细胞角蛋白19片段抗原及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物学检测
技术领域：
，具体涉及一种细胞角蛋白19(cyfra21-1)片段抗原及其制备方法和应用。
背景技术：
：细胞角蛋白19片段抗原(cytokeratin19fragment21-1，cyfra21-1)是ⅰ型细胞角蛋白19(ck19)的第239～400aa的可溶性片段，由于该片段可被ks19.1和bm19.21两株单克隆抗体特异性结合而命名为cyfra21-1。细胞凋亡可引起半胱天冬酶介导的ⅰ型细胞角蛋白的水解，使大量ck19形成可溶性的cy21-1进入血液中，而正常人血清中cy21-1的含量较低(＜3.3ng/ml)，因此，血液cy21-1浓度的升高可被用于肿瘤患者的诊断。有研究表明肺癌细胞系中半胱氨酸蛋白酶3(caspase3)mrna表达水平与cyfra21-1表达量高低呈正相关，体外培养的细胞中添加caspase3抑制剂，cyfra21-1表达水平升高。这表明caspase3在cyfra21-1生成中起重要作用(dohmotok,hojos,fujitaj,yangy,ueday,bandohs,yamajiy,ohtsukiy,dobashin,ishidat,etal.theroleofcaspase3inproducingcytokeratin19fragment(cyfra21-1)inhumanlungcancercelllines.intjcancer.2001；91:468–473)。caspase家族中其它蛋白酶也有可能参与该酶解过程，只是还没有相关研究。据报道，一种名为procaspase激活化合物1(pac-1)的化合物可在体外增强procaspase-3的活性，并在体外培养小鼠异种移植模型的癌细胞中诱导凋亡性死亡。并进一步证明，pac-1在体外是通过螯合抑制性锌离子从而激活procaspase-3生成caspase-3(petersonqp,hsudc,goodedr,novotnycj,tottenrk,hergenrotherpj.procaspase-3activationasananti-cancerstrategy:structure-activityrelationshipofprocaspase-activatingcompound1(pac-1)anditscellularco-localizationwithcaspase-3.jmedchem.(2009)52:5721–31)。市面上在售的cyfra21-1校准品级天然抗原大多是由肺癌细胞系体外培养，细胞自然凋亡释放cyfra21-1蛋白，细胞连续培养7～14天，细胞上清中抗原含量为10～100ng/ml，用该细胞上清纯化制备cyfra21-1抗原，会出现工作量大、抗体纯度低、抗原制备成本大等问题，间接导致cyfra21-1抗原购买价格昂贵。因此寻找方法提高体外培养肿瘤细胞cyfra21-1抗原表达量是必要的。技术实现要素：本发明针对现有技术的上述不足，提供一种能促使体外培养的肺癌细胞系程序性凋亡，并在一周内将细胞培养基中抗原分泌量提高20～100倍的cyfra21-1抗原。为了解决上述技术问题，本发明的技术解决方案如下：一种cyfra21-1抗原，所述的cyfra21-1抗原是由体外培养的肺癌细胞系通过小分子激活剂处理后引起细胞程序性凋亡，并释放cyfra21-1抗原。本发明所述的肺癌细胞系包括人小细胞肺癌细胞系、人非小细胞肺癌细胞系、人肺腺癌细胞系、人肺鳞癌细胞系、其他人肺癌细胞系等。优选的，所述的人小细胞肺癌细胞系包括sbc-2、sbc-3、sbc-5、h69、h446、sbc-2、h209、h292、ltep-sm、h1688、h1417、dms53、sclc-21h、h526、h1105、h841、h128、sbc-5、h719、dms79。优选的，所述的人非小细胞肺癌细胞系包括h358、h322、h524、h838、h650、h1299、h2073、hop-92、h1650、h2228、h23、h1770。优选的，所述的人肺腺癌细胞系包括h1666、h1975、calu-3、ltep-a-2、h1395、h441、h3255、hcc-78、josk-1、h1792。优选的，所述的人肺鳞癌细胞系包括ltep-s、sk-mes-1、h520、h2170、h226、h596、h1703、ebc-1。优选的，所述的其他人肺癌细胞系包括a-427、pc9、h2127、h1299、h3255、a549、msto-211h、hcc-15、spc-a-1、calu-1、h3255、h292、l1022、tkb-1、h196。优选的，所述的小分子激活剂是指pac-1。进一步的，所述的pac-1分子式为c23h28n4o2，分子量为392.494，结构式见下式(i)所示：优选的，所述的小分子激活剂pac-1处理细胞的方式包括：a.直接添加到细胞培养液中；b.脂质体转染进细胞中；c.电转染进细胞中等中的一种。优选的，所述的小分子激活剂pac-1处理细胞的添加量是1～1000μg/ml间的任意浓度。本发明还提供一种cyfra21-1抗原在制备cyfra21-1化学发光检测试剂盒校准品中应用。本发明的优点和有益效果：1.本发明的优点在于小分子激活剂pac-1可在短期内激活半胱天冬酶-3酶原，酶解细胞角蛋白19，促使体外培养的肺癌细胞系按照程序性凋亡的方式制备cyfra21-1蛋白，该方法制备的蛋白是人体天然蛋白，用作试剂盒校准品性能稳定、抗原抗体亲和力高。该方法制备的抗原稳定性良好，抗原制备周期短，抗原得率高，抗原粗提纯后可用于cyfra21-1检测试剂盒校准品。2.本发明通过体外培养的肺癌细胞系用pac-1激活procaspase-3促进caspase-3过表达，促使细胞凋亡后，在一定程度上提高细胞释放cyfra21-1蛋白，通过实验验证，pac-1添加量在75μg/ml时，肺癌细胞系在被刺激48h时细胞上清中cyfra21-1表达量相比未被刺激的细胞提高了100倍。附图说明图1实施例1的pac-1处理ebc-1细胞后cyfra21-1表达量趋势图。图2实施例2的不同量pac-1处理ebc-1细胞后cyfra21-1表达量趋势图。图3实施例3的cyfra21-1抗原sds-page电泳图，1#：bsa；2#：cyfra21-1抗原；3#：marker。具体实施方式下面用具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不仅局限于以下具体实施例。本申请实施例提及的百分比不做特殊说明，均为质量百分比。实施例1一定量小分子激活剂pac-1处理贴壁培养的人肺鳞癌细胞系ebc-1对cyfra21-1分泌量的影响1)小分子激活剂pac-1(apexbio，a8177)，用dmso溶解，并稀释至12.5mg/ml的浓度，1mg/管分装后-20℃保存。2)人肺鳞癌细胞系ebc-1(北纳生物，bncc341894)，培养基成分1640(rpmi-1640细胞培养基)，90％；fbs(胎牛血清)，10％；双抗，培养条件为温度：37.0℃，空气：95％，二氧化碳(co2)：5％；冷冻介质：fbs/nbs(n-溴代琥珀酰亚胺)：92％，dmso(二甲基亚砜)：8％，储存温度：液氮。3)实验前一天按1×106个细胞/瓶的数量接种人肺鳞癌细胞系ebc-1到2个25ml细胞培养瓶中；4)实验当天用新鲜ebc-1培养基稀释pac-1小分子，稀释后的pac-1小分子浓度为15μg/ml。前一天接种的2瓶ebc-1培养基倒掉上清，加入10mldmem(是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，市售)缓缓摇晃清洗细胞，倒掉dmem，其中1瓶加入25ml新鲜不含pac-1的培养基，标记a瓶，另一瓶加入25ml已配好的含pac-1的培养基，标记b瓶。5)分别在小分子激活剂pac-1处理细胞后的24h、48h、72h取a瓶和b瓶细胞上清液，用罗氏细胞角蛋白19片段(cyfra21-1)化学发光检测试剂检测a瓶和b瓶细胞上清液中cyfra21-1蛋白含量，具体见附图1，由图1可知：15μg/mlpac-1处理细胞24h、48h、72h时，cyfra21-1蛋白表达量逐渐增加，48h内增加速度快，48h～72h增加速度变缓，可能是由于pac-1添加后，前期细胞数目多，细胞凋亡数多，后期细胞数目变少，细胞凋亡数也减少，cyfra21-1蛋白表达量与细胞凋亡数呈正相关。实施例2不同量小分子激活剂pac-1处理贴壁培养的人肺鳞癌细胞系ebc-1对cyfra21-1分泌量的影响1)实验前一天按1×106个细胞/瓶的数量接种人肺鳞癌细胞系ebc-1到6个25ml细胞培养瓶中；2)实验当天用新鲜ebc-1培养基稀释pac-1小分子，pac-1小分子浓度分别为0、7.5μg/ml、15μg/ml、37.5μg/ml、75μg/ml、100μg/ml、150μg/ml。前一天接种的6瓶ebc-1培养基倒掉上清，加入10mldmem缓缓摇晃清洗细胞，倒掉dmem，分别添加上述已备好的培养基，依次标记a瓶、b瓶、c瓶、d瓶、e瓶、f瓶。3)分别在小分子激活剂pac-1处理细胞后的24h、48h、72h取上述6瓶细胞的上清液，用罗氏细胞角蛋白19片段(cyfra21-1)化学发光检测试剂检测各瓶上清液中cyfra21-1蛋白含量，具体见附图2，由图2可知：pac-1小分子添加量75μg/ml和100μg/ml，处理细胞72h，cyfra21-1蛋白表达量最优，表达量＞2000ng/ml。实施例3cyfra21-1抗原制备及分离纯化实验前两天按2×106个细胞/瓶的数量接种人肺鳞癌细胞系ebc-1到4个50ml细胞培养瓶中；实验当天用新鲜ebc-1培养基稀释pac-1小分子，pac-1小分子浓度分别为75μg/ml。将之前接种的4瓶ebc-1培养基倒掉上清，加入20mldmem缓缓摇晃清洗细胞，倒掉dmem，分别按50ml/瓶添加上述已备好加有75μg/mlpac-1的培养基。3)在小分子激活剂pac-1处理细胞后的48h收集4瓶细胞的上清液，6800rpm离心10min，离心上清再用0.45μm的膜抽滤，上清液用3kd膜包(pall)浓缩，浓缩后样品体积32ml。浓缩样品通过阴离子交换柱，除去色素和核酸以及部分血清白蛋白，纯化产物透析到0.01mph7.4pbs中，得到校准品级终产物，终产物用罗氏细胞角蛋白19片段(cyfra21-1)化学发光检测试剂检测目的蛋白浓度是2.34μg/ml，sds-page电泳评估抗原纯化，具体见附图3，如附图3所示：sds-page电泳可看到清晰的cyfra21-1目的条带，由于纯化过程简单，目的蛋白中仍有较多的血清白蛋白未除去，未除去的白蛋白可作为保护剂增加cyfra21-1的保存稳定性。实施例4cyfra21-1抗原稳定性验证1)制备的cyfra21-1抗原用0.01mph7.4pbs稀释成不同梯度1000ng/ml、200ng/ml、40ng/ml、8ng/ml、1.6ng/ml、0.3ng/ml、0.0ng/ml，每个浓度分装2管，分别放置37℃和4℃，放置7天。2)抗原于第7天拿出，两组抗原用罗氏细胞角蛋白19片段(cyfra21-1)化学发光检测试剂检测抗原光度值变化，经测定光度值偏差＜5％，说明抗原稳定(表1)。表1.抗原放置37℃7天抗原光度值变化ng/ml0.00.61.68.040.0200.01000.037℃4845,18621,79890,293399,744921,7801,475,4014℃5085,39322,80591,642395,700923,8441,492,842偏差-4.7％-3.8％-4.4％-1.5％1.0％-0.2％-1.2％通过上述实施例和检测数据可知，本申请的cyfra21-1抗原具有在短期内激活半胱天冬酶-3酶原，酶解细胞角蛋白19，促使体外培养的肺癌细胞系按照程序性凋亡，该方法制备的蛋白是人体天然蛋白，用作试剂盒校准品性能稳定、抗原抗体亲和力高。该方法制备的抗原稳定性良好，抗原制备周期短，抗原得率高，抗原粗提纯后可用于cyfra21-1检测试剂盒校准品。当前第1页12