一种交替单胞菌及其应用的制作方法

本发明涉及交替单胞菌领域，尤其涉及一种具有降解作用的交替单胞菌及其应用。

背景技术：

我国辽阔的海域蕴藏着极其丰富的海藻资源。目前，我国已经成为世界上最大的海藻工业国，海藻加工业成为我国海洋资源综合利用的重要领域。近年来随着海藻加工行业的快速发展，随之而来产生的含有海藻和大量藻胶(主要是卡拉胶、琼胶和褐藻胶)的工业废水造成海洋严重污染，同时食品行业产生的大量含有藻胶的废弃物以及微生物实验室遗弃的含有藻胶的培养基都对环境造成了严重污染，亟待解决。通常，这些海藻及其释放的藻胶自然降解非常缓慢，严重影响了海洋的生态功能和生物群落。因此，在海藻和藻胶污染物排放到海洋之前对其进行降解去除，对于海洋环境的保护至关重要。目前，尚缺乏特别有效的防治手段，而采用微生物直接对海藻及其产生的藻胶进行降解，是一种极具前景且环境友好的处理技术。但目前，直接降解海藻，特别是在室温条件下具有海藻及其藻胶降解活性的菌株的报道还不多见。

印度洋水团复杂，印度洋赤道水、南印度洋水、印尼贯穿流上层水和中层水、南极中层水和南极底层水均汇集于此，不同来源、不同性质的海水及其对应的水体输运也将对该海域生物多样性产生重要影响。由于该区域复杂多样的环境特征孕育了高度多样性的微生物种群，菌种资源更为丰富，其中不乏嗜低温、嗜压和嗜盐等环境抗逆型微生物；某些微生物与海岭底栖生物共附生，也进化出了高级的化学防御功能，很多微生物具有拮抗、抗氧化等特殊的活性；这些微生物及其功能基因资源往往可以应用于生物农药开发、生物医药前体筛选以及功能食品开发等领域。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种交替单胞菌dy-s022gc04，拉丁文为alteromonassp.，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为：2020年5月19日，保藏编号为：cgmccno.19848。

优选的，所述交替单胞菌dy-s022gc04的核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明还提供了所述交替单胞菌dy-s022gc04用于降解海藻或藻胶的应用。

优选的，所述藻胶包括褐藻酸钠、卡拉胶和琼胶。

优选的，所述海藻为褐藻、红藻。

优选的，所述褐藻为马尾藻、海带、鹿角菜。

优选的，所述红藻为蜈蚣藻、龙须菜、江蓠、麒麟菜。

本发明还提供了所述交替单胞菌dy-s022gc04用于降解纤维素钠的应用。

本发明提供的交替单胞菌dy-s022gc04来源于印度洋九十度海岭3000米以下的深海沉积物，该菌是同时具有降解琼胶、卡拉胶、褐藻酸钠和纤维素钠活性的多功能深海菌株，该菌能够将褐藻酸钠、卡拉胶、琼胶和纤维素钠等胶体降解为小分子的寡糖和单糖；特别是该菌能够在室温条件下直接降解褐藻和红藻，因而为海洋海藻和藻胶等污染物的绿色治理提供了新的解决思路，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为交替单胞菌dy-s022gc04对多种藻胶及纤维素钠的降解活性；

图2为交替单胞菌dy-s022gc04对多种藻胶及纤维素钠的降解产物分析；

图3为交替单胞菌dy-s022gc04对不同海藻的降解效果；

图4为交替单胞菌dy-s022gc04降解不同海藻产生的还原糖含量。

保藏说明

交替单胞菌dy-s022gc04，拉丁文为alteromonassp.，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为：2020年5月19日，保藏编号为：cgmccno.19848。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

交替单胞菌dy-s022gc04的获得

dy-s022gc04菌株源自中国第52次大洋科学考察采集的海泥样品，采用2216e平板培养基在10℃的条件下进行划线筛选、纯化，并进行16srdna种属鉴定，dy-s022gc04菌株最终被鉴定为交替单胞菌alteromonassp.。纯化后的菌株分别接入装有2216e液体培养基的三角瓶，15℃、150rpm振荡培养48h，得到发酵液，备用。

2216e液体培养基组分如下：蛋白胨5g，酵母粉1g，用陈海水定容至1000ml，121℃下高压湿热灭菌20min。

2216e平板培养基组分如下：蛋白胨5g，酵母粉1g，琼脂15g，用陈海水定容至1000ml，121℃下高压湿热灭菌20min。

实施例2

交替单胞菌dy-s022gc04对藻胶及纤维素钠的降解活性

将实施例1制得的发酵液于4℃、10000rpm离心20min，取1ml发酵上清液分别滴于琼胶培养基、卡拉胶培养基、褐藻胶培养基、和纤维素钠培养基的筛选培养基的孔中，在25℃放置60min后，进行卢戈氏染色观察。结果如图1，交替单胞菌dy-s022gc04在四种不同的筛选培养基上均呈现明显的透明圈(a、b、c、d依次为交替单胞菌dy-s022gc04对褐藻胶、卡拉胶、琼胶和纤维素钠的降解活性)，表明交替单胞菌dy-s022gc04同时具有降解褐藻胶、卡拉胶、琼胶等藻胶和纤维素钠的活性。

因为纤维素是大型海藻细胞壁结构的主要组成成分，在藻胶的降解过程中，需要首先破坏细胞壁才能进一步降解藻胶。本实施例证明本发明的交替单胞菌dy-s022gc04对纤维素钠具有良好的降解活性，能够首先降解海藻的细胞壁，进一步对藻胶进行降解。

在本实施例中，褐藻胶培养基、卡拉胶培养基、琼胶培养基和纤维素钠培养基的成分如下：

琼胶培养基：蛋白胨5g，酵母粉1g，琼脂15g，用陈海水定容至1000ml；

卡拉胶培养基：蛋白胨5g，酵母粉1g，卡拉胶20g，用陈海水定容至1000ml；

褐藻胶培养基：蛋白胨5g，酵母粉1g，琼脂10g，褐藻酸钠10g，用陈海水定容至1000ml。

纤维素培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，琼脂10g，纤维素钠10g，用陈海水定容至1000ml。

本实施例所用陈海水是指：将新鲜海水装入玻璃盛器中，于暗处贮放数星期后的海水。但贮放的新鲜海水须是从不被陆源污染物污染或很少混有淡水的清洁海区采取。贮放采用玻璃盛器，而不用金属盛器，这是因为有些金属能使海水变得具有杀菌力；贮放在暗处则是避免在光合作用下生物生长。经过贮放后的陈海水有机物含量减少(因异养微生物分解所致，由原来的4～5克/升，减少至0.4～0.5克/升)，所含的杀菌成分亦随时间而逐渐减少，但仍含有有利于微生物生长的物质。所以，用陈海水制备的海洋微生物培养基，往往能取得良好的培养和分离效果。

为了分析交替单胞菌dy-s022gc04对藻胶及纤维素钠的降解产物，本实施例将1g的褐藻酸钠与1l的pbs缓冲液(ph为7.0)混合，得到了质量体积分数为0.1％的褐藻酸钠溶液。同理，分别将1g的琼胶、1g的卡拉胶和1g的纤维素钠与1l的pbs缓冲液(ph为7.0)混合，分别得到质量体积分数均为0.1％的琼胶溶液、卡拉胶溶液和纤维素钠溶液。然后分别取4份1ml发酵上清液加入到同体积(1l)的0.1％的褐藻酸钠溶液、0.1％的琼胶溶液、0.1％的卡拉胶溶液和0.1％的纤维素钠溶液中，作为实验组进行实验；并设置对照组，对照组与实验组的区别仅在于添加的发酵上清液经过灭活处理(100℃灭活10min)。然后将实验组和对照组于25℃放置反应24h。降解产物经10000r/min离心后，收集上清液，备用。采用薄层层析法(tlc)对降解产物的上清液进行分析。本实施例所用展开剂为：正丁醇：乙醇：水＝2：1：1，v/v/v；本实施例所用显色剂为：二苯胺2g，苯胺2ml，85％磷酸10ml，浓盐酸1ml，丙酮100ml。

经测定，如图2所示(a、b、c、d依次为褐藻胶、卡拉胶、琼胶和纤维素钠的降解活性，m：标样；m1为奇数碳标样，m2为偶数碳标样；c：对照组；s：实验组；dp：聚合度)，dy-s022gc04发酵液可将褐藻酸钠降解为单糖、二聚糖和三聚糖；将卡拉胶降解为单糖、二聚糖和四聚糖；将琼胶降解为单糖、二聚糖和四聚糖；将纤维素钠降解为葡萄糖。结果表明dy-s022gc04具有将褐藻酸钠、琼胶、卡拉胶和纤维素钠底物降解为不同聚合度寡糖或单糖的活性。

实施例3

交替单胞菌dy-s022gc04对海藻的降解活性

为了验证交替单胞菌dy-s022gc04对不同类型海藻的降解能力，本实施例分别称取3种海藻：马尾藻(褐藻)、蜈蚣藻(红藻)和石莼(绿藻)2g(湿重)，剪成2cm×2cm的片段，置于装有19mlm培养基(m培养基：10g络氨酸溶于10mm的磷酸盐缓冲液，ph7.0)的100ml三角瓶中，接种1ml交替单胞菌dy-s022gc04(od600＝0.1)菌株，25℃下培养7d。培养完成后，采用尼龙布过滤培养基，得到未降解的海藻碎片和培养液，将未降解的海藻碎片冷冻干燥后称重，计算海藻的降解率，如图3所示(1、2、3依次为马尾藻、石莼和龙须菜；黑色为未降解海藻，白色为未接种菌株的海藻处理，浅灰为加入交替单胞菌dy-s022gc04处理的海藻)。吸取1ml过滤后的培养液于10000rpm离心20min去掉不溶的部分，采用苯酚硫酸法测定培养液中还原糖的含量，结果如图4所示(1、2、3依次为马尾藻、石莼和龙须菜；黑色为未降解海藻，白色为未接种菌株的海藻处理，浅灰为加入交替单胞菌dy-s022gc04处理的海藻)。以没有接种菌株的海藻样品作为对照。

由图3可见，经过7天的降解处理，交替单胞菌dy-s022gc04对马尾藻和蜈蚣藻有显著的降解能力，降解率可达80～85％，但几乎不能降解石莼。同理，降解马尾藻和蜈蚣藻后释放的还原糖可达2.5～3.0g/l，而对石莼的降解效果不明显(图4)。

由以上实施例可知，本发明提供的交替单胞菌dy-s022gc04不仅对多种藻胶和纤维素钠具有较高的降解活性，还能在室温下直接对褐藻和红藻进行有效的降解，因而在海洋海藻和藻胶污染的绿色处理领域具有潜在的应用价值。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>自然资源部第一海洋研究所

<120>一种交替单胞菌及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1434

<212>dna

<213>交替单胞菌(alteromonassp.)

<400>1

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