一种尿液游离DNA常温保存剂的制作方法

本发明涉及生物医学
技术领域：
，具体涉及一种尿液游离dna常温保存剂。
背景技术：
：癌症是世界范围内最严重的公共健康问题，临床上主要是使用病灶组织、细胞来对癌症患者进行检测和监测，而组织样本的检测分析易受到肿瘤异质性、取样困难以及高创伤性等限制。cfdna(循环游离dna，circulatingcell-freedna)早在1948年被mandeletal.首次报导，到20世纪90年代从肿瘤患者的外周血中检出了ras的基因片段，cfdna的重要意义才被人们所重视。随着液体活检和测序技术的发展，游离dna(cell-freedna,cfdna)或循环肿瘤dna(circulatingtumordna,ctdna)越来越多的被用来进行癌症的早期筛查、靶向诊断和预后评估等。尿液作为一种常见的生物性检材，也存在一定数量的游离dna。相较于现有的组织、细胞和血液取样来说，尿液取材容易获取，方便操作。且属于非介入性的，实现真正的无创，安全性高。尿液不会受到hiv病毒的感染，也不易受到其它病原微生物的感染，避免了样本源头的污染。正常尿液中的游离dna主要来源为泌尿系统器官如肾脏、膀胱、尿道等脱落下来的上皮细胞及少量白细胞降解而来，而当泌尿系统发生病理变化时，病灶部位凋亡和坏死的细胞进入尿液，尿液中的游离dna含量和种类也会随之发生改变。近年来在多种类型的尿液样本中均有提及游离dna(cell-freedna，cfdna)的相关报道，比如在怀有男胎的孕妇尿液样本中检测到y染色体的存在；在胰腺癌和结直肠癌患者的尿液中发现kras基因突变；肺结核患者的尿液中检出结核杆菌的dna；在妇科和泌尿道疾病或hiv患者的尿液中含有hpv的dna；在恶性肾脏和膀胱肿瘤的基因突变和微卫星不稳定可在尿液样本游离dna中检测到；前列腺以及膀胱肿瘤的异常dna甲基化可在患者尿液cfdna中检出等。可见尿液cfdna作为一种生物标记物的研究和应用越来越广泛，通过检测尿液中cfdna的状况可以有效监测患癌风险及预后评估。然而尿液是一种经泌尿系统排出体外的代谢废弃物，其成分复杂，有着各类代谢产物、含量很高的核酸酶、ph波动范围较大。尿液中cfdna含量较低，在成分复杂的尿液环境易于降解，同时尿液中存在的细胞发生破裂会导致基因组dna释放，将会改变尿液中初始游离dna的含量，增加检测背景噪音，甚至影响临床对靶向cfdna的检测需要。为了保证尿液样本中含有的少量cfdna满足临床检测的准确性需求，尿液收集之后要求在4℃条件下保存并运输，尽快离心分离尿液上清和尿沉淀，若长期保存需转移到-80℃超低温冰箱储存，以便在最大限度下保证尿液中cfdna的原始状态。冷链保存与运输即便如此，仅仅依靠低温，仍不能有效地在一定时间内防止尿液样品中cfdna的降解和基因组dna释放对原始cfdna的影响。因此有必要开发一种可在室温条件下对尿液样本中cfdna稳定保存的保存剂，有效防止尿液中cfdna降解和基因组dna释放，同时解决当前样本依赖冷链且无法稳定保存尿液cfdna等问题。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供一种尿液游离dna常温保存剂，该保存液无须依赖冷链，可常温稳定运输保存尿液游离dna长达14天，有效防止尿液中cfdna降解和基因组dna释放，同时解决当前样本依赖冷链且无法稳定保存尿液cfdna等问题，适用于临床对靶向cfdna的检测需求。为实现上述目的，本发明第一方面提供一种尿液游离dna常温保存剂，包括以下质量分数的组成：1-5％核酸酶抑制剂、10-25％细胞固定剂、3-15％细胞膜保护剂、1-5％甲醛淬灭剂和50-85％ph缓冲剂。本发明提供的尿液游离dna常温保存剂中，核酸酶抑制剂可通过蜇合mg2+、ca2+、fe3+等金属离子而抑制核酸酶活性，避免其引起样本中游离dna的降解；亦可抑制核酸与蛋白的相互作用，而达到抑制核酸酶作用，保护样本游离dna；细胞固定剂用于固定尿液中的细胞和各种蛋白类成分，维持细胞基因组dna和游离dna的完整性，同时因为在操作过程中，有部分细胞可能发生破碎，因此使用固定剂可对蛋白质进行变性，可以防止dna消化酶及蛋白酶对dna及蛋白的降解作用；细胞膜保护剂可以保存细胞膜不受破损，维持尿液样本中尚未破损的细胞的完整性；甲醛淬灭剂主要是与游离的甲醛反应，淬灭游离甲醛活性，避免其对游离dna造成损伤及影响后续提取纯化结果，使得尿液中的游离dna能够维持自身的结构稳定、保持生物学性能；ph缓冲剂可为样品中游离dna提供基础的存储环境，避免其自行降解。上述各组分协同配合，即可实现实现常温稳定运输保存尿液游离dna长达14天的保存效果。在本发明一实施例中，所述核酸酶抑制剂包括乙二胺四乙酸三钾、金精三羧酸、钒基-核糖核苷复合物、甲酰胺、羟乙基哌嗪乙硫磺酸、二硫苏糖醇中的一种或多种。在本发明一优选实施例中，所述核酸酶抑制剂包括乙二胺四乙酸三钾、金精三羧酸和钒基-核糖核苷复合物，其质量比为5:3:2。在本发明一实施例中，所述细胞固定剂包括重氮烷基脲、咪唑烷基脲、乙内酰脲、羟甲基甘氨酸钠中的一种或多种。在本发明一优选实施例中，所述细胞固定剂包括重氮烷基脲、咪唑烷基脲和羟甲基甘氨酸钠，其质量比为5:3:2。在本发明一实施例中，所述细胞膜保护剂包括天冬氨酸、甘氨酸、半胱酰胺、谷氨酰胺、甘油醛-3-磷酸的一种或多种。在本发明一优选实施例中，所述细胞膜保护剂包括0.1-0.5m的甘氨酸。在本发明一实施例中，所述甲醛淬灭剂包括赖氨酸、精氨酸、乙二胺、甘氨酸的一种或多种。在本发明一优选实施例中，所述甲醛淬灭剂包括赖氨酸、精氨酸，其质量比为6:4。在本发明一实施例中，所述ph缓冲剂包括tris-hcl，柠檬酸钠、磷酸钾盐、碳酸氢钠和磷酸盐缓冲液中的一种或多种。在本发明一优选实施例中，所述ph缓冲剂包括1.25-2m的tris-hcl。本发明第二方面提供一种尿液游离dna常温保存方法，包括以下步骤：收集尿液样本置于本发明第一方面所述的尿液游离dna常温保存剂中，室温保存即可。在本发明一实施例中，所述尿液游离dna常温保存剂与尿液样本的体积比为1：3-6。在本发明一优选实施例中，所述尿液游离dna常温保存剂与尿液样本的体积比为1：5。在本发明一实施例中，所述尿液游离dna常温保存方法室温稳定保存尿液游离dna的时限为14天。本发明第三方面提供如本发明第一方面所述的尿液游离dna常温保存剂或如本发明第二方面所述的尿液游离dna常温保存方法在制备尿液游离dna保存试剂中的应用。本发明提供的尿液游离dna常温保存剂安全无毒，使用简单，无须冷链保存，可常温稳定运输保存尿液游离dna长达14天，保存液配置有核酸酶抑制剂、细胞固定剂、细胞膜保护剂、甲醛淬灭剂和ph缓冲剂，相关组分协同配合，即可有效防止尿液中cfdna降解和基因组dna释放，同时解决当前样本依赖冷链且无法稳定保存尿液cfdna等问题，实现常温稳定运输保存尿液游离dna长达14天的保存效果，适用于临床对靶向cfdna的检测需求。附图说明图1为本发明实施例提供的尿液游离dna中内参基因gapdh在不同保存剂下第0、5、7、14天的qpcr检测结果图，其中实验组保存剂为尿液游离dna常温保存剂，对照组保存剂为depc水；图2为本发明实施例提供的尿液样本中额外添加的her2基因在不同保存剂下第0、5、7、14天的qpcr检测结果图，其中实验组保存剂为尿液游离dna常温保存剂，对照组保存剂为depc水；图3为本发明实施例提供的尿液游离dna在不同保存剂下第0、7、14天的agilent2100生物分析结果图，其中实验组保存剂为尿液游离dna常温保存剂，对照组保存剂为depc水。具体实施方式为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现详细说明本发明的具体实施方式。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明实施例中若无特别说明，所用试剂及耗材均为市售商品。本发明提供的尿液游离dna常温保存剂中，一种尿液游离dna常温保存剂，包括以下质量分数的组成：1-5％核酸酶抑制剂、10-25％细胞固定剂、3-15％细胞膜保护剂、1-5％甲醛淬灭剂和50-85％ph缓冲剂。本发明提供的尿液游离dna常温保存剂中，核酸酶抑制剂可通过蜇合mg2+、ca2+、fe3+等金属离子而抑制核酸酶活性，避免其引起样本中游离dna的降解；亦可抑制核酸与蛋白的相互作用，而达到抑制核酸酶作用，保护样本游离dna；细胞固定剂用于固定尿液中的细胞和各种蛋白类成分，维持细胞基因组dna和游离dna的完整性，同时因为在操作过程中，有部分细胞可能发生破碎，因此使用固定剂可对蛋白质进行变性，可以防止dna消化酶及蛋白酶对dna及蛋白的降解作用；细胞膜保护剂可以保存细胞膜不受破损，维持尿液样本中尚未破损的细胞的完整性；甲醛淬灭剂主要是与游离的甲醛反应，淬灭游离甲醛活性，避免其对游离dna造成损伤及影响后续提取纯化结果，使得尿液中的游离dna能够维持自身的结构稳定、保持生物学性能；ph缓冲剂可为样品中游离dna提供基础的存储环境，避免其自行降解。上述各组分协同配合，即可实现实现常温稳定运输保存尿液游离dna长达14天的保存效果。为更清楚展示本发明的技术方案，下面将结合具体实施例进一步阐述本发明。实施例1尿液游离dna常温保存剂的配制根据以下配方配制尿液游离dna常温保存剂：保存剂组分质量分数范围配方1配方2配方3配方4配方5核酸酶抑制剂1-5％122.545细胞固定剂10-25％1012152025细胞膜保护剂3-15％36101215甲醛淬灭剂1-5％122.545ph缓冲剂50-85％8578706050其中，核酸酶抑制剂包括乙二胺四乙酸三钾、金精三羧酸和钒基-核糖核苷复合物，其质量比为5:3:2；细胞固定剂包括重氮烷基脲、咪唑烷基脲、羟甲基甘氨酸钠，其质量比为5:3:2；细胞膜保护剂包括0.1-0.5m的甘氨酸；甲醛淬灭剂包括赖氨酸和精氨酸，其质量比为6:4；ph缓冲剂包括1.25-2m的tris-hcl。实施例2尿液游离dna常温保存剂的保存效果验证1、qubit4.0检测验证尿液游离dna常温保存剂的保存效果1)收集10位健康成人中段晨尿样本各20ml。其中，实验组：10ml尿液样本添加本发明提供的尿液游离dna常温保存剂2ml，对照组：10ml尿液样本加入2mldepc水。2)置于室温保存，分别于第0天，第5天，第7天和第14天，自各组样品中取出6ml尿液样本，用qiageen的qiaampcirculatingnucleicacidkit提取尿液样本cfdna，为了获得更好的提取效果，将60℃下用蛋白酶k消化时间从30min延长至1h，其余按试剂盒说明书操作，洗脱体积为20μl。3)用qubit4.0检测提取的所有样本各个时间点尿液cfdna的浓度(ng/μl)，根据cfdna洗脱体积，计算各样本量，统计结果如下：从上表结果可得，实验组(配方1、配方3、配方5)，即经本发明提供的尿液游离dna常温保存剂处理的尿液样本，其游离dna在室温条件下，0-14天保持相对稳定，未发生大量降解迹象，亦未发生因；而对照组，其游离dna浓度在第7天剧增至720.57ng/μl，表明尿液中存在的细胞发生破裂会导致基因组dna释放使尿液中初始游离dna的含量剧增，第14天时游离dna浓度降至277.19ng/μl，表明随着时间增加，尿液中的游离dna发生了降解。为进一步验证本发明提供的尿液游离dna常温保存剂的性能，下面将以实施例1中配方3配制所得的保存剂为例，测试其保存效果。2、qpcr检测验证尿液游离dna常温保存剂的保存效果1)通过qpcr检测室温存储对内参基因gapdh的影响，使用内参基因gapdh引物探针体系对上述步骤1提取所得的尿液游离dna进行荧光定量pcr检测，结果如图1所示：在第0天，实验组与对照组中的gapdh含量相差无几，其ct值约为26，而在第5、7天，对照组中因存在细胞裂解引起游离dna含量明显增多，因此qpcr检测到的gapdh含量明显增多，其第5天ct值约为21，第7天约为18；而第14天时，对照组中因长时间的核酸酶降解作用影响引起游离dna含量明显减少，因此qpcr检测到的gapdh含量减少，其ct值约为33，而实验组在第0-14天中的游离dna量保持相对稳定，其ct值约为26，保持相对稳定的状态。2)为进一步验证尿液游离dna常温保存剂，通过额外添加her2基因至尿液样本中，取1ml尿液样本用qiaampcirculatingnucleicacidkit(qiageen)提取尿液样本cfdna，其余操作同步骤1，使用her2基因引物探针体系对所得的尿液游离dna进行荧光定量pcr检测，结果如图2所示：在第0天，实验组与对照组中的her2基因含量相差无几，其ct值约为23，而在第5、7、14天，对照组中因核酸酶降解作用引起尿液中游离的her2基因含量随时间增长而逐步减少，qpcr检测her2基因的ct值逐步增大，第5天约为29，第7天约为33，到第14天，her2基因未检出，而实验组在第0-7天中的尿液中游离的her2基因含量保持相对稳定，其ct值约为23，在第14天，其ct值略微增大，约为27，保持相对稳定的状态。3、agilent2100生物分析仪检测尿液游离dna状况选择bioanalyzerhighsensitivitydnaanalysis(5067-4626)试剂盒检测。按试剂盒说明，将所需试剂放置室温平衡20min，将15μl高灵敏度染料加入高灵敏度dna凝胶基质小瓶中制胶，并吸取凝胶-染料混合物加入芯片中，将芯片放置到压胶的装置上，注射器位置位于1ml处，锁入芯片，推动注射器直到芯片锁住，1min后轻轻推动注射器置于1ml处，取出芯片吸取9μl凝胶-染料混合物。吸取5μlmarker置芯片所有样品槽内，吸取1μlladder至芯片marker孔，吸取1μl样品至芯片样品孔，将芯片放置震荡器上2400rpm震荡1min后将芯片放置agilent2100运行程序，并分析，结果如图3所示：对照组的尿液游离dna在第7天时因存在细胞裂解含量明显增多，同时出现了较多杂峰，在第14天时因长时间的核酸酶降解作用影响引起游离dna含量明显减少。而实验组中的尿液游离dna在第0、7、14天保持相对稳定的状态。综上，本发明提供的尿液游离dna常温保存剂可在常温条件稳定运输保存尿液游离dna长达14天，有效防止尿液中cfdna降解和基因组dna释放，同时解决当前样本依赖冷链且无法稳定保存尿液cfdna等问题，实现较长时间常温稳定运输保存尿液游离dna的保存效果，适用于临床对靶向cfdna的检测需求。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12