一种致病菌检测反应器及其制备和应用方法与流程

本发明涉及致病菌检测技术领域，尤其涉及一种致病菌检测反应器及其制备和检测方法。

背景技术：

据世界卫生组织报道,全球每年发生腹泻病的病例高达1.5亿,其中70％病例与各种致病性微生物污染食品有关，据最新资料显示,微生物是食源性疾病主要病原，大约占将近一半，因此，致病菌快速检测已经直接关系到国家安全、社会经济发展与社会民生。

基于核酸扩增的方法是现有的一种有效而准确的病原体鉴定方法，但是该方法需要繁琐的操作(包括裂解、核酸提取、扩增，甚至测序)，微流控芯片技术是将生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程的技术，将这些步骤都集成在同一微流控芯片中，是目前传染性致病菌防护、卫生防疫检验、食品安全现场快速检测的迫切需求。

但是为了满足上述步骤的集成以及密封性和生物兼容性的需求，现有的病原体检测微流控芯片大多结构比较复杂，尤其不适用于致病菌免提取纯化试剂体系的检测应用，操作繁琐且成本较高。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种致病菌检测反应器及其制备和检测方法，用于解决现有技术中病原体检测微流控芯片结构复杂，尤其不适用于致病菌免提取纯化试剂体系的检测应用，因此操作繁琐和成本较高的问题。

为实现上述目的，本发明提供一种致病菌检测反应器，包括：由两层薄膜密封形成依次竖向排列且连通的裂解区、混合区、以及反应区；

所述裂解区一侧与所述混合区之间通过封装隔离带分隔，另一侧设有进样口；

所述反应区包括至少一个用于预埋内参靶标的第一反应区和至少一个用于预埋测试靶标的第二反应区；

所述第一反应和第二反应均具有包括至少一个反应池的反应件。

进一步的，反应区和混合区之间设有至少一个反应缓冲区，所述反应缓冲区所述反应区和所述混合区连通的管道上均设有控制阀。

进一步的，所述第一反应区和第二反应区分别通过独立的反应缓冲区与所述混合区连通。

进一步的，所述封装隔离带为热压细窄条纹，用于从所述裂解区或所述混合区被挤压后形成至少一个混合通道。

进一步的，所述薄膜为透明柔性高分子材料，所述高分子材料为聚碳酸酯、聚丙烯、聚对苯二甲酸乙二酯或热塑性弹性体材料中的一种。

进一步的，所述用于预埋测试靶标的第二反应区设置两个，且所述第一反应区与各个所述第二反应区并列设置。

进一步的，所述反应区还具有多个冗余液体区；各个所述冗余液体区分别与第一反应区和第二反应区连接；

所述冗余液体区一端与所述反应腔靠近所述反应缓冲区一侧连通。

进一步的，所述反应件包括带有至少一个通孔的结构板；

以及设置在结构板一侧的封闭薄膜层和设置在另一侧的带小孔的薄膜层；

所述通孔与两侧薄膜层形成反应池。

进一步的，所述反应池中预埋有pcr反应的引物、dntp以及反应所需的酶。

为实现上述目的，本发明还提供一种致病菌检测反应器的制备方法，用于制备上述任意一种致病菌检测反应器，包括：采用两层薄膜对位，使裂解区、混合区和反应区连通后密封。

进一步的，所述密封方式采用激光焊接、热压封接、高强度化学胶粘接或超声焊接中的一种或多种方式。

为实现上述目的，本发明还提供一种致病菌检测反应器的应用方法，应用上述任意一种所述的一种致病菌检测反应器，包括以下步骤：

步骤一：将测试样品通过进样口进入到预存细胞裂解液的裂解区，并对所述裂解区进行加热使所述测试样品裂解；

步骤二：挤压突破封装隔离带，使裂解后的测试样品进入混合区并控制测试样品在混合区与裂解区来回流动，测试样品释放核酸分子，获得带有核酸分子的测试样品；

步骤三：将带有核酸分子的测试样品分散进入到第一反应区和第二反应区，使测试样品在反应池中进行反应；

步骤四：检测各个反应池是否存在特定的靶标。

进一步的，所述步骤三中在测试样品在反应池内反应前控制溢出反应池的液体进入冗余液体区。

进一步的，所述步骤三中测试样品在预设温度环境下与反应池中预埋的pcr反应的引物、dntp以及反应所需的酶进行等温扩增或热循环扩增反应。

进一步的，所述步骤四中采用荧光光源激发各个反应池，检测各个所述反应池中的荧光强度，基于各个所述反应池中的荧光强度判断是否存在特定的靶标。

本发明提供的一种致病菌检测反应器及其制备和检测方法，通过上下式设置裂解区、混合区以及的反应区的方式，测试样品进入裂解区完成裂解后直接进入混合区使测试样品充分混合裂解，而后使测试样品在反应区内进行扩增反应，解决了现有技术中病原体检测微流控芯片结构复杂，操作繁琐，成本较高，不适用于致病菌免提取纯化试剂体系的检测应用的问题。

附图说明

图1为本发明所述的一种致病菌检测反应器的实施例一的结构示意图；

图2为本发明的一种致病菌检测反应器的实施例一中的用于体现反应器密封部分的结构示意图；

图3为本发明的一种致病菌检测反应器的检测方法的实施例一中的反应结构板的结构示意图；

图4为本发明的一种致病菌检测反应器的检测方法的实施例三中的流程图；

图5为本发明的一种致病菌检测反应器的检测方法的实施例三中实例的气动控制活塞的结构示意图。

附图标记：

1、裂解区；12、封闭帽；2、混合区；3、反应区；31、反应缓冲区；32、反应区；33、冗余液体区；322、反应池；4、封装隔离带；5、控制阀；61、带小孔的薄膜层；62、结构板；63、封闭薄膜层；a-密封部分。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

应理解，尽管术语“第一”、“第二”等在本文中可以用于描述各种元件，但这些元件不应受这些术语的限制。这些术语仅用于区分一个元件与另一个元件。因此，“第一”元件可以被称为“第二”元件，而不背离本实施方案的教导。

需要说明的是，下面描述中使用的词语“前”、“后”、“左”、“右”、“上”和“下”指的是附图中的方向，词语“底面”和“顶面”、“内”和“外”分别指的是朝向或远离特定部件几何中心的方向。

还需要注意的是，下述实施方式中所述病菌检测反应器主要是用于致病菌免提取纯化试剂体系的检测应用。

实施例一：

本申请提供一种致病菌检测反应器，参考图1和图2，包括：由两层薄膜密封形成依次竖向排列且连通的用于预装裂解液的裂解区、用于获取核酸分子的混合区以及用于进行核酸扩增和检测的反应区；上述裂解区、混合区和反应均由上而下依次排列。

在上述实施方式中，所述反应器整体上采用的是上下分布的反应腔式结构，在所述反应器的上方，设置了用于样品裂解的区域，在所述反应器的中部，设置了用于样品混合的区域，在所述反应器的下方，设置了用于样品反应的区域，这样的上下结构设计，使得能同时利用外部控制力量和重力作用同时来控制内部的流体流动，让流动过程更有效和快捷，减小每一过程中液体损失，同时操作时可以借助气动控制活塞，对每个区域进行挤压操作，进而控制在每个区域的样品停留时间，相较于现有技术中结构更简单，更容易实现，反应效果更好，同时，竖向排列还可以节省单个反应器的面积，可以在测试过程中同时放置多个相同的检测结构，实现多个样本的同时检测。

所述裂解区一侧与所述混合区之间通过封装隔离带分隔，另一侧设有带有封闭帽的进样口；在一个优选的实施方式中，所述封装隔离带为热压细窄条纹，用于从所述裂解区或所述混合区被挤压后形成至少一个混合通道，弯曲的热压细窄条纹可以作为反应器中试剂预存的隔离带或者两个不同反应部分的隔离带，在反应需要时可借助气动控制活塞，通过挤压将隔离带挤破形成多个混合通道，连通两个物理隔离的两个区域，这样的结构可以作为试剂预存区域的隔离开关，制作与操作简易方便，可以有效地提升反应器中试剂预埋的空间效率。

所述反应区包括一个用于预埋内存靶标的第一反应区和至少一个用于预埋测试靶标的第二反应区，预埋多个测试靶标可以预埋同一种测试靶标，也可以预埋多种不同的测试靶标。所述第一反应区和第二反应区均具有包括至少一个反应池的反应件，在本具体实施方式中，设置一个第一反应区和两个第二反应区，所述用于预埋测试靶标的第二反应区设置两个，且所述第一反应区与各个所述第二反应区并列设置，设置三个反应缓冲区可作为不同检测靶标的独立反应区，并在使用过程中配合气动控制活塞，可以使各个靶标的反应过程相互独立，避免不同靶标之间的相互污染和干扰，在本具体实施方式中，第一反应区与两个第二反应区并列设置，有效提高芯片空间利用率。

在上述实施方式中，如图3所示，所述反应件包括带有至少一个通孔的结构板；以及设置在结构板一侧的封闭薄膜层和设置在另一侧的带小孔的薄膜层，所述通孔与两侧薄膜层形成反应池；在本实施方式中，每一结构板上设有三个反应池，所述反应池中预埋有pcr反应的引物、dntp以及反应所需的酶，用于在液体进入反应池后辅助从测试样品中提取出的核酸分子进行扩增反应，上述设置方式可以提供三个相同大小的反应腔室，并保证相同的靶标检测反应可同时重复3次，作为检测结果的准确性提供有力的保证，减少由于偶然性导致测试结果不准确的情况。

在一个优选的实施方式中，所述反应区和所述混合区之间设有反应缓冲区，设置反应缓冲区的目的主要是控制液体从混合区进入第一反应区或第二反应区的速度，减少由于竖向设置，在重力作用辅助下大量液体直接涌入第一反应区或第二反应区造成第一反应区或第二反应区内液体较多而影响反应过程，甚至对薄膜造成损坏的情况，第一所述反应缓冲区与所述反应区和所述混合区连通的管道上均设有控制阀，在反应过程中，通过控制阀、隔离部辅助气动控制活塞实现液体流向的控制；所述第一反应区和第二反应区分别通过独立的反应缓冲区与所述混合区连通。

在一个优选的实施方式中，所述反应区还具有多个冗余液体区；各个所述冗余液体区分别与第一反应区和第二反应区连接；所述冗余液体区一端与所述反应腔靠近所述反应缓冲区一侧连通，在本实施方式中，所述冗余液体区一端与所述第一反应区或第二反应区靠近所述反应缓冲区一侧连通，另一端弯曲延伸至所述第一反应区或第二反应底部外侧，各个冗余液体区呈反向“l”形设置，冗余液体区用于使进入反应腔后多余的液体进入冗余液体区，减少多余液体对扩增反应过程的影响。

通过上述设置方式，各个第一反应区或第二反应区及各自对应的反应缓冲和冗余液体区，三个区域之间组成一个独立的反应空间，每一独立的反应空间均用于预埋不同的靶标(内参靶标或测试靶标)，进一步有利于各个靶标的独立测试，减少测试过程中的相互干扰，提高测试结果的准确性。

在一个优选的实施方式中，所述薄膜为透明柔性高分子材料，所述高分子材料为聚碳酸酯、聚丙烯、聚对苯二甲酸乙二酯或热塑性弹性体材料中的一种，柔性材料主要是便于在使用过程中通过在裂解区、混合区或反应区施加压力控制液体流向，示例性地气动压力，使样品和试剂混合液在各个通道内流动，透明材料则可便于操作人员清晰观察液体流向以便更好的控制反应过程。采用上述材料制备薄膜反应器，温控效率高，核酸扩增芯片由于涉及温度循环，降低芯片内试剂与仪器温控模块的温度差，在裂解及扩增过程中能够较好的控制温度；同时生物兼容性好，核酸扩增反应过程中使用的生物试剂通常包括引物、酶等成分，芯片材质需要兼容这些成分，以确保扩增效率；除此之外，密封性较好，相较于现有技术中常见的板式具有一定的柔性，减少反应过程由于外界作用造成的损坏。

在本申请所述的致病菌检测反应器，通过上下式设置裂解区、混合区以及的反应区的方式，测试样品进入裂解区完成裂解后直接进入混合区使测试样品充分混合裂解，而后使测试样品通过反应缓冲区进入到第一反应区或第二反应区进行扩增反应，既能提高芯片的空间利用率又有利于控制测试样品的反应过程，解决了现有技术中病原体检测微流控芯片结构复杂，尤其不适用于致病菌免提取纯化试剂体系的检测应用，因此操作繁琐和成本较高的问题，通过上述简单设计的反应器，通过预埋在反应区的检测靶标实现致病菌检测，操作方便，后续制备工艺也较简单。

实施例二：

本申请提供一种致病菌检测反应器的制备方法，用于制备上述实施例一中任意一种致病菌检测反应器，包括以下步骤：采用两层薄膜对位，使裂解区、混合区和反应区连通后密封(所述密封部分可参考图2)。

在上述实施方式中，采用薄膜预留各个区并在对位后直接进行密封，可直接一体密压而成，相比于现有技术中常见的注塑加工的结构来说，结构和加工过程均比较简单，因而也能大大降低加工成本。

在一个较优的实施方式中，所述密封方式采用激光焊接、热压封接、高强度化学胶粘接或超声焊接中的一种或多种方式，可以根据实际生产情况采用一种或多种方式组合加工，除上述加工方式外，现有技术中其他可实现薄膜密封的方式能够实现反应器的使用也可用于此。

实施例三：

本申请提供一种应用致病菌检测反应器的检测方法，参考图4，应用实施例一种所述的致病菌检测反应器，可以与控制设备配合使用，包括以下步骤：

步骤一：将测试样品通过进样口进入到预存细胞裂解液的裂解区，并对所述裂解区进行加热使所述测试样品裂解；

在上述实施方式中，作为举例的，测试样品进入裂解区可以采用配套的注射器具的方式，由于薄膜厚度较低，因此对裂解区进行加热时较方便进行温度控制。

步骤二：挤压突破封装隔离带，使裂解后的测试样品进入混合区并控制测试样品在混合区与裂解区来回流动，测试样品释放核酸分子，获得带有核酸分子的测试样品。

具体的，挤压突破封装隔离带以及使裂解后的测试样品进入混合区并挤压时测试样品在混合区与裂解区来回流动可以采用气动活塞实现，给与裂解区和混合区一定的压力控制液体流向。

步骤三：打开控制阀，使带有核酸分子的测试样品分散进入到第一反应区或第二反应区，待第一反应区和第二反应区中的测试样品充满时关闭控制阀，并使测试样品在反应池内进行反应。

具体的，反应池中预埋有pcr反应的引物、dntp(deoxy-ribonucleosidetriphosphate(脱氧核糖核苷三磷酸))以及反应所需的酶，以便于满足在反应池中完成核酸扩增的反应条件。测试样品在预设温度环境下与反应池中预埋的pcr反应的引物、dntp以及反应所需的酶进行等温扩增或热循环扩增反应，所述步骤三中在关闭控制阀后还会挤压第一反应区或第二反应区，使溢出各个反应池的样品进入冗余液体区，以减少多余液体沉积在反应区对于核酸扩增过程产生影响进而影响后续检测结果的准确性。

步骤四：等待反应结束，检测各个反应池中是否存在特定的靶标。

在上述实施方式中，采用荧光光源激发并检测各个反应池中的荧光强度，根据荧光强度判断是否存在特定的靶标。作为举例而非限定的，荧光光源激发可采用配套的检测仪器实现，也可采用现有技术中其他激发方式实现，通过设定荧光强度阈值，以及检测每个反应池中的荧光强度值来判断是否存在特定的靶标这样的设置，可以提高检测结果的准确性，除了荧光激发外，现有技术中其他检测方式也适用于此。

具体以检测使用致病菌为例，参考图1和图5，具体包括以下步骤：

在裂解腔中预埋裂解液，在反应池中预埋有pcr反应的引物、dntp(deoxy-ribonucleosidetriphosphate(脱氧核糖核苷三磷酸))以及反应所需的酶；检测的内参可选择预埋酵母或者噬菌体，预埋检测靶标可以为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌o157、李斯特菌、弯曲杆菌、沙门氏菌中一种或多种，假设每一反应腔上均有气动活塞控制挤压或被挤压。

需要说明的是，下述具体步骤中，裂解区1上对应设置有气动控制活塞11，混合区2上对应设置有气动控制活塞21；反应缓冲区31上对应设置有气动活塞311；反应区32上对应设置有气动活塞321；以上打开各个反应部分上对应设置的气动活塞均可给予各个反应腔压力，关闭则撤去施加的压力。

测试样品通过进样口，注入到薄膜反应器的裂解区中，样品进入样品裂解区1，样品裂解区1中预存致病菌或细胞的裂解液，通过加热混合使样品充分裂解，通过气动活塞11突破热压细窄条纹的密封隔离，将裂解的样品从样品裂解区1挤压进入样品混合区2，通过气动控制活塞11和气动控制活塞21将裂解的样品在样品裂解区域1和样品混合区域2来回挤压混合使得样品充分裂解，释放出核酸分子，样品充分混合后，通过气动控制活11控制活塞21，将裂解的样品留在混合区2，打开混合区2到反应缓冲区31之间的控制阀，带有核酸分子的样品分散挤入到反应缓冲区31中，待各个反应缓冲区31中样品液体充满时，关闭混合区2到反应缓冲区31之间的控制阀并打开缓冲区31和反应区32(包括第一反应区和两个第二反应区，图中未具体示出)之间的控制阀，再打开气动控制活塞21，结合气动控制活塞311，分别将反应缓冲区31中的样品挤压入反应池322，当样品进入反应池322后，关闭缓冲区31和反应腔32之间的控制阀，打开气动控制活塞321，将冗余的液体分别挤入第一反应区或第二反应区各自对应的冗余液体区33，然后在反应池322中进行等温扩增或者热循环，等待反应结束，通过荧光光源激发并检测各个反应池322中反应池中的荧光强度，每一反应板中反应池322都具有相同的靶标，反应池322内通过荧光光源激发后，检测每个孔中的荧光强度值来判断是否存在相应的靶标。

上述本发明实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。