一种具有抗炎活性的鲨鱼复合短肽及制备方法与应用与流程

本发明涉及海洋生物技术领域，尤其是涉及一种具有抗炎活性的鲨鱼复合短肽及制备方法与应用。

背景技术：

海洋物种中丰富的蛋白质蕴藏着宝贵的生物活性肽资源。近年来，科研人员从多种生物中提取混合多肽治疗炎症，替代传统的完整生物体入药。有研究表明鹿茸多肽能够对nih3t3细胞产生抗炎作用并且是由其中多种肽共同作用的结果(高冷,王昊天,牛晓晖,等.鹿茸多肽蛋白的提取及功能研究[j].吉林中医药,2018,38(7):825-828)。海洋中鲨鱼的软骨含免疫活性因子，从中提取的鲨鱼软骨素也证实具有一定的抗炎活性(雷呈祥，彭武林，马丽.鲨鱼软骨活性物质的研究现状[j].海军医学杂志，2007，28(3):279-281)。传统中医药认为鲨鱼肉具有味甘，开胃进食、健脾益气、抗疲劳等功效，然而其是否具有抗炎功效鲜见报道。在鲨鱼的传统加工过程中，主要获取的是商业价值较高的鲨鱼翅、肝脏以及软骨，而鱼皮与鱼肉往往未得到有效利用，造成资源浪费。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术存在的上述问题，为了充分开发利用海洋生物资源，提供一种具有抗炎活性的鲨鱼复合短肽及制备方法与应用。

所述具有抗炎活性的鲨鱼复合短肽的制备方法，包括以下步骤：

1)将新鲜或冻存解冻后去骨的鲨鱼，剪成小块，用醇类溶液去除脂肪，反复漂洗至无味，沥干；

2)用纯水浴浸烫处理步骤1)得到的鲨鱼块；

3)冷却至室温后进行匀浆处理，用蛋白酶酶解得到酶解液，加热终止反应；

4)将所述酶解液进行粗过滤，离心处理，取上清液过滤，将滤液除去溶剂，灭菌干燥，即得到鲨鱼复合短肽。

在步骤1)中，所述鲨鱼原料为鲨鱼的鱼皮或鱼肉，所述鲨鱼可选择灰星鲨(mustelusgriseus)，条纹斑竹鲨(chiloscylliumplagiosum)或大青鲨(prionaceglauca)中的一种；所述剪成小块可剪为约1cm³的小块；所述醇类溶液可选自乙醇水溶液、异丙醇水溶液、正丁醇等中的至少一种；所述醇类溶液的浓度可为10％～20％wt；所述去除脂肪的具体方法可为：用10～20倍体积/重量的醇类溶液浸泡10h，间隔8～12h换液一次；优选以l/kg计，醇类溶液的用量为鲨鱼块湿重的10倍体积；所述反复漂洗可倒入150目不锈钢筛网用水反复漂洗；所述水可采用二级反渗透纯水，对鲨鱼复合短肽的制备而言，超纯水洁净无杂质，除盐效果更好。

在步骤2)中，所述用纯水浴浸烫处理步骤1)得到的鲨鱼块，以l/kg计，纯水的用量为鲨鱼块湿重的10～15倍体积，浸烫处理的温度可为90～95℃，采取设定常压升温，搅拌转速设定为30rpm，顺时针搅拌5min，逆时针搅拌5min交替进行，处理时间20～30min；纯水浴浸烫处理使鲨鱼组织蛋白受热均匀而变性，利于后续酶解反应的进行。

在步骤3)中，所述蛋白酶可选自酸性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胶原酶、无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶与菠萝蛋白酶等中的至少一种，蛋白酶优选木瓜蛋白酶；蛋白酶加入量按重量为鲨鱼组织湿重的1～6％，优选为3±0.5％；所述蛋白酶酶解的条件可为：ph5.5±1.5，温度53±2.0℃，酶解时间3.5±0.5h；所述加热终止反应的具体条件可为：升温至90～95℃，保持10～20min，以终止反应。

在步骤4)中，所述粗过滤可采用300目筛网与棉纱布过滤；所述离心的速度可为8000～10000rpm，离心的时间可为10～20min；所述干燥可采用冷冻干燥或离心喷雾干燥。

所述鲨鱼复合短肽具有抗炎活性，可作为配料在制备功能性食品和特殊医学用途配方食品中的应用。

所述鲨鱼复合短肽，经体外及体内测试，显示具有显著的抗炎保肝护肾等生物学活性。

鲨鱼皮与鲨鱼肉含有丰富的蛋白，通过工艺技术改进，以现代酶解技术方法处理，控制温和的反应过程条件，获得优质的具有营养价值及生物活性的复合短肽，进一步提升了生物资源的附加值及有效利用。

本发明具有抗炎活性的鲨鱼复合短肽的制备方法，简化了以往处理原材料的复杂工序，获得了抗炎功效良好的优质复合短肽，达到了可工业规模化，成本效益化生产的目的。

本发明具有抗炎活性的鲨鱼复合短肽的制备方法所获得的短肽种类丰富，综合抗炎效果显著，扩展了复合短肽的在功能食品及医学配方食品的研究与应用。

经过实验研究表明，本申请制备的鲨鱼复合短肽，能适度提升巨噬细胞raw264.7的活力，且其活性的升高，在一定范围内呈现与时间和浓度成正相关，这提示本发明鲨鱼复合短肽可能通过提升巨噬细胞的吞噬作用提升机体抗炎能力。

经过进一步动物模型研究表明，在小鼠抗炎实验中，通过本申请制备的鲨鱼复合短肽灌胃小鼠15天，并注射细菌脂多糖lps诱导急性炎症后，发现本申请制备的鲨鱼复合短肽能显著抑制小鼠肝功能指标的急性炎性上升；显著抑制肾功能指标中肌酐的急性炎性上升；综合来看具有与经典抗炎药阿司匹林相当的抗炎效果，且没有明显副作用。研究结果表明，服用本申请制备的鲨鱼复合短肽，具有良好的抗炎活性，避免炎症造成的组织器官功能损伤，有助于调理免疫系统，有望开发为新型的抗炎功能食品配料。

本发明为充分开发利用海洋生物资源，以鲨鱼皮鱼肉作为原材料，提取一种具有抗炎活性的鲨鱼复合短肽，经细胞学及动物实验测试，发现其除了具有较高的蛋白营养价值之外，还具有抗炎保肝护肾等生物学活性，有望进一步开发为一种新型的抗炎功能食品配料。

附图说明

图1为本发明实施例制备的鲨鱼复合短肽在体外促进巨噬细胞raw264.7的活力提升结果柱形图。

图2为本发明实施例制备的鲨鱼复合短肽缓解细菌内毒素引起的小鼠急性肝肾功能损伤检测结果柱形图。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

实施例1

将冻存解冻后去骨的条纹斑竹鲨剪成约1cm³小块，用鲨鱼块湿重的15倍体积的正丁醇水溶液(浓度为10％wt)去除脂肪，缓慢搅拌30rpm12h，中间换一次醇溶液。然后倒入150目不锈钢筛网用水反复漂洗至无味，沥干。用鲨鱼块湿重的15倍体积的纯水于95℃浴浸烫处理20min，冷却后进行匀浆处理。用木瓜蛋白酶酶解得到酶解液，酶解条件为：ph5.0,温度55℃,酶解时间3h，酶量为3％。之后升温至90℃保持20min，以终止反应。反应液用300目筛网与棉纱布过滤，滤液进行8000rpm离心20min，然后冻干以得到鲨鱼复合短肽(命名简称为：scp)，并在-20℃下保存直至使用。

实施例2

将冻存解冻后去骨的灰星鲨剪成约1cm³小块，用鲨鱼块湿重的10倍体积的异丙醇水溶液(浓度为15％wt)去除脂肪，缓慢搅拌30rpm12h，中间换一次异丙醇水溶液。然后倒入150目不锈钢筛网用水反复漂洗至无味，沥干。用鲨鱼块湿重的15倍体积的纯水于95℃浴浸烫处理20min，冷却后进行匀浆处理。用菠萝蛋白酶酶解得到酶解液，酶解条件为:ph5.0,温度52℃,酶解时间4h，酶量4％。之后升温至90℃保持20min，以终止反应。反应液用300目筛网与棉纱布过滤，滤液进行8000rpm离心20min，然后冻干以得到鲨鱼复合短肽(命名简称为：scp)，并在-20℃下保存直至使用。

实施例3

取新鲜去骨的条纹斑竹鲨鱼剪成约1cm³小块，用鲨鱼块湿重的15倍体积的正丁醇水溶液(浓度为10％wt)去除脂肪，缓慢搅拌30rpm12h，中间换一次醇溶液。然后倒入150目不锈钢筛网用水反复漂洗至无味，沥干。用鲨鱼块湿重的15倍体积的纯水于95℃浴浸烫处理20min，冷却后进行匀浆处理。用枯草杆菌蛋白酶与胶原酶酶解得到酶解液，酶解条件为：ph5.0,温度55℃,酶解时间3h，酶量为枯草杆菌蛋白酶4％，胶原酶1％。之后升温至95℃保持10min，以终止反应。反应液用300目筛网与棉纱布过滤，滤液进行8000rpm离心20min，然后冻干以得到鲨鱼复合短肽(命名简称为：scp)，并在-20℃下保存直至使用。

实施例4

取新鲜去骨的大青鲨鱼剪成约1cm³小块，用鲨鱼块湿重的15倍体积的乙醇水溶液(浓度为10％wt)去除脂肪，缓慢搅拌30rpm12h，中间换一次醇溶液。然后倒入150目不锈钢筛网用水反复漂洗至无味，沥干。用鲨鱼块湿重的15倍体积的纯水于90℃浴浸烫处理15min，冷却后进行匀浆处理。用酸性蛋白酶与无花果蛋白酶酶解得到酶解液，酶解条件为：ph4.5,温度52℃,酶解时间3.5h，酶量为酸性蛋白酶3％，无花果蛋白酶3％。之后升温至95℃保持10min，以终止反应。反应液用300目筛网与棉纱布过滤，滤液进行10000rpm离心10min，然后喷雾干燥以得到鲨鱼复合短肽(命名简称为：scp)，并在-20℃下保存直至使用。

实施例5

采用常规的细胞培养方法培养鼠单核巨噬细胞raw264.7(购自中国科学院上海细胞库)，即用含10％fbs和1％双抗的dmem高糖型培养基培养，培养条件为37℃的5％co2培养箱，每2天更换培养基，3天传代一次。消化收集指数生长期的raw264.7细胞，用培养基稀释至1×10⁵个/ml的细胞数目，铺板于96孔板内，各孔添加细胞悬液0.1ml，每组设置5个重复，放进培养箱中等待其完全贴壁，而后对照组添加100μl培养基，剂量组加入100μl含鲨鱼复合短肽scp的培养基溶液，使各浓度组scp终浓度分别达到0.1、0.625、1.25、2.5和5.0mg/ml，空白组设置为只含有200μl培养基。scp处理24h和48h后，每孔加入20μl5mg/mlmtt，继续孵育4h，吸去培养基，每孔加入150μl二甲基亚砜，置于酶标仪内振荡3min，检测490nm下吸光度(od值)。结果如图1所示，巨噬细胞raw264.7的活力提升，与具有抗炎活性的鲨鱼复合短肽的处理时间和浓度成正相关；实验结果均表示为平均值±标准差(sd)，采用单向方差分析，显着性差异设置为*p<0.05，**p<0.01。从图1可以看出，本发明所述鲨鱼复合短肽(scp)可能通过提升巨噬细胞的吞噬作用提升机体抗炎能力。

实施例6

取适量鲨鱼复合短肽(scp)，完全溶解在0.9％nacl注射液内，配制成50mg/ml浓度，每次适量配制，现配现用。设计5组小鼠，记为ctr对照组、scp组、lps组、lps+scp组和lps+asa组，将50只健康的雄性km鼠随机按每组10只分配进这5个组内。各组处理方案如下：

1、对照组(ctr)：生理盐水灌胃，单次使用量为20ml/kg(体重)，连续进行15d。

2、scp组：50mg/mlscp灌胃，单次使用量为20ml/kg(体重)，根据浓度换算也即1g/kg(体重)，连续灌胃15d。

3、lps组：同对照组，连续执行15d，不同之处是在第15d的8:00pm给小鼠腹腔注射1mg/kg(体重)细菌脂多糖(lps)。

4、lps+scp组：同scp组灌胃，连续灌胃15d，第15d的8:00pm给小鼠腹腔注射1mg/kg(体重)细菌脂多糖(lps)。

5、lps+asa组：阿司匹林灌胃，单次灌胃量200mg/kg(体重)，连续灌胃15d，第15d的8:00pm给小鼠腹腔注射1mg/kg(体重)细菌脂多糖(lps)。

之后12h，即第16d的8:00am获得血液样品进行血清生化检测，取血后引颈处死小鼠。肝肾功能指标的检测项包括：谷草转氨酶ast(aspartateaminotransferase)、谷丙转氨酶alt(alanineaminotransferase)、乳酸脱氢酶ldh(lactatedehydrogenase)和胆碱酯酶che(cholineesterase)；碱性磷酸酶alp(alkalinephosphatase)和肌酐cre(creatinine)的血清生化指标检测见图2，结果显示连续15天口服本发明制备的具有抗炎活性的鲨鱼复合短肽(scp)在体内体现良好的抗炎活性，对细菌内毒素lps诱导的急性肝肾功能损伤，能起到明显的保护作用。图中实验结果均表示为平均值±标准差(sd)，采用单向方差分析，显着性差异设置为*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。具体的指标变化如下：

本发明具有抗炎活性的鲨鱼复合短肽(scp)，可显著抑制因细菌内毒素lps引起的小鼠肝功能指标谷丙转氨酶alt、谷草转氨酶ast、乳酸脱氢酶ldh和碱性磷酸酶alp的炎性上升，以及胆碱酯酶che炎性下降；显著抑制肾功能指标肌酐cre的炎性上升。其中服用抗炎活性的鲨鱼复合短肽(scp)组的实验小鼠，胆碱酯酶che与肌酐水平可稳定在正常生理水平，其它炎症指标均有显著性降低。说明本发明的鲨鱼复合短肽，在体内具有很好的免疫调理抗炎活性，对感染炎症引起的肝肾功能损伤能起到一定的预防作用。适度的炎症反应是高等生物对抗组织感染或者损伤的正常防护措施。然而，如果被过度激发，导致反应剧烈或长期诱导就会对健康造成不利影响，引发炎症性肠胃病、关节炎和哮喘等多种疾病。阿司匹林和吲哚美辛等非固醇类的环氧酶(cox)抑制剂可以通过抑制前列腺素生成和降低外周神经感受器敏感度来缓解炎症，效果较为显著。本发明以阿司匹林作为的鲨鱼复合短肽抗炎效果的参照,经对比发现本发明具有抗炎活性的鲨鱼复合短肽的抗炎效果接近或达到阿司匹林的效果。本发明以鲨鱼为原料，通过快速除盐除脂、酶解、分离纯化、灭菌干燥获得具有抗炎效用的复合短肽，为开发食品源鲨鱼抗炎复合短肽在营养及医学领域的应用奠定基础。