基于SARS-CoV-2核蛋白的NTD多肽、编码基因、重组载体、表达方法及应用与流程

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及基于sars-cov-2核蛋白的ntd多肽、编码基因、重组载体、表达方法及应用。

背景技术：

2019新型冠状病毒(sars-cov-2)是具有包膜的正链rna病毒，属冠状病毒属(coronavirus)；其感染引起的肺炎被世界卫生组织命名为新型冠状病毒肺炎(covid-19)。sars-cov-2属于β属的新型冠状病毒，其颗粒多是多形性，直径约60～140nm；其基因特征与中东呼吸综合症冠状病毒(mers-cov)和急性呼吸系统综合症冠状病毒(sars-cov)有明显区别。其rna既可像mrna一样直接进行蛋白翻译，也可当作模板合成负义链，再经负义链复制子代rna，具有很高的突变率。

中国学者首先公开公布了sars-cov-2基因组序列，其基因组全长约30kb，预测的开放读码框架(orf)达11个，可能编码已知或未知的成熟功能蛋白20余种。其基因组结构具有典型的冠状病毒基因组的结构，依次为5'-非翻译区、5'-复制酶多聚糖蛋白基因(orf1/ab)、刺突糖蛋白基因(spike，s)、小包膜糖蛋白基因(envelope，e)、膜糖蛋白基因(membrane，m)、核衣壳蛋白基因(nucleocapsid，n)以及3’-非翻译区。sars-cov-2作为一个新变种，其流行规律、致病机制与病原学特征都和以往流行的冠状病毒具有差异。而sars-cov-2全基因组序列的破译，以及与sars-cov基因组表现出较高的序列同源性；又为covid-19的诊断与相关研究提供了非常有用的基础。相关研究可通过与已有的其它冠状病毒的蛋白编码特征比较预测，为后续研究提供有力的指导。

核衣壳蛋白即n蛋白，是rna病毒的主要结构蛋白之一，与致病性密切相关。sars-cov-2n蛋白的功能主要与结合病毒rna来发挥作用相关，可能参与rna的转录及复制等，更全面的生物学功能还需深入研究。从预测的蛋白质氨基酸序列分析，其可能还具有与致病机理相关的新功能，因此在covid-19的诊断以及疫苗研发方面具有重要意义。利用基因工程重组n蛋白可以在covid-19诊断及疫苗上应用，但重组的完整n蛋白因和病毒源生n蛋白序列完全一致，可能存在安全风险。

因此，故利用sars-cov-2n蛋白序列，开发具有其部分核心功能的人工重组多肽，更具安全性，也更便于生产和降低成本，以应用于covid-19诊断及疫苗开发，以及sars-cov-2基因组选择性包装等。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明旨在提供基于sars-cov-2核蛋白的ntd多肽、编码基因、重组载体、表达方法及应用，本发明制备重组ntd多肽更方便高效，发酵工艺简单、耗时短、成本低，目的蛋白表达量达菌体总蛋白的20％以上。

为了达到上述的目的，本发明所采用的技术方案是：

一种基于sars-cov-2核蛋白的ntd多肽，所述ntd多肽是如seqidno.1-4中任一所示氨基酸序列的多肽。

进一步的，基于sars-cov-2核蛋白的ntd多肽基因，其编码如seqidno.1-4中任一所示氨基酸序列的ntd多肽；所述ntd多肽编码基因是如seqidno.5-8中任一所示核苷酸序列的编码基因；基于sars-cov-2核蛋白的ntd多肽的重组载体，其包含上述编码基因。

进一步的，宿主细胞包含上述重组载体，所述宿主细胞为大肠杆菌；所述大肠杆菌为大肠杆菌bl21(de3)、blr(de3)、bl21(de3)plyss、m15、tb1、dh5α或top10。

进一步的，ntd多肽编码基因的表达方法，包括以下步骤：

1)设计相应的引物，利用pcr技术，以人工合成的ntd多肽对应的基因为模板扩增，将扩增的基因片段通过酶切连接的方法，插入到表达质粒中，构建重组载体；

2)将重组载体转化至大肠杆菌，获得重组基因工程菌；

3)将重组基因工程菌接种于培养基中，通过添加乳糖或异丙基硫代半乳糖iptg诱导ntd多肽的表达。

进一步的，所述大肠杆菌为大肠杆菌bl21(de3)、blr(de3)、bl21(de3)plyss、m15、tb1、dh5α或top10。

进一步的，本发明的ntd多肽、ntd多肽编码基因或重组载体在制备用于检测sars-cov-2的产品中的应用。

进一步的，本发明的ntd多肽、ntd多肽编码基因或重组载体在制备sars-cov-2疫苗中的应用。

进一步的，重组ntd多肽可进行covid-19的临床检测；同时也为sars-cov-2抗原抗体检测试剂盒、疫苗开发；以及后续的sars-cov-2核酸药物包装多肽等开发提供基础。

进一步的，ntd多肽原核表达中的制备方法，包括以下步骤：

1)诱导ntd多肽表达后，继续培养菌液，利用摇瓶法培养或发酵罐培养；同时每小时检测菌液od600值，计算大肠杆菌密度；在od600＝2.0以下培养；

2)收集发酵液，离心、破碎菌体，利用亲和层析纯化获得重组ntd多肽。

进一步的，大肠杆菌的培养基为lb或pya8，培养温度为35℃-38℃。

本发明的有益效果：

1)本发明的ntd多肽保留了sars-cov-2核蛋白的n端结构域或其中的关键修饰位点，同时保证其在sars-cov-2核蛋白n端对应位置具有相似的α-螺旋、β-片层等结构，以便形成三级结构相似的多肽类似物，更具安全性；

2)本发明制备ntd多肽的方法更方便高效，发酵工艺简单、耗时短、成本低，目的蛋白表达量达菌体总蛋白的20％以上；

3)本发明的ntd多肽，可以应用于covid-19诊断及疫苗，sars-cov-2基因组选择性包装，应用范围宽泛。

附图说明

图1为sars-cov-2核蛋白在sars-cov-2基因组中的定位；

图2为seqidno.1所示ntd多肽结构图(seqidno.1为sars-cov-2核蛋白n端一段氨基酸序列，修饰了起始氨基酸和结尾氨基酸)；

图3为seqidno.2所示ntd多肽结构图(在seqidno.1的基础上修饰了5处以内的氨基酸)；

图4为seqidno.3所示ntd多肽结构图(在seqidno.1的基础上修饰了10处以内的氨基酸)；

图5为seqidno.4所示ntd多肽结构图(在seqidno.1的基础上修饰了30处以内的氨基酸)；

图6为重组sars-cov-2核蛋白和ntd系列多肽间接elisa值分析；

图7为本发明实施例中四种pet-ntd载体表达ntd系列多肽的sds-page电泳检测结果图；“control”为带pet-28(a)空载体的对照；

图8为本发明实施例中western检测表达的四种ntd系列多肽的western检测结果图；图中根据marker对应的分子量约20kda的条带为检测到的ntd系列多肽的条带。

具体实施方式

为了进一步说明本发明的技术效果，下面通过实施例对本发明进行具体描述。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。ntd系列多肽指的是如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4序列所示的ntd多肽。

本发明利用氨基酸序列和核酸序列同源比对分析序列同源性，利用蛋白或多肽二级结构预测工具如sopma、gor、proscan、signalp等工具分析sars-cov-2核蛋白二级结构情况、关键修饰位点、核心结构域、信号肽区域、亲疏水情况等。利用蛋白或多肽三级结构预测工具如swiss-model等工具进一步分析sars-cov-2核蛋白三级结构情况、核心结构域与关键修饰位点模拟位置等。经过上述分析预测，设计出sars-cov-2核蛋白n端的一段多肽命名为ntd。该ntd系列多肽保留了sars-cov-2核蛋白的n端结构域或其中的关键修饰位点(如：n-糖基化位点、camp和cgmp依赖的蛋白激酶磷酸化位点、蛋白激酶c磷酸化位点、酪蛋白激酶ii磷酸化位点、n-酰化位点等)，同时保证其在sars-cov-2核蛋白n端对应位置具有相似的α-螺旋、β-片层等结构，以便形成三级结构相似的多肽类似物，得到本发明的ntd多肽序列如图2-5所示。

实施例

材料、菌株及质粒载体

菌株：大肠杆菌菌株dh5α、top10、m15、bl21、tb1

质粒载体：载体pet-28(a)、pmal和pqe-30。

试剂、试剂盒、酶

试剂、试剂盒：磷酸酶标记羊抗兔igg和nbt/bcip染色试剂盒。荧光素酶检测系统(luciferaseassaysystem)购自promega公司。其余试剂均为分析纯。

酶：限制性内切酶bamhi，hindiii等，t4dna连接酶，rtaq酶和pfu酶。

培养基

lb液体培养基(1l)：胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，nacl：10g，用5mol·l^-1的naoh调ph至7.0，高温灭菌。

lb固体培养基(1l)：lb液体培养基+琼脂粉15g。

pya培养基(1l)：na2hpo416.1g，kh2po41.36g，nacl0.5g，酵母抽提物5.0g，ch3coona10.0g，用0.1mol/lnaoh或5％h2so4.调节ph，根据ph数值在pya名称后添加数值命名对应ph值的pya培养基，如ph调至8,则命名为pya8；高温灭菌。

主要试剂配方

(1)dna提取相关试剂：

提取介质ⅰ：tris0.2mol/l，edta-na250mmol/l，nacl0.25mol/l，ph8.0；

提取介质ⅱ：tris0.1mol/l，edta-na220mmol/l，nacl1.4mol/l，2％(m/v)ctab，ph8.0。

(2)sds聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)相关试剂：

30％丙烯酰胺贮存液：29％丙烯酰胺，1％双丙烯酰胺。

29g丙烯酰胺，lg双丙烯酰胺加蒸馏水至100ml，通风橱中搅拌至完全溶解后过滤，4℃贮存。

分离胶缓冲液：l.5mtris-hci(ph8.8)。

浓缩胶缓冲液：l.0mtris-hci(ph6.8)。

10％的过硫酸铵：

1g过硫酸铵，加入蒸馏水定容至10ml。

10％sds：

10gsds，加入蒸馏水定容至100ml。

10x电泳缓冲液(tris-gly电泳缓冲液)：

30gtris，144ggly，10gsds；分别溶解于蒸馏水中，再定容到1000ml。

2xsds凝胶上样缓冲液(loadingbuffer)：

1mtris-hci(ph6.8)；0.2mdtt；4％(w/v)sds；0.2％(w/v)溴酚蓝；20％(v/v)甘油。

聚丙烯酰胺凝胶染色液：

聚丙烯酰胺凝胶脱色液：

(3)质粒提取相关试剂：

溶液ⅰ：50mm葡萄糖，25mmtris-hcl(ph8.0)，10mmedta(ph8.0)。

1mtris-hcl(ph8.0)12.5ml，0.5medta(ph8.0)10ml，葡萄糖4.730g，加ddh2o至500ml。高压灭菌15min，贮存于4℃。

溶液ⅱ：0.2nnaoh，1％sds；

2nnaoh1ml，10％sds1ml，加ddh2o至10ml。使用前临时配置。

溶液ⅲ：醋酸钾(kac)缓冲液，ph4.8。

5mkac300ml，冰醋酸57.5ml，加ddh2o至500ml，4℃保存备用。

苯酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)。

pcr扩增及其目的片段的回收：

针对人工合成基因片段设计引物对分别加上bamhi和hindiii酶切位点，所述引物对的序列见表1；以设计的ntd多肽的人工合成的大肠杆菌表达偏好基因为模板进行pcr扩增，pcr条件如表2.1。反应参数：95℃预变性5min；然后30个循环(94℃30sec,55℃30sec,72℃1.5min)；并于72℃继续延伸10min。反应在pcr仪上进行。将pcr产物末端加a：30μlpcr产物；30μl10×pcrbuffer(不含mgcl2)；2μlmgcl2；0.8μlpfu酶；1μldatp，95℃：5min；72℃：30min；4℃保存。

表1用于扩增基因的引物对列表

*引物需添加酶切位点序列：5'-gcgggatcc(bamhi)；5'-gcgaagctt(hindiii)

*需添加的组氨酸标签序列：5'-caccaccaccaccaccactga-3'

表1中的seqidno.9为seqidno.5的上游引物，seqidno.10为seqidno.5的下游引物；seqidno.11为seqidno.6的上游引物，seqidno.12为seqidno.6的下游引物；seqidno.13为seqidno.7的上游引物，seqidno.14为seqidno.7的下游引物；seqidno.15为seqidno.8的上游引物，seqidno.16为seqidno.8的下游引物。

基因模板为seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4对应的编码基因核苷酸序列，如seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7和seqidno.8。

随后根据tiangen公司的胶回收试剂盒说明书进行胶回收。

表2pcr扩增ntd多肽基因的反应体系

目的片段的双酶切

将步骤2扩增得到的ntd多肽基因片段与提取的质粒pet-28(a)、pmal和pqe-30分别进行bamhi、hindiii双酶切。酶切体系如表3所示：

表3双酶切检验体系

1％琼脂糖电泳分离酶切片段后，用胶回收试剂盒回收相应片段，得到带酶切位点bamhⅰ和hindiii的目的片段。

表达片断的连接、转化

用t4dna连接酶将ntd多肽基因双酶切下的表达片断分别与以同样双酶切后的表达质粒pet-28(a)、pmal和pqe-30在16℃下连接过夜，构建重组载体pet-ntd、pmal-ntd和pqe-ntd。并将这两种重组载体分别转入大肠杆菌bl21(de3)、tb1和m15感受态细胞，或转入dh5α、top10感受态细胞筛选后作为保存重组载体的保存菌株。

重组质粒的筛选

挑取所得白色转化菌落作菌落pcr，扩增的反应体系和参数见ntd多肽基因片段的扩增，但模板改为菌落。

把经菌落pcr检测，呈阳性的菌落在lb液体培养基上增殖培养，并提取质粒。方法采用现有的市售sigma或omega等质粒提取试剂盒。用bamhi和hindiii对重组质粒进行双酶切鉴定和测序检测。

重组ntd多肽的诱导表达

诱导多肽表达、取样：

吸取转化有重组质粒的bl21(de3)、tb1和m15菌液各10μl，分别加入含有相应抗生素的lb液体培养基20ml，37℃和25℃条件下分别振荡培养至od600值0.4-0.8，取出1ml培养物，收集菌体后至4℃保存，作为诱导前样品。向其余培养物中加入iptg(终浓度为0.5mm),诱导4-8h后取样1ml，收集菌体后置4℃保存。

重组ntd多肽样品处理：

取样完成后，如果制作细菌总蛋白，则向每次取样得到的菌体中加入100ul裂解buffer(50mmtris-hcl(ph8.5-9.0)，2mmedta，100mmnacl，0.5％tritonx-100，1mg/ml)，再加入100ul2×蛋白上样缓冲液。用移液器吹打均匀后，置沸水浴中煮10-15min，煮毕后12000rpm离心5分钟，上清即可上样。

若需要将细菌总蛋白分为可溶和不可溶(包涵体)两部分分别进行检测，则向每次取样得到的菌体中加入100ulpbs，用移液器吹打均匀，冰浴条件下用水槽式超声破碎器对菌体的pbs重悬液进行超声破碎，直至溶液清亮，其间不断冷却以免破碎时积累的热量使释放出的蛋白变性而产生溶解性的变化。破碎完毕后，于4℃下13000rpm离心20分钟。然后小心转移上清至一新的离心管中。加入100ul2×蛋白上样缓冲液，充分混匀，置沸水浴中煮10-15min，煮毕即制得可溶部分的蛋白样品。12000rpm离心5分钟，上清即可上样。对于沉淀部分，加入100ul裂解buffer和100ul2×蛋白上样缓冲液，用移液器吹打均匀后，置沸水浴中煮10-15min，煮毕后即制得不可溶部分的蛋白样品，12000rpm离心5分钟后，上清即可上样。

样品制备完毕后，进行12％的sds-page电泳，考马斯亮蓝r-250进行过夜染色。染色完毕后，用脱色液进行脱色。图7显示ntd系列多肽对应核酸序列经插入质粒载体进行大肠杆菌重组表达能够产生ntd系列多肽。同时通过对sds-page胶的定量扫描分析显示ntd多肽表达量占菌体蛋白的20％以上，参见表4ntd多肽表达百分比量：

表达产物的western检测

western印迹分析按照nathalie等^[14]所述方法进行。将sds-page凝胶上的蛋白电转移到硝酸纤维素膜上(100v稳压转移2h)。以抗his-tag组氨酸标签多克隆抗体作为一抗，磷酸酶标记羊抗兔igg为二抗，nbt/bcip染色试剂盒进行western检测。结果见图8，从图8中可以看出，本发明提供的4种ntd多肽得到了表达，且在大肠杆菌中有更好的表达。

大肠杆菌发酵培养

取含pet-ntd重组质粒的大肠杆菌bl21(de3)菌液10ml，加入10llb培养基中培养，摇床设为250rpm，温度37℃，加入抗生素，卡那霉素50μg/ml，检测od600光度值记录大肠杆菌生长曲线。当od600＝0.5时加入0.5％nam和1％乳糖，继续培养。

取含pmal-ntd重组质粒的大肠杆菌tb1菌液1ml，加入1llb培养基中培养，摇床设为250rpm，温度37℃，加入抗生素，氨苄霉素50μg/ml，检测od600光度值记录大肠杆菌生长曲线。当od600＝0.55时加入0.2％nam和0.5mmiptg与0.5％葡萄糖，继续培养。

取含pqe-ntd重组质粒的大肠杆菌m15菌液10ml，加入10lpya培养基中培养，ph8.0，摇床设为200rpm，温度37℃，加入抗生素，氨苄霉素amp50μg/ml，检测od600光度值记录大肠杆菌生长曲线。当od600＝0.4时加入0.5％nam和1.0mmiptg与0.5％葡萄糖，继续培养。

取含pqe-ntd重组质粒的大肠杆菌m15菌液50ml，加入50llb培养基中培养，摇床设为200rpm，温度37℃，加入抗生素，氨苄霉素amp50μg/ml，检测od600光度值记录大肠杆菌生长曲线。当od600＝0.45时加入1.0％nam和1.5％乳糖，继续培养。

表达产物的纯化

离心收集菌体，重悬后在冰水浴中30min超声破碎(6s×10s)，使菌液变透明澄清，离心，分别收集上清和沉淀。将沉淀重悬，在冰水浴中超声破碎处理30min(5s×10s)，4℃，12，000rpm离心20min收集上清，4℃保存准备过柱纯化。将ni-nta柱作为纯化融合蛋白的柱子，利用携带的6×his标签进行纯化，收集纯化样品，sds–page电泳检测。

sars-cov-2核蛋白及ntd系列多肽的间接elisa检测

将sars-cov-2核蛋白和ntd多肽分别以elisa包被稀释液稀释至2μg/ml，4℃，包被酶联板100μl/孔12h。酶联板甩干，加入elisa封闭液100μl/孔，4℃处理12h。再将酶联板甩干，elisa洗液，洗4次，每次静置2分钟，甩干并在吸水纸上拍干。每孔加入以elisa稀释液1：50比例稀释待检血清，100μl/孔，37℃静置2h；再用elisa洗液，洗4次，每次静置2分钟，甩干并在吸水纸上拍干。然后每孔加入以elisa稀释液1：10,000比例稀释的羊抗人igg-hrp，100μl/孔，37℃静置2h；再用elisa洗液，洗4次，每次静置2分钟，甩干并在吸水纸上拍干。加elisa显色剂a、b，每孔1滴，避光处理10min。加入2mo1/l硫酸50μl终止反应，用酶标仪检测酶联板450nm光的吸光度值(a450)。

感染者血清中理论上存在igg或igm/抗体，利用纯化的sars-cov-2核蛋白及ntd系列多肽，以间接elisa检测20例健康血清样本和5例阳性血清样本。sars-cov-2核蛋白组与对照组所得a450吸光值通过t检验分析显示，t值为10.6，p<0.01，表明sars-cov-2核蛋白组与对照组具有显著差异，可以支持ntd系列多肽间接elisa检测，如图6-8所示，表明ntd系列多肽能够替代sars-cov-2核蛋白开展covid-19诊断应用。

最后需要说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，本领域技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。

序列表

<110>秦小波

<120>基于sars-cov-2核蛋白的ntd多肽、编码基因、重组载体、表达方法及应用

<160>16

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>132

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

metglyleuproasnasnthralasertrpphethralaleuthrgln

151015

hisglylysgluaspleulyspheproargglyglnglyvalproile

202530

asnthrasnserserproaspaspglnileglytyrtyrargargala

354045

thrargargileargglyglyaspglylysmetlysaspleuserpro

505560

argtrptyrphetyrtyrleuglythrglyproglualaglyleupro

65707580

tyrglyalaasnlysaspglyileiletrpvalalathrgluglyala

859095

leuasnthrprolysasphisileglythrargasnproalaasnasn

100105110

alaalailevalleuglnleuproglnglythrthrleuprolysgly

115120125

phetyralaglu

130

<210>2

<211>132

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

metglyleuproasnasnthralasertrpphethralaleuthrgln

151015

hisglylysglugluleulyspheproargglyglnglyvalproile

202530

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354045

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505560

argtrptyrphetyrtyrleuglythrglyproglualaglyleupro

65707580

tyrglyalaasnlysaspglyilevaltrpvalalathrgluglyala

859095

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100105110

alaalailevalleuglnleuproglnglythrthrleuprolysgly

115120125

phetyralaglu

130

<210>3

<211>132

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

metglyleuproasnasnthralasertrpphethralaleuthrgln

151015

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202530

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65707580

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<210>4

<211>128

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

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151015

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859095

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100105110

phealaproglythrvalleuproglnglyphetyrvalgluglyser

115120125

<210>5

<211>396

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

atgggtctgccgaataataccgcaagttggtttacggccctgacacagcatggtaaagaa60

gatctgaaatttccacgcggtcagggtgtgccgattaatacaaatagctcacctgatgat120

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<210>6

<211>396

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

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<210>7

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