本发明涉及微生物
技术领域：
，特别涉及一种新型微生物核酸纯化工艺。
背景技术：
：各种形式的核酸应用于各个领域。例如，在重组核酸
技术领域：
中，需要将核酸以探针、基因组核酸和质粒核酸的形式使用。此外，在诊断学领域中，核酸以各种形式应用于各种目的。例如，在检测和诊断人类病原体时，常常使用核酸探针。同样，核酸也用于检测遗传性病症。核酸还用于检测食品污染物。此外，基于从绘制基因图谱到克隆和重组表达的各种原因，也常常用核酸对所关心的核酸进行定位、识别和分离。在许多情况下，只有极微量的核酸可以利用，因此分离和纯化过程费时费力。这些费时费力的操作有时可能会导致核酸损失。在从来自于血清、尿和细菌培养物的样品中纯化核酸时，还会碰到污染和假阳性结果的问题。关于广为人知的分离和纯化方法，有这样一种方法，其中：将核酸吸附到二氧化硅、二氧化硅聚合物(silicapolymer)、硅酸镁或类似的固相上，随后通过实施洗涤、解吸附和类似的操作对核酸进行分离和纯化，该方法具有优异的分离性能，但是，该方法在方便性、快速性和自动化适应性方面还存在不足。现有技术中核酸纯化方法主要包括两个步骤：一是裂解，将细胞破碎使核酸释放出来，裂解步骤是核酸纯化的关键环节，裂解过程主要是将细胞破碎，释放出核酸；二是纯化，即量释放出来的核酸和细胞内的其他成分如蛋白质、盐和其他杂质分离开。目前使用广泛的核酸分离纯化方法包括酚-氯仿抽提法和离心柱纯化，该方法具有不环保，操作复杂，难以实现多通量等缺点。因此开发一种能够有效提高分离纯化效率，提高核酸回收率以及纯度的纯化试剂尤为重要。技术实现要素：本发明旨在克服上述现有技术的至少一种缺陷，提供一种新型微生物核酸纯化工艺，以达到操作简单、提取率高、纯度高的目的。具体的，本发明一种新型微生物核酸纯化工艺包括以下步骤：s1：磁珠预处理：将硅羟基磁珠微粒摇匀，吸入离心管中，磁分离，弃上清，得到预处理的硅羟基磁珠微粒；s2：混合：吸取dna结合液和样本加入步骤s1得到的预处理后的硅羟基磁珠微粒中，超声混匀后静置，磁分离，弃上清，得到物质a；s3：取第一纯化剂加入所述步骤s2得到的物质a中，超声混匀后静置，磁分离，弃上清，得到物质b，重复此步骤一次，得到物质c；s4：取第二纯化剂加入步骤s3得到的物质c中，超声混匀后静置，磁分离，弃上清，得到物质d，重复此步骤一次，得到物质e；s5：取洗脱液缓慢加入步骤s4得到的物质e中，静置，保持磁力吸附，弃上清，得到物质f；s6：取洗脱液加入步骤s5得到的物质f中，超声混匀，静置后再超声混匀，磁力吸附，吸取上清液溶解冻干beads进行荧光pcr检测。进一步的，所述步骤s1中，所述的磁珠为硅羟基修饰的磁珠浓度为20-30mg/ml，所述的磁珠的粒径为300-800nm。进一步的，所述步骤s2中dna结合液和样品的体积比为60：40。进一步的，所述步骤s2～s4以及s6中超声条件为40～60w，超声5～10min。进一步的，所述步骤s5和s6中，所述洗脱液为10mmtris-hcl，所述洗脱液的ph为7～9。进一步的，所述dna结合液包括8m盐酸胍、0.3m醋酸钠、1％tritonx-100以及1％的十二烷基硫酸钠。进一步的，所述第一纯化剂包括6m尿素、0.30m醋酸钠、2.0％tritonx-100、5mm的tris-hcl。进一步的，所述第二纯化剂包括体积分数为70％的乙醇、0.15m醋酸钠ph为4.5、15mm柠檬酸钠。进一步的，所述步骤s1中所述硅羟基磁珠微粒的量为5～10μl。进一步的，所述第一纯化剂加入量为50～100μl；所述第二纯化剂加入量为50～100μl；所述洗脱液的加入量为50～100μl。本发明的有益效果：(1)本发明使用的磁珠微粒为硅羟基磁珠能够更好的分离纯化核酸，该磁珠与本发明的其他纯化试剂相互作用明显提高核酸的纯化效率并且纯度高，使分离纯化得率可达接近98％，明显高于现有技术。(2)本发明在实施过程中在dna结合液中加入1％的十二烷基硫酸钠，明显提高了纯化效果。(3)本发明在实施过程中严格控制磁珠结合液的组分，以及各组分的浓度，并分别使用两种洗涤液对核酸进行分层洗涤纯化，提高了纯化效率，本发明控制样品与dna结合液的体积比，使其能够更好的纯化分离更小片段的核酸，并能达到对微量浓度样品的高度纯化，达到更好的纯化效果。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不限定本发明的保护范围。实施例1本实施例提供一种新型微生物核酸纯化工艺，具体包括以下步骤：s1：磁珠预处理：将10μl硅羟基磁珠微粒摇匀，吸入离心管中，磁分离，弃上清，得到预处理的硅羟基磁珠微粒；s2：混合：吸取60μldna结合液和40μl样本加入步骤s1得到的预处理后的硅羟基磁珠微粒中，40w，超声10min混匀后静置，磁分离，弃上清，得到物质a；s3：取100μl第一纯化剂加入所述步骤s2得到的物质a中，40～60w，超声5～10min混匀后静置，磁分离，弃上清，得到物质b，重复此步骤一次，得到物质c；s4：取100μl第二纯化剂加入步骤s3得到的物质c中，40～60w，超声5～10min混匀后静置，磁分离，弃上清，得到物质d，重复此步骤一次，得到物质e；s5：取100μl洗脱液缓慢加入步骤s4得到的物质e中，静置，保持磁力吸附，弃上清，得到物质f；s6：取100μl洗脱液加入步骤s5得到的物质f中，40～60w，超声5～10min混匀，静置后再超声混匀，磁力吸附，吸取上清液溶解冻干beads进行荧光pcr检测。所述步骤s1中，所述的磁珠为硅羟基修饰的磁珠浓度为20mg/ml，所述的磁珠的粒径为300nm；所述步骤s5和s6中，所述洗脱液为10mmtris-hcl，所述洗脱液的ph为9。所述dna结合液包括8m盐酸胍、0.3m醋酸钠、1％tritonx-100以及1％的十二烷基硫酸钠。所述第一纯化剂包括6m尿素、0.30m醋酸钠、2.0％tritonx-100、5mm的tris-hcl。所述第二纯化剂包括体积分数为70％的乙醇、0.15m醋酸钠ph为4.5、15mm柠檬酸钠。实施例2一种新型微生物核酸纯化工艺，具体包括以下步骤：s1：磁珠预处理：将5μl硅羟基磁珠微粒摇匀，吸入离心管中，磁分离，弃上清，得到预处理的硅羟基磁珠微粒；s2：混合：吸取60μldna结合液和40μl样本加入步骤s1得到的预处理后的硅羟基磁珠微粒中，60w，超声5min混匀后静置，磁分离，弃上清，得到物质a；s3：取50μl第一纯化剂加入所述步骤s2得到的物质a中，60w，超声5min混匀后静置，磁分离，弃上清，得到物质b，重复此步骤一次，得到物质c；s4：取50μl第二纯化剂加入步骤s3得到的物质c中，60w，超声5min混匀后静置，磁分离，弃上清，得到物质d，重复此步骤一次，得到物质e；s5：取50μl洗脱液缓慢加入步骤s4得到的物质e中，静置，保持磁力吸附，弃上清，得到物质f；s6：取50μl洗脱液加入步骤s5得到的物质f中，60w，超声5min混匀，静置后再超声混匀，磁力吸附，吸取上清液溶解冻干beads进行荧光pcr检测。所述步骤s1中，所述的磁珠为硅羟基修饰的磁珠浓度为30mg/ml，所述的磁珠的粒径为800nm；所述步骤s5和s6中，所述洗脱液为10mmtris-hcl，所述洗脱液的ph为7。所述dna结合液包括8m盐酸胍、0.3m醋酸钠、1％tritonx-100以及1％的十二烷基硫酸钠。所述第一纯化剂包括6m尿素、0.30m醋酸钠、2.0％tritonx-100、5mm的tris-hcl。所述第二纯化剂包括体积分数为70％的乙醇、0.15m醋酸钠ph为4.5、15mm柠檬酸钠。对比例1本对比例与实施例1的不同之处在于，所述dna结合液中未添加十二烷基硫酸钠，以等量溶剂水代替；其余步骤与实施例1相同。对比例2本对比例与实施例1的不同之处在于，所述步骤s4中，所述第二纯化剂替换成第一纯化剂；其余步骤与实施例1相同。对比例3本对比例与实施例1的不同之处在于，本实施例使用的磁珠为羧基修饰的磁珠微粒，其余步骤与实施例1相同。微量浓度核酸的分离纯化效率检测检测方法：将浓度为50ng/μl的核酸中加入纯化试剂进行纯化，平行测定2次；测定纯化后产物中核酸浓度，计算纯化得率，具体检测数据见下表；组别核酸浓度1分离纯化得率％核酸浓度2分离纯化得率％实施例148.597.0048.8797.74实施例249.0298.0448.9597.90对比例138.2476.4839.6879.36对比例230.5361.0632.1464.28对比例331.7163.4228.4356.86综上，利用本发明的核酸纯化方法，核酸得率高，提取率在95％以上，最高可接近98％，且重复性好。对比例1dna结合液中未添加十二烷基硫酸钠，提取率明显降低；对比例2改变纯化试剂同样能够影响纯化效率；对比例3改变了磁珠的种类，提取率不到60％，严重影响了纯化效率。因此，只有使用本发明的纯化方法才能够使核酸纯化率最高。显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。当前第1页12