一种地诺前列酮的浓缩方法与流程

本发明涉及生物制药
技术领域：
，尤其涉及一种地诺前列酮的浓缩方法。
背景技术：
：地诺前列酮又称前列腺素e2，是一种重要的细胞生长和调节因子，是花生四烯酸环氧合酶代谢产物，为二十碳不饱和脂肪酸。前列腺素e2具有扩张血管、增加器官血流量、降低血管外周阻力、降低血压，使支气管平滑肌舒张、降低通气阻力，抑制胃酸分泌等作用，同时具有免疫抑制和抗炎作用。目前，地诺前列酮常通过化学合成方法制得。酶催化法制备地诺前列酮的方法较少。cn201911326101.7的申请文件中提到酶催化法制备前列腺素e2得到反应液，但是利用该酶促反应液制备高浓度的前列腺素e2浓缩液还没有简单有效的方法，采用常规方法在浓缩过程中前列腺素e2易析出。技术实现要素：基于
背景技术：
存在的技术问题，本发明提出了一种地诺前列酮的浓缩方法，通过向料液中加入乙醇调节料液浓度，在不影响纳滤膜性能的基础上，有效提高纳滤浓缩的倍数，快速高效。本发明提出的一种地诺前列酮的浓缩方法，包括以下步骤：s1、取地诺前列酮的酶促反应液依次经微滤、超滤处理，得超滤透过液；s2、向超滤透过液中加入乙醇溶液，至超滤透过液中乙醇浓度为17-22％，然后进行纳滤处理，得纳滤浓缩液；s3、将纳滤浓缩液进行过柱、一次旋蒸、萃取、二次旋蒸、复溶处理，得地诺前列酮的浓缩液。上述“地诺前列酮的酶促反应液”是指申请号为cn201911326101.7的申请文件中实施例5获得的反应液。优选地，采用陶瓷膜微滤处理；优选地，陶瓷膜的孔径为100-500nm。优选地，采用中空纤维超滤膜进行超滤处理；优选地，中空纤维超滤膜的截留分子量为5000da。优选地，采用纳滤膜进行纳滤处理；优选地，纳滤膜的截留分子量为150da。优选地，纳滤处理的压力为0.5-0.8mpa。优选地，一次旋蒸和二次旋蒸的工艺条件为：压力为14-18mbar，转速27-32rpm，温度25-30℃。优选地，萃取试剂采用乙酸乙酯。有益效果：由于酶促反应液原料中的油脂会吸附在纳滤膜上堵塞孔道而无法采用纳滤膜过滤浓缩，本发明通过向料液中加入乙醇并摸索出合适用量，使其能够采用纳滤对酶促反应液中的地诺前列酮进行浓缩处理提高其浓度，减小后续层析纯化处理的体积，提高纯化速率，且向超滤透过液中加入乙醇调节料液浓度，在不影响纳滤膜性能的基础上，有效提高纳滤浓缩的倍数，快速高效，有效解决了未添加乙醇的料液纳滤浓缩至地诺前列酮1.2mg/ml时就出现样品析出、浓缩倍数低的问题。附图说明图1为本发明对比例中的超滤透过液经稀释2倍后的高效液相色谱图；图2为本发明对比例中的纳滤浓缩液经稀释5倍后的高效液相色谱图；图3为本发明实施例1中超滤透过液的高效液相色谱图；图4为本发明实施例1中纳滤浓缩液经稀释2倍后的高效液相色谱图。具体实施方式下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。实施例1一种地诺前列酮的浓缩方法，包括以下步骤：s1、取地诺前列酮的酶促反应液，依次经孔径为100nm的陶瓷膜微滤、截留分子量为5000da的中空纤维超滤膜超滤，得超滤透过液；该步骤中，通过陶瓷膜和超滤膜过滤除去酶促反应液中的大部分杂质。s2、向超滤透过液中加入95％乙醇溶液，至超滤透过液中乙醇浓度为20％，然后采用截留分子量为150da的纳滤膜进行纳滤浓缩处理，纳滤处理的压力为0.65mpa，得纳滤浓缩液；该步骤中，通过纳滤浓缩提高地诺前列酮的浓度，减小后续层析纯化处理的体积，提高纯化速率。s3、将纳滤浓缩液进行过柱，得过柱纯化液；将过柱纯化液放入旋蒸瓶进行一次减压旋蒸，其中，冷却水温度-10～-20℃，转速30rpm，温度25℃，压力15mbar(根据溶液沸腾状态压力从50mbar逐步降低压力到15mbar)；将经一次旋蒸后的料液至分液漏斗，按比例添加乙酸乙酯，通过振荡将有机相与水相混匀，静置分层，取上层有机相1，将水相按上述方法重复两次，得有机相2和有机相3；将有机相1、2、3混匀，进行二次减压旋蒸处理，除旋蒸压力为30mbar(根据溶液沸腾状态从100mbar缓慢下降至30mbar)，其他条件与一次减压旋蒸相同；旋蒸完全后，在旋蒸瓶内加入少量95％药用乙醇，将地诺前列酮复溶，得地诺前列酮的浓缩液。实施例2一种地诺前列酮的浓缩方法，包括以下步骤：s1、取地诺前列酮的酶促反应液，依次经孔径为500nm的陶瓷膜微滤、截留分子量为5000da的中空纤维超滤膜超滤，得超滤透过液；该步骤中，通过陶瓷膜和超滤膜过滤除去酶促反应液中的大部分杂质。s2、向超滤透过液中加入95％乙醇溶液，至超滤透过液中乙醇浓度为17％，然后采用截留分子量为150da的纳滤膜进行纳滤浓缩处理，纳滤处理的压力为0.5mpa，得纳滤浓缩液；该步骤中，通过纳滤浓缩提高地诺前列酮的浓度，减小后续层析纯化处理的体积，提高纯化速率。s3、将纳滤浓缩液进行过柱，得过柱纯化液；将过柱纯化液放入旋蒸瓶进行一次减压旋蒸，其中，冷却水温度-10～-20℃，转速27rpm，温度25℃，压力14mbar(根据溶液沸腾状态压力从50mbar逐步降低压力到15mbar)；将经一次旋蒸后的料液至分液漏斗，按比例添加乙酸乙酯，通过振荡将有机相与水相混匀，静置分层，取上层有机相1，将水相按上述方法重复两次，得有机相2和有机相3；将有机相1、2、3混匀，进行二次减压旋蒸，除旋蒸压力为30mbar(根据溶液沸腾状态从100mbar缓慢下降至30mbar)，其他条件与一次减压旋蒸相同；旋蒸完全后，在旋蒸瓶内加入少量95％药用乙醇，将地诺前列酮复溶，得地诺前列酮的浓缩液。实施例3一种地诺前列酮的浓缩方法，包括以下步骤：s1、取地诺前列酮的酶促反应液，依次经孔径为200nm的陶瓷膜微滤、截留分子量为5000da的中空纤维超滤膜超滤，得超滤透过液；该步骤中，通过陶瓷膜和超滤膜过滤除去酶促反应液中的大部分杂质。s2、向超滤透过液中加入95％乙醇溶液，至超滤透过液中乙醇浓度为22％，然后采用截留分子量为150da的纳滤膜进行纳滤浓缩处理，纳滤处理的压力为0.8mpa，得纳滤浓缩液；该步骤中，通过纳滤浓缩提高地诺前列酮的浓度，减小后续层析纯化处理的体积，提高纯化速率。s3、将纳滤浓缩液进行过柱，得过柱纯化液；将过柱纯化液放入旋蒸瓶进行一次减压旋蒸，其中，冷却水温度-10～-20℃，转速32rpm，温度25℃，压力18mbar(根据溶液沸腾状态压力从50mbar逐步降低压力到15mbar)；将经一次旋蒸后的料液至分液漏斗，按比例添加乙酸乙酯，通过振荡将有机相与水相混匀，静置分层，取上层有机相1，将水相按上述方法重复两次，得有机相2和有机相3；将有机相1、2、3混匀，进行二次减压旋蒸，除旋蒸压力为30mbar(根据溶液沸腾状态从100mbar缓慢下降至30mbar)，其他条件与一次减压旋蒸相同；旋蒸完全后，在旋蒸瓶内加入少量95％药用乙醇，将地诺前列酮复溶，得地诺前列酮的浓缩液。对比例与实施例1相比，区别仅在于s2中，将超滤透过液中采用截留分子量为150da的纳滤膜进行纳滤浓缩处理，超滤透过液中不添加乙醇；其余均相同。对本发明实施例1中的各步骤中地诺前列酮的浓度进行测试，检测结果见表1，高相液相色谱图见图3-4；对比例中的高相液相色谱图见图1-2；图1、2中高相液相色谱中色谱条件为：时间min乙腈％10mmol乙酸铵(ph＝4.0))％流速ml/min03070112955112.019551.2149551.21530701.21930701.2进样量：20ul；检测波长：210nm。图3-4中高效液相色谱条件为：流动相：乙腈：17mmol磷酸＝40：60，ph2.11；流速：1.3ml/min(等度)；进样量：20ul；检测波长：210nm。图1-2和图3-4中高效液相色谱其它条件均一致。表1超滤透过液和纳滤浓缩液中peg2浓度从表1和图1-4中可以看出，对未添加乙醇的超滤透过液难以采用纳滤进行高倍浓缩，添加乙醇后则有效提高其浓缩倍数。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页12