间调节)，72℃延伸2min，35次循环；③72℃保温10min；④4℃保存。pcr产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测后，在紫外凝胶成像系统下观察扩增结果。优选地，所述步骤3)中，测序步骤如下：(1)pcr产物克隆：用axyprepdna凝胶回收试剂盒对目标条带进行回收，并用1.2％琼脂糖凝胶电泳进行回收检测，纯化后的目标dna作为测序模板。用plb零背景快速克隆试剂盒，将回收产物连接于t载体(pgem-t)，再转入大肠杆菌dh5α培养。采用蓝白斑法筛选阳性菌落，进行菌落pcr检测。在紫外凝胶成像系统下观察扩增结果。(2)序列测序与分析：对阳性克隆的菌落进行dna序列测序，并与ncbi中已发表的序列进行同源性比对，分析序列。具体操作如下：本发明对阳性菌落进行pcr检测后，将含有目标片段的菌落，用lb液体培养基培养，每个材料选取3个菌落送往生工生物工程(上海)股份有限公司采用sanger法测序，获得trnl-trnf序列。将所获得的dna条形码基因序列，在ncbi数据库中与已发表的序列进行同源性比对，运用clustalx程序对枸杞dna条形码基因序列分别进行对位排列。用系统发育分析软件mega7.0计算目标序列的碱基组成，序列间的碱基变异频率和序列间的转换颠换频率及其比率，并构建系统发育树，建立trnl-trnf条形码数据库，用于枸杞品种的鉴定。本发明的第二个目的是提供一种由上述方法构建的枸杞样本trnl-trnf条形码数据库，包含trnl-trnf条形码34条，其核苷酸序列如seqidno.1-34所示。本发明的第三个目的是提供基于所述枸杞样本trnl-trnf条形码数据库鉴定枸杞品种的用途。优选地，基于所述枸杞样本trnl-trnf条形码数据库鉴定枸杞品种的用途，步骤如下：通过将待鉴定样品的trnl-trnf序列与所述trnl-trnf条形码数据库中的序列进行比对，以鉴定枸杞品种。通过将待鉴定样品的trnl-trnf序列与所述枸杞样本trnl-trnf条形码数据库中的序列进行比对，能够有效的对枸杞种属进行鉴定，并确定枸杞的种间关系，通过确定待测枸杞与条形码数据库中的枸杞的种间关系，为枸杞品种的分类和鉴定提供有效的依据。优选地，所述待鉴定样品的trnl-trnf序列的获得方法同样经过基因组dna提取、pcr扩增和对pcr扩增产物进行测序，获得相应序列，操作步骤同所述所述基于dna条形码鉴定枸杞品种的方法中的步骤1)、2)、3)。本发明的有益效果是：(1)首次建立枸杞品种基于trnl-trnf基因的鉴定方法。可对宁杞、黄果变枸杞、黑果枸杞、北方枸杞、大麻叶枸杞、中国枸杞、云南枸杞、蔓生枸杞、紫柄枸杞、红枝枸杞等品种进行鉴定。(2)基于trnl-trnf基因揭示了枸杞属的遗传多样性及亲缘关系。同时为枸杞品种鉴定、分类和系统发育研究提供有效的依据。(3)基于trnl-trnf基因准确的鉴定枸杞品种。(4)本发明同时基于该方法提供了枸杞样本的trnl-trnf条形码数据库，囊括了、黑果枸杞、黄果枸杞、圆果枸杞、红枝枸杞等品种，同时包括宁夏枸杞地方品种、北方、新疆、云南、河北等地方品种以及杂交群体、航天诱变群体、倍性群体等不同枸杞来源，均为全国范围内具有代表性种质的枸杞，因而可以为枸杞品种的分类和鉴定提供有效的依据。通过将待鉴定样品的trnl-trnf序列与所述枸杞样本trnl-trnf条形码数据库中的序列进行比对，能够有效的对枸杞种属进行鉴定，并确定枸杞的种间关系，通过确定待测枸杞与条形码数据库中的枸杞的种间关系，为枸杞品种的分类和鉴定提供有效的依据。附图说明图1为本发明实施例1枸杞样本的dna提取检测结果，其中，泳道m：marker(dl2000dna分子标记)；其中(a)为泳道1-24对应样品编号1-24的dna检测结果；(b)为泳道25-34对应样品编号25-34的dna检测结果。图2为本发明实施例1部分枸杞样本的trnl-trnf序列pcr扩增结果，其中泳道m：marker(dl2000dna分子标记)，泳道1-2：均为蔓生枸杞pcr产物；泳道4-5：均为圆果枸杞pcr产物；泳道7-8：均为紫柄pcr产物，其中泳道1-2、4-5、7-8为不同样品重复两次的pcr验证。图3：为本发明实施例1，编号32号枸杞样本的trnl-trnf序列克隆结果，其中m：marker(dl2000dna分子标记)，泳道1：阴性克隆；泳道2-6：阳性克隆(多个重复试验结果)。图4：为本发明实施例1中枸杞样本trnl-trnf条形码数据库中的trnl-trnf条形码构建的nj系统发育树。图5：为本发明实验例1待鉴定枸杞样本与数据库中部分trnl-trnf条形码的nj系统发育树。图6：为本发明实验例2待鉴定枸杞样本与数据库中部分trnl-trnf条形码的nj系统发育树。具体实施方式实施例1枸杞样本的鉴定以及枸杞样本trnl-trnf条形码数据库的构建下面利用实施案例对本发明进行进一步说明。1、枸杞样本trnl-trnf条形码数据库的样品为了构建枸杞样本trnl-trnf条形码数据库，共收集34份枸杞来自不同地区、部分形态相似的枸杞样本，详情见表1：表1枸杞属植物样本(枸杞样本trnl-trnf条形码数据库)(注：品种编号14-19，21，31，33来源于公开文献1：“万如，王亚军，安巍，etal.基于psba-trnh序列条形码鉴定21份枸杞属植物[j].江苏农业科学，2019，47(01):64-67.”中的公开品种；品种编号12来源于公开文献2：“石志刚，安巍，焦恩宁，etal.一种鉴定菜用枸杞的新方法——nrdnaits测序法(英文)[j].agriculturalscience&technology(2):64-65+111.”表1；品种编号23来源于公开文献3：“石志刚.基于nrdnaits序列的18份宁夏枸杞资源的遗传多样性[j].安徽农业科学(24):10379-10380.”表1；品种编号22来源于文献4：石志刚.基于nrdnaits序列的18份宁夏枸杞资源的遗传多样性[j].安徽农业科学(24):10379-10380.表1；品种编号10来源于文献5：“尹跃,安巍,赵建华,等.黑果枸杞转录组ssr信息分析及分子标记开发[j].浙江农林大学学报,2019,36(02):215-221.”)2、枸杞样本的鉴定以及枸杞样本trnl-trnf条形码数据库的构建方法1)dna的提取在宁夏农林科学院枸杞工程中心枸杞种质资源圃，采集上述34份枸杞植株的鲜嫩叶片为样品，将采到的样品放入5ml冻存管，做好标记后立刻放入液氮，-80℃保存。采样时间：2018年6月，采样地点：宁夏银川市枸杞国家林木种质资源库。总dna的提取采用新型植物基因组dna提取试剂盒(dnasecureplantkit)提取，提取方法如下：①取100g样品于多功能高效生物样品制备仪研磨，22次/s，研磨2min。立刻加入400ul缓冲液lp1和6ulrnasea(10mg/ml))，旋涡振荡1min，室温放置10min。②加入130ul缓冲液lp2，充分混匀，旋涡振荡1min。③12000rpm离心5min，将上清移至新的离心管中。④加入1.5倍体积的缓冲液lp3，(使用前请先检査是否已加入无水乙醇)，立即充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀。⑤将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30s，倒掉废液，吸附柱cb3放入收集管中。⑥向吸附柱cb3中加入600ul漂洗液pw(使用前请先检査是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。(注意：如果吸附柱膜呈现绿色，向吸附柱cb3中加入500ul无水乙醇，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管)⑦重复操作步骤6。⑧将吸附柱cb3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置15min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。⑨将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100ul洗脱缓冲液te，室温放置2min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。⑩重复操作步骤9。将dna产物保存在-80℃。以防dna降解。2)dna浓度与纯度检测①琼脂糖凝胶电泳检测用1.2g琼脂糖和100ml1*tae缓冲液配置1.2％琼脂糖凝胶，在pcr管中加入4ulddh2o+1uldna样品(未稀释)+1ul6*loadingbuffer的检测体系，进行琼脂糖凝胶电泳。在紫外凝胶成像系统下观察检测结果，参照图1所示。②紫外分光光度计检测提前预热紫外分光光度计，在pcr管中加入99ulddh2o+1uldna样品(未稀释)进行检测。检测结果显示其样品浓度和od260/od280比值，od260/od280比值应为1.7-1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用ddh2o，比值会偏低，因为ph值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。3)pcr扩增以步骤1)获得的dna为模板，加入引物等扩增所需试剂进行pcr扩增。具体引物及扩增体系见表2和表3。(1)设计引物设计引物如下：表2dna条形码基因trnl-trnf的通用引物(2)pcr反应体系用上述引物对供试材料的基因组dna进行pcr扩增，扩增体系见表3：表3dna条形码反应体系pcr反应程序为:①94℃预变性2min；②94℃变性30s，55℃退火30s(退火温度可在58-60℃之间调节)，72℃延伸2min，35次循环；③72℃保温10min；④4℃保存。pcr产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳后，在紫外凝胶成像系统下观察扩增结果，以蔓生枸杞pcr产物、大黄果pcr产物、紫柄pcr产物为例，参照附图2所示。根据trnl-trnf序列对应dnamarker的位置可知，trnl-trnf序列全长约为1200bp。4)pcr产物克隆：用axyprepdna凝胶回收试剂盒对目标条带进行回收，并用1.2％琼脂糖凝胶电泳进行回收检测，纯化后的目标dna作为测序模板。用plb零背景快速克隆试剂盒，将回收产物连接于t载体(pgem-t)，再转入大肠杆菌dh5α培养。采用蓝白斑法筛选阳性菌落，进行菌落pcr检测。其中，紫外凝胶成像系统下观察扩增结果，以编号32的小麻叶枸杞为例，参照附图3，根据图3所示分析，trnl-trnf基因具有良好的扩增结果，条带清晰，克隆结果明显。5)序列测序与分析对筛选的阳性克隆的菌液进行dna测序，并于ncbi数据库中与已发表的序列进行同源性比对，运用clustalx程序对枸杞dna条形码基因序列分别进行对位排列，具体操作如下：本发明对阳性菌落进行pcr检测后，将含有目标片段的菌落，用lb液体培养基培养，每个材料选取3个菌落送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序，获得34份trnl-trnf序列。将所获得的dna条形码基因序列，在ncbi数据库中与已发表的序列进行同源性比对，运用clustalx程序对枸杞dna条形码基因序列分别进行对位排列，去掉引物区。用系统发育分析软件mega7.0获得trnl-trnf序列全长1156bp，保守位点1138个，占98.4％，变异位点18个，占1.6％，其中信息位点9个，自裔位点9个，碱基转换颠换值为1.2，gc含量均值为35.7％。通过序列比对分析之后，其中黄果变、黑果枸杞、宁农杞5号、hz-13-01、zh-13-08、w-12-27、w-11-15、w-13-26、w-12-26、中国枸杞、云南枸杞、昌吉枸杞12份样品在61bp处插入一段长40bp的序列，即tgacatcacaacgagatcctaatctcaaaacaaaaagaaa，在791bp处缺失一个碱基a。除中国枸杞、云南枸杞外，其他10份样品在38bp、44bp、49bp、50bp、323bp、569bp、731bp处发生转换，在762bp处发生颠换，且此10份样品在45bp处插入3个碱基tct，除黄果变、中国枸杞、云南枸杞、昌吉枸杞4份样品外，其他8份样品在487bp处插入一段长24bp的序列，即gaattggtgtgaatcgattctaca。黑果枸杞在1025bp处发生转换。北方枸杞在236bp、263bp处发生转换。蔓生枸杞在253bp、1131bp处发生转换，碱基t转换为c。宁杞4号和圆果枸杞在55bp处缺失一段长6bp的序列aaggaa，在732bp处缺失一段长10bp的序列ccgaccccct。新疆枸杞在605bp处发生转换，碱基a转换为g。宁杞菜1号在1151bp处发生3个碱基的颠换，由tat颠换为ata。通过序列比对并进行聚类分析，构建系统发育树附图4。trnl-trnf条形码序列的聚类图分为两大支支，中国枸杞、云南枸杞、黑果杂交品种的航天诱变种、黄果变、黑果枸杞和昌吉枸杞聚为一大支，中国枸杞、云南枸杞分别单独为一支，与其他品种亲缘关系较远。其余22份种质聚在一起，其中宁杞4号与圆果聚为一支，亲缘关系最近，依据trnl-trnf序列能够基本鉴别出34份种质材料(见图4)，每个分支内部获得大于50％的自展支持率。此结果与34份样品的实际亲缘关系相符。说明trnl-trnf序列可以鉴定枸杞品种。由此证明了本发明提供的dna条形码能够应用于构建枸杞系统发育树，进而用于枸杞种内和种间的系统发育的研究。进一步证明本发明提供的dna条形码在枸杞品种鉴定、分类和系统发育研究的有效性和可行性。同时本发明实施例基于条形码trnl-trnf序列构建起了trnl-trnf条形码数据库，该数据库囊括了黑果枸杞、黄果枸杞、圆果枸杞、红枝枸杞等品种，同时包括宁夏枸杞地方品种、北方、新疆、云南、河北等地方品种以及杂交群体、航天诱变群体、倍性群体等不同枸杞来源，均为全国范围内具有代表性种质的枸杞，因而可以为枸杞品种的分类和鉴定提供有效的依据。通过将待鉴定样品的trnl-trnf序列与所述枸杞样本trnl-trnf条形码数据库中的序列进行比对，能够有效的对枸杞种属进行鉴定，并确定枸杞的种间关系，通过确定待测枸杞与条形码数据库中的枸杞的种间关系，为枸杞品种的分类和鉴定提供有效的依据。实验例1利用条形码数据库鉴别枸杞品种1.取样选取编号为天精3号、柱筒、白条的3份待测枸杞样品，与实施例1中部分枸杞样本trnl-trnf条形码数据库的条形码进行比对鉴定。该枸杞品种不能利用形态学方法进行鉴定，本实验例采用dna条形码技术进行鉴定。表4待测枸杞样本编号及产地信息样品种类产地天精3号河北柱筒宁夏中宁(鑫阳)白条宁夏2.dna提取与浓度检测、pcr扩增、pcr产物克隆、序列测序与分析与实施例1相同。3.序列结果分析利用mega7.0软件序列比对并进行聚类分析，采用nj法构建系统发育树附图5。trnl-trnf条形码序列的聚类图分成了两大支。待测样品白条与圆果枸杞(条形码数据库，编号21)聚为一支，两者亲缘关系最近，说明白条与34份trnl-trnf条形码数据库中的圆果枸杞、宁杞4号(条形码数据库，编号4)品种较为接近；且与宁杞1号(条形码数据库，编号1)亲缘关系较近。待测样品柱筒、天精3号，分别单独为一支，柱筒与宁杞1号的亲缘关系较近；天精3号与黄果变(条形码数据库，编号9)、黑果(条形码数据库，编号11)之间亲缘关系较近。各分支的自展率大于60，具有较高的可信度，说明基于trnl-trnf条形码序列以及依据本发明方法构建的条形码数据库，可将不同地区的样品进行品种的分类和鉴定。利用mega7.0采用k2p模型(kimura2-parametermodel)进行遗传距离计算见表5，宁杞1号与圆果枸杞之间遗传距离最小为0.00093，白条与黑果枸杞之间遗传距离最大为0.010186。表5trnl-trnf鉴定枸杞品种的遗传距离分析实验例2利用条形码数据库鉴别黑果枸杞品种1.取样选取编号为b2、b3、h-13-08-05的3份待测枸杞样品，本实验例采用dna条形码技术进行鉴定，并与实施例1中部分枸杞样本trnl-trnf条形码数据库的条形码进行比对鉴定。该枸杞品种不能利用形态学方法进行鉴定。表6待测黑果枸杞样本编号及产地信息样品种类产地b2青海b3青海h-13-08-05宁夏2.dna提取与浓度检测、pcr扩增、pcr产物克隆、序列测序与分析与实施例1相同。3.序列结果分析利用mega7.0软件序列比对并进行聚类分析，采用nj法构建系统发育树附图6。trnl-trnf条形码序列的聚类图分成了两大支，明显鉴定出红果枸杞与黑果枸杞。宁杞1号与中国枸杞聚为一支，亲缘关系最近，都是红果枸杞且与其他6份黑果枸杞之间的自展率为100，可信度高。6份黑果枸杞样品中，待测样品b2与h-13-08-05聚为一支，两者亲缘关系最近，且与黑果枸杞(条形码数据库，编号11)之间的自展率为60，具有可信度。黑果枸杞、w-12-27(条形码数据库，编号16)、待测样品b3单独为一支，且待测样品b3单独为一支与w-12-27之间自展率为63，具有可信度，与黑果枸杞之间自展率为39，说明基于trnl-trnf条形码序列以及依据本发明方法构建的条形码数据库，可将不同地区依据形态无法鉴定的黑果枸杞样品进行品种的分类和鉴定区分，但样品相似性较高，只作为基本鉴别。利用mega7.0采用k2p模型(kimura2-parametermodel)进行遗传距离计算见表7，宁杞1号与中国枸杞之间遗传距离最小为0.00000，宁杞1号与h-13-08-05之间遗传距离最大为0.011122。表7trnl-trnf鉴定黑果枸杞的遗传距离分析sequencelisting<110>宁夏农林科学院枸杞工程技术研究所<120>一种基于dna条形码的枸杞快速鉴定方法<130>1<160>36<170>patentinversion3.5<210>1<211>1645<212>dna<213>ningqino.1(l.barbarumlinn)<400>1ttaggatttggtctattccacacatttaactaagaataagaacaaaggatttcgaaaatt60gaaaaaaaaaaatcaagtcatcaacggaaagagagggattcgaaccctcggtacgattaa120ctcgtacaacggattagcaatccgccgctttagtccactcagccatctctcccaattgaa180aaagataattactacatgagatagcacataagataaaggaaagaatctttctttctctct240tttcttctttactatattatatagatatgtacaacttttatcatcaatttcctttatctc300tttatctaaagtaaaggaagggctcagaagagccaagaatatcaagaaaaataaagaaga360ccgcttttctttgtcttgattttgttcgaaaggaccctcttattctcatggcctggtctg420gtcagtacccagccgggcctcttttgttccaacgaatttgaatttgaaaacaaaaatgcc480tgttatagttgtaatatttcattttaattgaatagttaatattcaagcaacaagaaaaaa540ttcccatttttgctaaaagtaaaaaaaatatatatatgaaatagaaaattcgatcaaaat600aaaagtctcatttctctttctgcttttttatgtttaccatcttgctggactaaaaaaaag660aagctttcgagtattccacaatgcatttttatgttatgattttagtggttttgacgaccc720tatcttatcctatcttgattaccacaattcccctgttcgacaaaagttgcatttgtatac780aataatcgaattgtagcgggtatagtttagtggtaaaagtgtgattcgttctattatccc840ttaaatagttaaagggtccttcggtttgattcgtattccgatcaaaaactttatttctta900aaaggattaaatccttttcctctcaatgacagattcgagaacaaatacacattctcgtga960tttgtatccaaaggtcacttagacattgaaaaattggattattaaattgcgaaacataat1020ttttgaattggatcaatacttccaattgaataagtatgaataaaggatccatggatgaag1080atagaaagttgatttctaatcgtaactaaatcttcaatttcttatttgtaaagaagaaag1140tgaagcaaaatagctattaaacgatgactttggtttactagagacatcaacatattgttt1200tagctcggtggaaacaaaatccttttcctcaggatcctattaaatagaaatagagaacga1260aataactagaaaggttgttagaatccccctcttctagaaggatcatctacaaagctattc1320gttttatctgtattcagatcaaaagctgacatagatgttatgggtagaattctttttttt1380tttctaattttgttcacatcttagatctataaattgactcatctccataaaggagccgaa1440tgaaaccaaagtttcatgttcggttttgaattagagacgttcaaaataatgaatcgacgt1500cgactataacccctagccttccaagctaacgatgcgggttcgattcccgctacccgctct1560ctatctatttattctaaatattttaatcttttcattaaatcaaatttagtttattagtat1620tagtacatcattgaatatacaattc1645<210>2<211>1645<212>dna<213>ningqino.2(l.barbarumlinn)<400>2ttaggatttggtctattccacacatttaactaagaataagaacaaaggatttcgaaaatt60gaaaaaaaaaaatcaagtcatcaacggaaagagagggattcgaaccctcggtacgattaa120ctcgtacaacggattagcaatccgccgctttagtccactcagccatctctcccaattgaa180aaagataattactacatgagatagcacataagataaaggaaagaatctttctttctctct240tttcttctttactatattatatagatatgtacaacttttatcatcaatttcctttatctc300tttatctaaagtaaaggaagggctcagaagagccaagaatatcaagaaaaataaagaaga360ccgcttttctttgtcttgattttgttcgaaaggaccctcttattctcatggcctggtctg420gtcagtacccagccgggcctcttttgttccaacgaatttgaatttgaaaacaaaaatgcc480tgttatagttgtaatatttcattttaattgaatagttaatattcaagcaacaagaaaaaa540ttcccatttttgctaaaagtaaaaaaaatatatatatgaaatagaaaattcgatcaaaat600aaaagtctcatttctctttctgcttttttatgtttaccatcttgctggactaaaaaaaag660aagctttcgagtattccacaatgcatttttatgttatgattttagtggttttgacgaccc720tatcttatcctatcttgattaccacaattcccctgttcgacaaaagttgcatttgtatac780aataatcgaattgtagcgggtatagtttagtggtaaaagtgtgattcgttctattatccc840ttaaatagttaaagggtccttcggtttgattcgtattccgatcaaaaactttatttctta900aaaggattaaatccttttcctctcaatgacagattcgagaacaaatacacattctcgtga960tttgtatccaaaggtcacttagacattgaaaaattggattattaaattgcgaaacataat1020ttttgaattggatcaatacttccaattgaataagtatgaataaaggatccatggatgaag1080atagaaagttgatttctaatcgtaactaaatcttcaatttcttatttgtaaagaagaaag1140tgaagcaaaatagctattaaacgatgactttggtttactagagacatcaacatattgttt1200tagctcggtggaaacaaaatccttttcctcaggatcctattaaatagaaatagagaacga1260aataactagaaaggttgttagaatccccctcttctagaaggatcatctacaaagctattc1320gttttatctgtattcagatcaaaagctgacatagatgttatgggtagaattctttttttt1380tttctaattttgttcacatcttagatctataaattgactcatctccataaaggagccgaa1440tggaaccaaagtttcatgttcggttttgaattagagacgttcaaaataatgaatcgacgt1500cgactataacccctagccttccaagctaacgatgcgggttcgattcccgctacccgctct1560ctatctatttattctaaatattttaatcttttcattaaatcaaatttagtttattagtat1620tagtacatcattgaatatacaattc1645<210>3<211>1645<212>dna<213>ningqino.3(l.barbarumlinn)<400>3ttaggatttggtctattccacacatttaactaagaataagaacaaaggatttcgaaaatt60gaaaaaaaaaaatcaagtcatcaacggaaagagagggattcgaaccctcggtacgattaa120ctcgtacaacggattagcaatccgccgctttagtccactcagccatctctcccaattgaa180aaagataattactacatgagatagcacataagataaaggaaagaatctttctttctctct240tttcttctttactatattatatagatatgtacaacttttatcatcaatttcctttatctc300tttatctaaagtaaaggaagggctcagaagagccaagaatatcaagaaaaataaagaaga360ccgcttttctttgtcttgattttgttcgaaaggaccctcttattctcatggcctggtctg420gtcagtacccagccgggcctctttt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