一种基于RT-PCR及毛细电泳的同步检测19种脑炎脑膜炎病原体的试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及病原体核酸检测技术领域，具体涉及一种基于rt-pcr及毛细电泳的同步检测19种脑炎脑膜炎病原体的试剂盒及检测方法。

背景技术：

脑膜炎(meningitis)是指包裹大脑和脊髓的保护薄膜急性炎症，而这些保护薄膜被统称为脑膜。脑膜发炎可由病毒、细菌或其他微生物的感染所引致，而在少数情况下或可由某种药物引发。脑膜炎由于其发炎位置接近大脑和脊髓，因此可以致命；所以此病为内科急诊的一种。

脑膜炎最常见的症状是头痛和颈部僵直，伴随发烧、精神错乱或意识改变、呕吐、畏光(恐光症)或响亮的声音(声音恐惧症)。儿童通常只会出现非特异性的症状，如易怒和精神萎靡。按照病因可分为：细菌性脑膜炎、病毒性脑膜炎、真菌性脑膜炎、寄生性脑膜炎和非感染性脑膜炎。

细菌性脑膜炎是一种发病率低，但是症状非常严重，可能致死的疾病。脑膜炎奈氏菌(neisseriameningitidis)、肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)和流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenzae)是引起细菌性脑膜炎的常见的3种病原体。肺炎链球菌主要感染2岁以下的儿童和免疫低下/缺陷的成年人，肺炎球菌性脑膜炎是细菌性脑膜炎中最严重的，患者通常会有神经损伤，例如耳聋，脑损伤。流行性脑脊髓膜炎是由脑膜炎奈氏菌引起的，患者可能会有脑损伤等其他后遗症。嗜血杆菌脑膜炎也是发病率很高的疾病，但是随着b型流感嗜血杆菌疫苗的使用，发病率已经大大降低。其他类型的细菌性脑膜炎的细菌还有李斯特氏菌脑膜炎(listeriamonocytogenesmeningitis)、大肠杆菌脑膜炎(escherichiacolimeningitis)、结核分枝杆菌脑膜炎(mycobacteriumtuberculosismeningitis)。

病毒性脑膜炎(viralmeningitis)通常是由肠道病毒引起的，病毒通过口传入身体中，并传染到脑及周边组织，并在那里繁殖。其他病毒包括水痘带状疱疹病毒、单纯性疱疹病毒、腮腺炎病毒等等。

引起真菌性脑膜炎最常见的病原体是新型隐球菌(cryptococcusneoformans)，尽管是可治愈的，但是感染过新型隐球菌的人中接近一半的人可能复发。

脑炎(encephalitis)是指脑实质受病原体侵袭导致的炎症性病变。由于发病原因复杂、诊断难度大，加之起病急、病情凶险，如果治疗不及时，会对身体健康和生命安全造成严重危害，尤其是婴幼儿，影响其生长发育。脑炎的感染病原体繁多，通常由病毒感染造成，也可由细菌、霉菌、螺旋体、立克次氏体、寄生虫等感染引起，有的可能是变态反应性疾病，如急性播散性脑脊髓炎。但是60％的脑炎都是未确诊的，这是个值得探索的领域。最常见的致病菌有脑膜炎奈瑟氏菌、肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌、葡萄球菌、结核分枝杆菌、李斯特氏菌、大肠杆菌等。最常见的病毒感染有肠道病毒、单纯性疱疹病毒、腮腺炎病毒、巨细胞病毒、日本脑炎病毒、柯萨奇病毒和虫媒病毒等。

临床常用的脑炎脑膜炎检测方法，包括脑脊液检查、影像学检查、分子生物学法、二代测序技术等。具体如下：

(1)脑脊液检查

脑脊液(cerebrospinalfluid，csf)可行常规、生化、细菌学和免疫学检查。腰椎穿刺术常用于检查脑脊液的性质，对诊断脑膜炎、脑炎、脑血管病变、肿瘤以及其他全身疾病有重要意义。将脑脊液分别收集于3个无菌试管中，第一管作细菌培养，第二管作化学分析和免疫学检查，第三管作一般性状及显微镜检查。每管收集1～2ml。csf检查是脑炎脑膜炎病原学检查的首要手段。csf动力学检查可以了解脑脊髓腔通畅情况；细胞学检查可了解炎症反应的程度；生化检查可有助于区别细菌性或病毒性感染；免疫抗体及核酸检测有助于病毒性疾病的诊断；考虑到可能是细菌感染，必须做脑脊液的细菌培养和药物敏感试验，明确感染源。细菌培养是金标准，也是目前实验室常规检测手段，革兰氏染色、墨汁染色、抗酸染色等检测手段也用于细菌检测。这些方法都存在灵敏度低的缺陷，同时培养法耗时长。

(2)影像学检查

通过电子仪器进行检波、放大，将脑电记录下来的图形即为脑电图。脑电图是反映大脑细胞电活动的最敏感指标，其异常脑电活动改变及转归与临床病情及预后有较高的一致性。作为众多辅助检查手段的一种，具有敏感度高等特点，对脑炎的诊断具有不可替代的作用。而脑电图也有一定的弊端：有文献报道脑电图异常多于中枢神经系统受累后3～5天出现，发病早期检查可能无明显异常，需要根据病情变化进行复查并与前次检查对比分析。

头颅ct检查可显示炎症导致的脑水肿、脑容积的变化，脑皮质和髓质的密度改变。ct值的变化对于是否伴有出血、反映病变的严重程度，辅助医师对病情作出更准确的判断有重要意义。

磁共振成像(magneticresonanceimaging，mri)在脑炎的诊断比ct更准确，这是因为mri对脑髓质水分含量较敏感，组织分辨率更高，可以显示ct看不到的一些异常，如发病早期较轻的脑水肿、脱髓鞘病变等。mri检查病人免受x线照射，但由于其费用较高，检查时间较长，噪音较大，对于有精神异常的病人，检查时易受噪音的刺激引发精神激越发作。

(3)分子生物学法

pcr技术克服了病原体分离和抗原、抗体免疫学检测的缺点，已成为微生物感染快速诊断的重要手段，国外有学者称其为cns感染病原诊断的金标准，也有学者称其为临床常规实验室的“first-linediagnostictest”。目前常用的方法有pcr、多重pcr、实时pcr及生物芯片等。pcr方法与培养法相比，敏感性和特异性更高，病原诊断所需时间由原来的数天减少为数小时。其高效性、灵敏性、特异性，为临床用药提供更有效的信息，可以抓住治疗时机。

(4)二代测序技术

二代测序技术(nextgenerationsequencing，ngs)，可一次性对几百万到十亿条dna分子进行并行测序，是一种较一代测序通量更高、成本更低、用时更短且自动化程度更高的测序技术。ngs有潜力成为神经感染性疾病的诊断工具。对于并非临床常见而没有在多数医院常规开展检测的囊虫、布氏杆菌、螺旋体等病原体，或者培养方法较复杂或非常规开展的李斯特氏菌、奴卡菌等病原体，ngs检测可以规避常规检查的不足。尽管脑脊液ngs检测给神经系统感染的病原学检查带来了很大变革，但目前ngs的检测和解读仍然存在很多问题。感染性疾病待测标本的成分复杂、病原微生物核酸浓度较低等因素均制约了脑脊液病原微生物的ngs检测。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是克服背景技术的技术缺陷，提供一种基于一步法rt-pcr及毛细电泳的同步检测19种脑炎脑膜炎病原体的试剂盒及其检测方法，该试剂盒能对患者的脑脊液样本进行检测，并给出分析，帮助临床医师确诊病原体并有效治疗。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

本试剂盒包含以下几个组分：me预混液、rt-pcr酶液、me阳性对照、阴性对照、反应内参和无核酸酶水。其中的me预混液由5×一步法rt-pcr缓冲液、22对引物、dntp、mgcl2混合而成。引物包含扩增19种病原体靶基因、1个人基因组dna内参、1个人rna内参和1个反应内参的引物序列。上述引物序列及其pcr产物长度详见表1。

表1本试剂盒检测靶点、内参引物序列

具体地，本发明公开了一种基于一步法rt-pcr及毛细电泳的同步检测19种脑炎脑膜炎病原体的检测方法，包括如下步骤：

(1)采集患者脑脊液样本；

(2)样本和ic核酸提取；

(3)配制反应体系，加入提取好的核酸；

取me预混液4.6μl，加入rt-pcr酶液0.4μl，混合均匀后加入提取好的样本核酸5μl；

(4)一步法rt-pcr扩增；

本试剂盒的pcr扩增反应条件见表2：

表2一步法rt-pcr扩增条件

(5)对扩增产物进行毛细电泳分析，并根据峰型图进行结果判读。

取3500dx遗传分析仪配套高度去离子甲酰胺(hidi)8.75μl、size-500plus0.25μl，混合后加入pcr产物1μl进行毛细电泳分离样品。根据峰型图的出峰位置大小判断脑炎脑膜炎病原体种类。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本试剂盒可对患者脑脊液样本提取核酸进行一步法多重rt-pcr扩增，同时检测19种脑炎脑膜炎病原体；

(2)本试剂盒通过靶点特异性引物的设计，可以精确测出感染的病原体，包括同步提供交叉感染信息；

(3)本试剂盒人基因组dna内参和人rna内参可有效监控核酸提取样本质量，防止因样本不合格造成的假阴性结果；

(4)本试剂盒反应内参可有效监控核酸提取、rt-pcr扩增和毛细电泳过程；

(5)本试剂盒利用3500dx遗传分析仪灵敏、准确、快速、高通量的技术优势，将为疾控中心、医院及其他医疗机构提供一种灵敏、准确、快速的多重脑炎脑膜炎病原体检测方案；

(6)本试剂盒可同步对19种脑炎脑膜炎病原体进行检测，并同时提供交叉感染信息，具有灵敏度高、特异性强、重复性好、快速准确的优势。

附图说明

图1为本试剂盒阳性对照扩增图谱，19种脑炎脑膜炎病原体、人dna内参、人rna内参和反应内参均在相应位置出现特征峰；

图2为本试剂盒阴性对照扩增图谱，人dna内参、反应内参出现特征峰；

图3为脑膜炎患者1脑脊液提取核酸扩增图谱，人dna内参、人rna内参、反应内参和结核分枝杆菌(tb)靶点出现特征峰；

图4为脑膜炎患者2脑脊液提取核酸扩增图谱，人dna内参、人rna内参、反应内参、肠道病毒(ev)和单纯疱疹病毒2型(hsv-2)靶点出现特征峰。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于对本发明进一步说明，而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明所述的内容后，该领域的技术人员对本发明作出一些非本质的改动或调整，仍属于本发明的保护范围。

检测19种脑炎脑膜炎病原体包括如下步骤：

(1)采集患者脑脊液样本；

(2)样本及ic核酸提取；

(3)配制反应体系，加入提取好的核酸；

取me预混液4.6μl，加入rt-pcr酶液0.4μl，混合均匀后加入提取好的样本核酸5μl；

(4)一步法rt-pcr扩增；

本试剂盒的pcr扩增反应条件见表2。

(5)对扩增产物进行毛细电泳分析，并根据峰型图进行结果判读。

取3500dx遗传分析仪配套高度去离子甲酰胺(hidi)8.75μl、size-500plus0.25μl，混合后加入pcr产物1μl进行毛细电泳分离样品。根据峰型图的出峰位置大小判断脑炎脑膜炎病原体数量和种类。

本试剂盒包含以下几个组分：me预混液、rt-pcr酶液、me阳性对照、阴性对照、反应内参和无核酸酶水。其中的me预混液由5×一步法rt-pcr缓冲液、引物、dntp、mgcl2混合而成。引物包含19种病原体靶基因、1个人基因组dna内参、1个人rna内参和1个反应内参的引物组，详见表1。

在实施例1中，所述的样本为患者脑脊液样本。

在实施例1中，通过毛细管电泳对扩增产物进行电泳，并结合分析软件给出扩增图谱并给出分析，判断患者感染的脑炎脑膜炎病原体数量和种类。

实施例1

(1)所选样本：患者脑脊液样本。

(2)样本采集

采集方法：采用腰椎穿刺采集脑脊液样本。病人取卧位，颈部前屈，两侧髋关节和膝关节屈曲以便脊椎间隙增宽。穿刺点在第3、4腰椎间隙。

有效样本：外观应无色透明液体，样本量1ml以上，无血液污染。

(3)核酸提取：取300μl脑脊液样本进行核酸提取，me阳性对照和阴性对照各取80μl进行提取，每个参与提取的样本需加入2μl的ic共同提取。

(4)配制反应体系

根据说明书，按照每个反应me预混液4.6μl、rt-pcr酶液0.4μl的比例配制反应体系，涡旋混匀后，用离心机进行离心，然后分装于pcr反应管中。

(5)加入核酸模板：将提取好的核酸加入到装有配制好的反应体系的pcr反应管中，每人份加入5μl核酸。

(6)一步法rt-pcr扩增

一步法rt-pcr扩增条件见表2。

(7)毛细电泳

由高纯度去离子甲酰胺与系统中分子量内标(size-500plus)组成上样混合物[(0.25μlsize-500plus+8.75μl高纯度去离子甲酰胺)×(进样数)]。将9μl上样混合物与1μl扩增产物混合，避免产生气泡，尽快电泳。用abi3500遗传分析仪(购自美国abi公司)检测分析，具体分析参数为进样电压：1.2kv，进样时间：15s，电泳时间1210-1500s。检测结果分别为图1、图2、图3和图4。

(8)分析数据

本次实验中所使用的是患者样本，根据各目的峰在图谱中出现的位置，确定该患者感染的病原体类型。

图1为阳性对照的分析图谱，图2为阴性对照的分析图谱，图3为脑膜炎患者1的分析图谱，图4为脑膜炎患者2的分析图谱。

结果分析如下：

图1为阳性对照扩增结果图谱，19种脑炎脑膜炎病原体、人dna内参、人rna内参和反应内参均在相应位置出现特征峰。

图2为阴性对照扩增结果图谱，人dna内参和反应内参均出现特征峰。

图3为脑膜炎患者1脑脊液样本的分析图谱。

脑膜炎患者1脑脊液样本扩增产物电泳图谱出现以下特征峰：人dna内参、人rna内参、反应内参、结核分枝杆菌(tb)。表明该患者感染了结核分枝杆菌。

图4为脑膜炎患者2脑脊液样本的分析图谱。

脑膜炎患者2脑脊液样本扩增产物电泳图谱出现以下特征峰：人dna内参、人rna内参、反应内参、肠道病毒(ev)、单纯疱疹病毒2型(hsv-2)。表明该患者感染了肠道病毒和单重疱疹病毒2型，为交叉感染类型。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

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<110>宁波海尔施基因科技有限公司

<120>一种基于rt-pcr及毛细电泳的同步检测19种脑炎脑膜炎病原体的试剂盒及检测方法

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