本发明涉及酶生产领域，具体而言，涉及一种酮还原酶突变体及其应用。
背景技术：
手性醇作为重要中间体，广泛用于手性药物和其他手性精细化学品的合成，国内外已有许多相关的合成报道。许多手性药物都含有一个或多个手性中心，不同手性药物的药理活力、代谢过程、代谢速率以及毒性有显著差异，通常一种对映体是有效的，而另一种对映体则是低效或无效的，甚至是有毒的。因此，如何高效立体选择性地构建含手性中心的化合物在医药研发中有着重要意义。
手性醇的生产有多种，比如通过动力学拆分可以由外消旋体醇为起始原料获取单一构型的醇，然而该方法理论收率为50%，成本较高。利用手性恶唑硼烷硼氢化、手性过渡金属铑、铷等可不对称催化氢化合成手性醇，然而反应条件比较剧烈，如高温高压等，同时涉及到过渡金属等有毒试剂残留问题。
酮还原酶用作催化剂来替代传统化学催化剂，具有反应温和，环境污染少等优点，在制药领域获得了极大的关注。
生物催化符合可持续发展观念和绿色化学，生物催化剂来源于可再生材料，在温和条件下发挥催化作用，不同生物催化剂在相似的条件下催化反应，容易设计为更经济的级联催化反应。因此，利用酮还原酶催化合成手性醇是极为有潜力的催化方式，但是也存在一定的困难，尤其是针对不同的底物，如酶的催化活力低，酶催化后的产物选择性低等问题，因此，开发手性特异性高的高活力的酮还原酶具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的主要目的在于提供一种酮还原酶突变体及其应用，以解决现有技术中的酮还原酶或其突变体所能催化的底物的选择性较低的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种酮还原酶突变体，与seqidno:1所示的氨基酸序列相比，该酮还原酶突变体的氨基酸序列包括如下至少一种突变位点：l198p、s96w/i/l/v、m194l或l152g，其中“/”代表“或”。
进一步地，酮还原酶突变体的氨基酸序列还包括如下突变位点之一：q24l、v34m、i35v、a72v、l80r、t94s、y95f、v99t、s101n、l104s、i143v、i147v、a153t、y178c、v185i、y189f/w、i190t、p193h、v195i、t199i、e201g/d/h、d202a、a203g/s、r206q、d234v、k237e及t240i；或者酮还原酶突变体具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有80%以上，优选为85%以上，更优选为90%以上，进一步优选为95%以上同一性的氨基酸序列。
进一步地，酮还原酶突变体的氨基酸序列具有如下任一组合的突变位点：
s96w+l198p、s96l+l198p、s96w+m194l+l198p、s96w+y189f+l198p、s96w+l198p+e201d、s96w+i143v+m194l+l198p+r206q、s96w+i143v+m194l+l198p+e201d+r206q、s96w+i143v+i190t+m194l+l198p+e201d+r206q、t94s+s96w+m194l+l198p、s96w+m194l+l198p+e201g、t94s+s96i+m194l+l198p、t94s+s96w+i143v+i190t+m194l+l198p+e201d+r206q、s96w+i143v+i190t+m194l+l198p+e201g+r206q、t94s+s96w+i143v+i190t+m194l+l198p+e201g+r206q、t94s+y95f+s96w+i143v+i190t+m194l+l198p+e201d+r206q、t94s+y95f+s96w+i143v+i190t+m194l+l198p+e201g+r206q、s96w+i143v+i190t+m194l+v195i+l198p+e201d+r206q、s96w+i147v+m194l+l198p、s96w+a153t+m194l+l198p、q24l+a72v+s101n+s96w+m194l+l198p、s96w+i190t+m194l+l198p+d234v、s96w+m194l+l198p+k237e、s96w+p193h+m194l+l198p、v34m+s96w+m194l+l198p、s96w+m194l+l198p+e201h、l80r+s96w+m194l+l198p、s96w+m194l+l198p+d234v、s96w+i143v+i190t+m194l+l198p+t199i+e201d+r206q、s96w+v99t+i143v+i190t+m194l+l198p+e201d+r206q、s96w+l104s+i143v+i190t+m194l+l198p+e201d+r206q、t94s+y95f+s96w+i143v+i190t+m194l+v195i+l198p+e201g+r206q、t94s+y95f+s96w+i143v+i190t+m194l+v195i+l198p+e201d+r206q、i35v+t94s+y95f+s96w+i143v+i190t+m194l+l198p+e201g+r206q、t94s+y95f+s96w+i143v+v185i+i190t+m194l+l198p+e201g+r206q、t94s+y95f+s96w+i143v+i190t+m194l+l198p+e201g+r206q+t240i、t94s+y95f+s96w+i143v+y178c+i190t+m194l+v195i+l198p+e201d+r206q、t94s+y95f+s96w+i143v+i190t+m194l+v195i+l198p+e201d+a203g+r206q、s96w+m194l+i143v+r206q+i190t+l198p+e201d+t94s+y95f+v195i+a203s、t94s+y95f+s96w+i143v+y189w+i190t+m194l+l198p+e201g+r206q、t94s+y95f+s96w+m194l+l198p+i143v+r206q+i190t+e201d+d201g+v195i+y189w、t94s+y95f+s96w+i143v+y189w+i190t+m194l+v195i+l198p+e201d+r206q、t94s+y95f+s96w+i143v+y178c+y189w+i190t+m194l+v195i+l198p+e201d+r206q、t94s+y95f+s96w+i143v+y189w+i190t+m194l+v195i+l198p+e201d+a203g+r206q、t94s+y95f+s96w+i143v+r206q+y189w+i190t+m194l+v195i+l198p+e201d+a203s、t94s+y95f+s96w+i143v+y178c+i190t+m194l+v195i+l198p+e201d+d202a+a203g+r206q、t94s+y95f+s96w+i143v+y178c+y189w+i190t+m194l+v195i+l198p+e201d+d202a+a203g+r206q。
为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种dna分子，dna分子编码上述任一种酮还原酶突变体。
根据本发明的第三个方面，提供了一种重组质粒，重组质粒连接有权利要求4的dna分子。
根据本发明的第四个方面，提供了一种宿主细胞，宿主细胞含有上述任一种重组质粒。
进一步地，宿主细胞包括原核细胞或真核细胞；优选原核细胞为大肠杆菌。
根据本发明的第五个方面，提供了一种生产手性醇的方法，方法包括：采用上述任一种酮还原酶突变体催化式（i）所示的手性酮类化合物进行还原反应生产手性醇的步骤，
式（i），
其中，n为0、1、2或3；r1选自：h、oh、取代或未取代的c1-10的烷基、取代或未取代的c3-6的环烷基、取代或未取代的c6-12的芳基、取代或未取代的c3-6的杂环基；或，r1为苯环与所连接的杂环一起形成稠环体系。
进一步地，式（i）所示的手性酮类化合物为
进一步地，酮还原酶突变体与手性酮类化合物的质量比为0.1~10：1；优选地，还原反应的体系中酮类化合物的浓度为1g/l~100g/l；优选地，在20~45℃下进行还原反应。
应用本发明的技术方案，本申请通过理性设计和随机突变相结合的方法对已有的酮还原酶突变体的蛋白进行理性改造，并对获得的突变体使用本申请的底物酮进行催化活力和立体选择性筛选，最终获得了高选择性和高活力的突变体菌株，将含有这些突变体的菌株应用于本申请的酮类底物的催化还原反应中，能够提高其相应的手性醇类化合物的生产效率。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
“酮还原酶”和“kred”在本申请中可相互交换使用，指能够将酮基还原为其对应的醇的多肽。具体地，本申请的酮还原酶能够立体选择性地将酮化合物还原为相应的醇产物。此类酮还原酶通常利用辅因子还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nadh）或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸烟作为还原剂。在本申请中，酮还原酶涉及天然存在的（野生型）酮还原酶以及由人工处理产生的非天然存在的酮还原酶突变体。
“天然存在的”或“野生型”与“突变体”相对，指在自然界中发现的形式。例如，天然存在的或野生型的多肽或多核苷酸序列是存在于生物体的序列，它可以从自然界中的来源中分离，并且没有被人工所特意地修饰或改变。
本申请中，涉及例如，细胞、核酸或多肽“重组”时，是指已经以自然界中未存在的方式进行修饰的，或与自然界中存在的形式相同，但是由合成材料和/或通过使用重组技术的处理制备或衍生而得到，或对应于天然或固有形式的细胞、核酸或多肽。其中，非限制性的实例包括在细胞中表达固有（非重组）形式之外的基因或以不同水平表达固有基因的重组细胞。
“序列同一性的百分比”是指多核苷酸序列或氨基酸序列之间的对比，并且通过跨比较窗比较两条最佳比对的序列来确定，其中，多核苷酸序列或氨基酸序列在比较窗中的部分与参考序列相比可以包括添加或缺失（即，空位），以用于两个序列的最佳比对。百分比可以如下计算：通过确定两个序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目，以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数目，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。可选地，百分比可以如下计算：通过确定两个序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基或者核酸碱基或氨基酸残基与空位对齐的位置的数目，以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数目，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。其中，“参考序列”指用作序列比较的基础的指定序列。参考序列可以是更大序列的子集，例如，全长基因或多肽序列的区段。
定点突变：是指通过聚合酶链式反应（pcr）等方法向目的dna片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高dna所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
为了获得更多酮类化合物底物向其对应的手型醇产物进行转化，需要开发更多的酮还原酶。酶的理性改造是基于酶的三维分子结构对酶的底物结合部位、辅酶结合部位、表面及其他部位进行改造，以改变酶的催化特性，提高酶活力、选择性等特性。
酶的定向进化是一种蛋白质的非理性设计，人为创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外改造基因，应用易错pcr、dna改组（dnashuffling）等技术，结合高效筛选系统获得具有预期特性的新酶。
本申请针通过结合酶的理性改造和定向进化，对如下结构式（i）的酮类化合物底物开发了催化其转化为其对应的手性醇的酮还原酶：
上述结构式中，n为0、1、2或3；r1选自：h、oh、取代或未取代的c1-10的烷基、取代或未取代的c3-6的环烷基、取代或未取代的c6-12的芳基、取代或未取代的c3-6的杂环基；或，r1为苯环与所连接的杂环一起形成稠环体系。
发明人通过以下述式（ii）所示酮类化合物为底物，采用170多种不同种属来源的野生型的酮还原酶及其部分酮还原酶的突变体对该类底物进行催化反应，从而检测不同来源的酮还原酶的催化活力和选择性。经检测，野生型的酮还原酶及其部分突变体对上述底物酮的选择性均较低，有大量的异构体生成，且活力普遍偏低。具体见表1。
（ii）
表1：
活力上：**表示使用5质量比的酶，50反应体积催化16小时后，转化率为80%~90%；*表示使用5质量比的酶，50反应体积催化16小时后，转化率为30%~80%；-表示使用5质量比的酶，50反应体积催化16小时后，转化率为5%~30%；nd表示使用5质量比的酶，50反应体积催化16小时后，转化率小于5%或未检测到产品；
选择性上：-表示选择性小于5%；*表示选择性5%~30%；**表示选择性30%~60%；***表示选择性60%~90%；****表示选择性90%~95%；*****表示选择性95%~100%。
上表中，各不同种属来源的酮还原酶均指野生型的酶，其具体的基因id号可以从ncbi上查到。而各变体分别是相同种属来源的野生型的酮还原酶在不同位点突变得到的突变体。上述来源于acetobactersp的变体1至变体14与来自acetobactersp的野生酮还原酶突变位点的区别具体见下表：
表2：
如前述，来源于acetobacterpasteurianus的酮还原酶accr，可以催化合成手性醇，但是无论是野生型的酮还原酶accr还是其突变体，对上述类别的底物酮的选择性较低，同时活力较低，需使用大量的酶进行催化，获得的产品手性纯度极低，增加了后处理的难度，收率低，步骤复杂。
本发明针对酮还原酶accr的以上不足，为了进一步获得催化活力和/或选择性更高的酮还原酶，本申请通过对上述来源于acetobacterpasteurianus的酮还原酶accr变体1进行进化，通过理性设计对accr蛋白进行改造，通过随机突变获得突变体蛋白，高通量筛选方法定向筛选有益突变体。
本申请以来源于acetobacterpasteurianus的酮还原酶变体1（本申请中称为出发酶或起始酶，其具体氨基酸序列为seqidno:1）为突变改造的基础，采用理性设计和随机突变相结合的方法对accr出发酶进行理性改造，以改善其选择性及活力特性。利用前述结构式（ii）所示的底物酮，对获得的突变体进行催化活力验证，最终获得高选择性和高活力的突变体菌株，使其能够应用于工业生产条件，生产高手性纯度的手性醇。
seqidno：1：
marvagkvaivsgaangigkataqllakegakvvigdlkeedgqkavaeikaaggeaafvklnvtdeaawkaaigqtlklygrldiavnnagitysgsvestsledwrrvqsinldgvflgtqvaieamkksgggsivnlssiegligdpmlaaynaskggvrlftksaalhcaksgykirvnsvhpgyiwtpmvagltkedaaarqklvdlhpighlgepndiaygilylasdeskfvtgselvidggytaq。
本发明技术方案通过理性设计和随机突变相结合的技术对accr出发酶蛋白进行改造，显著提高了突变体的催化活力（见表3），同时显著增强了突变体的选择性（见表4），使其适宜在放大生产高纯度的手性醇。
表3：
上表中，*表示使用0.5质量比的酶（），50反应体积催化16小时后，转化率小于20%；**表示使用0.5质量比的酶，50反应体积催化16小时后，转化率30%~50%；***表示使用0.5质量比的酶，50反应体积催化16小时后，转化率大于50%；****表示使用0.2质量比的酶，20反应体积催化16小时后，转化率0%~50%；*****表示使用0.2质量比的酶，50反应体积催化16小时后，转化率50%~90%；******表示使用0.2质量比的酶，50反应体积催化16小时后，转化率90%~100%。
表4：
上表中，-表示选择性小于5%；*表示选择性5%~40%；***表示选择性40%~90%；****表示选择性90%~95%；*****表示选择性95%~100%。
因此，在上述研究结果的基础上，申请人提出了本申请的技术方案。在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种酮还原酶突变体，与seqidno:1所示的氨基酸序列相比，该酮还原酶突变体的氨基酸序列包括如下至少一种突变位点：l198p、s96w/i/l/v、m194l、l152g，其中“/”代表“或”。本发明的突变体，能够将结构式（i）所示的酮类化合物为底物，通过立体选择性地还原作用，高效生产对应的手性醇化合物，并且催化活力得到极大的提高，适合推广用于此类手性醇的工业生产。
在一种优选的实施例中，酮还原酶突变体的氨基酸序列还包括如下突变位点之一：q24l、v34m、i35v、a72v、l80r、t94s、y95f、v99t、s101n、l104s、i143v、i147v、a153t、y178c、v185i、y189f/w、i190t、p193h、v195i、t199i、e201g/d/h、d202a、a203g/s、r206q、d234v、237e及t240i；或者酮还原酶突变体具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有80%以上，优选为85%以上，更优选为90%以上，进一步优选为95%以上同一性的氨基酸序列。上述酮还原酶突变体可以进一步提高酶的催化活力及对底物的立体选择性。
在一种更优选的实施例中，酮还原酶突变体的氨基酸序列具有如下任一组合的突变位点：s96w+l198p、s96l+l198p、s96w+m194l+l198p、s96w+y189f+l198p、s96w+l198p+e201d、s96w+i143v+m194l+l198p+r206q、s96w+i143v+m194l+l198p+e201d+r206q、s96w+i143v+i190t+m194l+l198p+e201d+r206q、t94s+s96w+m194l+l198p、s96w+m194l+l198p+e201g、t94s+s96i+m194l+l198p、t94s+s96w+i143v+i190t+m194l+l198p+e201d+r206q、s96w+i143v+i190t+m194l+l198p+e201g+r206q、t94s+s96w+i143v+i190t+m194l+l198p+e201g+r206q、t94s+y95f+s96w+i143v+i190t+m194l+l198p+e201d+r206q、t94s+y95f+s96w+i143v+i190t+m194l+l198p+e201g+r206q、s96w+i143v+i190t+m194l+v195i+l198p+e201d+r206q、s96w+i147v+m194l+l198p、s96w+a153t+m194l+l198p、q24l+a72v+s101n+s96w+m194l+l198p、s96w+i190t+m194l+l198p+d234v、s96w+m194l+l198p+k237e、s96w+p193h+m194l+l198p、v34m+s96w+m194l+l198p、s96w+m194l+l198p+e201h、l80r+s96w+m194l+l198p、s96w+m194l+l198p+d234v、s96w+i143v+i190t+m194l+l198p+t199i+e201d+r206q、s96w+v99t+i143v+i190t+m194l+l198p+e201d+r206q、s96w+l104s+i143v+i190t+m194l+l198p+e201d+r206q、t94s+y95f+s96w+i143v+i190t+m194l+v195i+l198p+e201g+r206q、t94s+y95f+s96w+i143v+i190t+m194l+v195i+l198p+e201d+r206q、i35v+t94s+y95f+s96w+i143v+i190t+m194l+l198p+e201g+r206q、t94s+y95f+s96w+i143v+v185i+i190t+m194l+l198p+e201g+r206q、t94s+y95f+s96w+i143v+i190t+m194l+l198p+e201g+r206q+t240i、t94s+y95f+s96w+i143v+y178c+i190t+m194l+v195i+l198p+e201d+r206q、t94s+y95f+s96w+i143v+i190t+m194l+v195i+l198p+e201d+a203g+r206q、s96w+m194l+i143v+r206q+i190t+e201d+t94s+y95f+v195i+l198p+a203s、t94s+y95f+s96w+i143v+y189w+i190t+m194l+l198p+e201g+r206q、t94s+y95f+s96w+m194l+l198p+i143v+r206q+i190t+e201d+d201g+v195i+y189w、t94s+y95f+s96w+i143v+y189w+i190t+m194l+v195i+l198p+e201d+r206q、t94s+y95f+s96w+i143v+y178c+y189w+i190t+m194l+v195i+l198p+e201d+r206q、t94s+y95f+s96w+i143v+y189w+i190t+m194l+v195i+l198p+e201d+a203g+r206q、t94s+y95f+s96w+i143v+r206q+y189w+i190t+m194l+v195i+l198p+e201d+a203s、t94s+y95f+s96w+i143v+y178c+i190t+m194l+v195i+l198p+e201d+d202a+a203g+r206q、t94s+y95f+s96w+i143v+y178c+y189w+i190t+m194l+v195i+l198p+e201d+d202a+a203g+r206q。
在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种dna分子，该dna分子编码上述任一种酮还原酶突变体。该dna分子编码的上述酮还原酶对结构式（i）所示的酮类底物具有很好的催化活力和立体选择性。
本发明的上述dna分子还可以以“表达盒”的形式存在。“表达盒”是指线性或环状的核酸分子，涵盖了能够指导特定核苷酸序列在恰当宿主细胞中表达的dna和rna序列。一般而言，包括与目标核苷酸有效连接的启动子，其任选的是与终止信号和/或其他调控元件有效连接的。表达盒还可以包括核苷酸序列正确翻译所需的序列。编码区通常编码目标蛋白，但在正义或反义方向也编码目标功能rna，例如反义rna或非翻译的rna。包含目标多核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指至少一个其组分与其至少一个其他组分是异源的。表达盒还可以是天然存在的，但以用于异源表达的有效重组形成获得的。
在本申请第三种典型的实施方式中，提供一种重组质粒，该重组质粒含有上述任一种dna分子。上述重组质粒中的dna分子置于重组质粒的适当位置，使得上述dna分子能够正确地、顺利地复制、转录或表达。
虽然本发明在限定上述dna分子时所用限定语为“含有”，但其并不意味着可以在dna序列的两端任意加入与其功能不相关的其他序列。本领域技术人员知晓，为了满足重组操作的要求，需要在dna序列的两端添加合适的限制性内切酶的酶切位点，或者额外增加启动密码子、终止密码子等，因此，如果用封闭式的表述来限定将不能真实地覆盖这些情形。
本发明中所使用的术语“质粒”包括双链或单链线状或环状形式的任何质粒、粘粒、噬菌体或农杆菌二元核酸分子，优选为重组表达质粒，可以是原核表达质粒也可以是真核表达质粒，但优选原核表达质粒，在某些实施方案中，重组质粒选自pet-22a（+）、pet-22b（+）、pet-3a（+）、pet-3d（+）、pet-11a（+）、pet-12a（+）、pet-14b（+）、pet-15b（+）、pet-16b（+）、pet-17b（+）、pet-19b（+）、pet-20b（+）、pet-21a（+）、pet-23a（+）、pet-23b（+）、pet-24a（+）、pet-25b（+）、pet-26b（+）、pet-27b（+）、pet-28a（+）、pet-29a（+）、pet-30a（+）、pet-31b（+）、pet-32a（+）、pet-35b（+）、pet-38b（+）、pet-39b（+）、pet-40b（+）、pet-41a（+）、pet-41b（+）、pet-42a（+）、pet-43a（+）、pet-43b（+）、pet-44a（+）、pet-49b（+）、pqe2、pqe9、pqe30、pqe31、pqe32、pqe40、pqe70、pqe80、prset-a、prset-b、prset-c、pgex-5x-1、pgex-6p-1、pgex-6p-2、pbv220、pbv221、pbv222、ptrc99a、ptwin1、pezz18、pkk232-18、puc-18或puc-19。更优选，上述重组质粒是pet-22b（+）。
在本申请第四种典型的实施方式中，提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述任一种重组质粒。适用于本发明的宿主细胞包括但不仅限于原核细胞、酵母或真核细胞。优选原核细胞为真细菌，例如革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。更优选原核细胞为大肠杆菌bl21细胞或大肠杆菌dh5α感受态细胞。
在本申请第五种典型的实施方式中，提供一种生产手性醇的方法。该方法包括采用上述任一种酮还原酶突变体对前述结构式（i）所示的手性酮类化合物进行还原反应生产手性醇的步骤。由于本发明的上述酮还原酶突变体对结构式（i）所示的手性酮类化合物具有很好的催化活力剂立体选择性，因而利用本发明的酮还原酶突变体制备的手性醇能够提高反应速率，提高底物浓度，减少酶用量，降低后处理的难度。
式（i）
其中，n为0、1、2或3；r1选自：h、oh、取代或未取代的c1-10的烷基、取代或未取代的c3-6的环烷基、取代或未取代的c6-12的芳基、取代或未取代的c3-6的杂环基；或，r1为苯环与所连接的杂环一起形成稠环体系。
在一些优选的实施例中，式（i）所示的手性酮类化合物为
在一些优选的实施例中，酮还原酶突变体与手性酮类化合物的质量比为0.1~10：1。采用该质量比进行手性醇类化合物的生产，由于酶催化活力和立体选择性高，因而酶用量少、底物转化率高且后续产物分离容易，从而生产效率高。
在一些优选的实施例中，还原反应的体系中酮类化合物的浓度为1g/l~100g/l。采用该底物浓度进行手性醇类化合物的生产，由于酶催化活力和立体选择性高，因而在单位质量的酶能够催化浓度相对较高的底物转化为手性醇产物，从而生产效率高。
在一些优选的实施例中，在20~45℃下进行还原反应。本申请的还原酶突变体能够在相对的室温条件下进行底物的催化还原反应，降低了生产条件，更有助提高生产效率。
以上阐述的还原反应一般需要辅因子，其通常为nadh或nadph，并且该还原反应可包括用于再生该辅因子的系统，例如d-葡萄糖、辅酶nad+和葡萄糖脱氢酶gdh；甲酸根化合物、辅酶nad+和甲酸根脱氢酶fdh；或异丙醇、辅酶nad+和醇脱氢酶adh。在使用纯化的酮还原酶的一些实施方式中，此类辅因子和任选地此类辅因子再生系统，通常将与底物和酮还原酶一起添加到反应介质中。与酮还原酶类似，包含辅因子再生系统的任何酶可以是此类细胞的提取物或溶解产物形式，或作为纯化的酶加入反应混合物中。在使用细胞提取物或细胞溶解产物的实施方案中，用于产生提取物或溶解产物的细胞可以是表达仅含有辅因子再生系统或含有辅因子再生系统和酮还原酶的酶。在使用全细胞的实施方案中，该细胞可以使表达含有辅因子再生系统和酮还原酶的酶。
不论用全细胞、细胞提取物或纯化的酮还原酶，可使用单一酮还原酶，或可选地，可使用两种或更多种酮还原酶的混合物。
采用酮还原酶对手性酮类化合物进行还原反应生产手性醇的反应体系中还包括辅酶、辅酶再生体系和缓冲液。其中，缓冲液通常为磷酸盐缓冲液，根据实际情况也可以是tris-盐酸缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲。
下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。
需要说明的是，下列实施例中的pb代表磷酸缓冲液。
实施例1：
250ml反应瓶中，称取原料500mg，加入16.75ml的异丙醇，加入12.5mlaccr出发酶的粗酶液（2.5g突变体湿细胞重悬于0.1mpb7.0中，总体积12.5ml，经超声破碎制得质量体积含量为20%粗酶液，ph=7.0），加入100mmpb7.0使体系终体积为25ml，于30℃恒温搅拌16h，体系于12000rpm离心5min后，取样200ul加入2ml乙腈溶解，于12000rpm离心5min后送hplc检测产品手性值。
结果有40%的底物转化为产品，但产品手性纯度较低，选择性仅为39%。可见accr出发酶具有一定的催化能力，但选择性不好，手性目标产品含量较低。由于同分异构体不能通过常规方法分离，因此accr出发酶在生产目标手性醇上不能应用。
实施例2：
100ml反应瓶中，称取原料500mg，加入6.7ml的异丙醇，加入0.5mlaccr出发酶的粗酶液（0.1g湿细胞经超声破碎制得20%粗酶液，ph=7.0），加入100mmpb7.0使体系终体积为10ml，与30℃恒温搅拌16h，体系与12000rpm离心5min后，取样200ul加入2ml乙腈溶解，于12000rpm离心5min后送hplc检测产品转化率和ee值。
100ml反应瓶中，称取原料500mg，加入6.7ml的异丙醇，加入0.5mlaccr突变体的粗酶液（0.1g突变体湿细胞经超声破碎制得20%粗酶液，ph=7.0），加入100mmpb7.0使体系终体积为10ml，与30℃恒温搅拌16h，体系与12000rpm离心5min后，取样200ul加入2ml乙腈溶解，于12000rpm离心5min后送hplc检测产品转化率和ee值。
结果如表5所示，将酶量（即0.1g菌体湿细胞）进一步降低至底物质量(500mg)的五分之一，将反应的体积进一步缩小到10ml，挑选accr出发酶和部分突变体（由于突变体较多只挑选了部分）进行验证，结果accr出发酶基本无活力，同时选择性不高，目标手性醇仅占37%，而改造后的突变体不仅在选择性上表现出极高的优势，最优菌选择性达到99%，同时活力极大幅度的提高，基本转化完全。因此改造后的突变体出现了极大的催化特性的改变，获得了极高的活力和选择性。
表5：
上表中，选择性上：*表示选择性5%~40%；***表示选择性40%~90%；****表示选择性90%~95%；*****表示选择性95%~100%；
活力上：*表示转化率小于10%；****表示转化率10%~70%；*****表示转化率80%~90%；******表示转化率90%~100%。
实施例3：
250ml反应瓶中，称取原料500mg，加入5ml的异丙醇，加入12.5mlaccr出发酶的粗酶液（2.5g突变体湿细胞经超声破碎制得20%粗酶液，ph=7.0），加入100mmpb7.0使体系终体积为25ml，与30℃恒温搅拌16h，体系与12000rpm离心5min后，取样200ul加入2ml乙腈溶解，于12000rpm离心5min后送hplc检测产品手性值。
250ml反应瓶中，称取原料500mg，加入5ml的异丙醇，加入12.5mlaccr突变体的粗酶液（2.5g突变体湿细胞经超声破碎制得20%粗酶液，ph=7.0），加入100mmpb7.0使体系终体积为25ml，与30℃恒温搅拌16h，体系与12000rpm离心5min后，取样200ul加入2ml乙腈溶解，于12000rpm离心5min后送hplc检测产品手性值。
结果如表6所示，可见与accr出发酶相比，改造后的突变体选择性极大幅度的提高，获得了意想不到的效果。
表6：
上表中，*表示选择性50~80%；**表示选择性80%~90%；***表示选择性90%~100%。
实施例4
250ml反应瓶中，称取原料500mg，加入5ml的异丙醇，加入12.5mlaccr出发酶的粗酶液（2.5g突变体湿细胞经超声破碎制得20%粗酶液，ph=7.0），加入100mmpb7.0使体系终体积为25ml，与30℃恒温搅拌16h，体系与12000rpm离心5min后，取样200ul加入2ml乙腈溶解，于12000rpm离心5min后送hplc检测产品手性值。
250ml反应瓶中，称取原料500mg，加入5ml的异丙醇，加入12.5mlaccr突变体的粗酶液（2.5g突变体湿细胞经超声破碎制得20%粗酶液，ph=7.0），加入100mmpb7.0使体系终体积为25ml，与30℃恒温搅拌16h，体系与12000rpm离心5min后，取样200ul加入2ml乙腈溶解，于12000rpm离心5min后送hplc检测产品手性值。
结果如表7所示，可见与accr出发酶相比，改造后的突变体选择性极大幅度的提高，获得了意想不到的效果。
表7：
上表中，*表示选择性40~60%；**表示选择性60%~90%；***表示选择性90%~100%。
实施例5
250ml反应瓶中，称取原料500mg，加入16.75ml的异丙醇，加入12.5mlaccr出发酶的粗酶液（2.5g突变体湿细胞重悬于0.1mpb7.0中，总体积12.5ml，经超声破碎制得20%粗酶液，ph=7.0），加入100mmpb7.0使体系终体积为25ml，于30℃恒温搅拌16h，体系于12000rpm离心5min后，取样200ul加入2ml乙腈溶解，于12000rpm离心5min后送hplc检测产品手性值。
250ml反应瓶中，称取原料500mg，加入16.75ml的异丙醇，加入12.5ml突变体酶的粗酶液（2.5g突变体湿细胞重悬于0.1mpb7.0中，总体积12.5ml，经超声破碎制得20%粗酶液，ph=7.0），加入100mmpb7.0使体系终体积为25ml，于30℃恒温搅拌16h，体系于12000rpm离心5min后，取样200ul加入2ml乙腈溶解，于12000rpm离心5min后送hplc检测产品手性值。
结果显示在同一位点进行突变，使用不同种类的氨基酸时，突变体表现出差异极大的选择性和活力。
表8：
上表中，*选择性30~50%；**选择性50~60%；***选择性60~80%。
+转化率0~30%；++转化率30~60%；+++转化率60~80%；++++转化率80~100%；nd未检测到活力。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本申请通过理性设计和随机突变相结合的方法对已有的还原酶突变体的蛋白进行理性改造，并对获得的突变体使用本申请的底物酮进行催化活力和立体选择性筛选，最终获得了高选择性和高活力的突变体菌株，将含有这些突变体的菌株应用于本申请所述的酮类底物的催化还原反应中，能够提高其相应的手性醇类化合物的生产效率。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>凯莱英生命科学技术（天津）有限公司
<120>酮还原酶突变体及其应用
<130>pn126823kly
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>253
<212>prt
<213>酮还原酶(acetobacterpasteurianus)
<400>1
metalaargvalalaglylysvalalailevalserglyalaalaasn
151015
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