氯霉素的新型抗性基因及其应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，尤其涉及氯霉素的新型抗性基因及其应用。
背景技术：
：氯霉素类抗生素可作用于细菌核糖核蛋白体的50s亚基，而阻挠蛋白质的合成，属抑菌性广谱抗生素。细菌细胞的70s核糖体是合成蛋白质的主要细胞成分，它包括50s和30s两个亚基。氯霉素通过可逆地与50s亚基结合，阻断转肽酰酶的作用，干扰带有氨基酸的胺基酰-trna终端与50s亚基结合，从而使新肽链的形成受阻，抑制蛋白质合成。由于氯霉素还可与人体线粒体的70s结合，因而也可抑制人体线粒体的蛋白合成，对人体产生毒性。因为氯霉素对70s核糖体的结合是可逆的，故被认为是抑菌性抗生素，但在高药物浓度时对某些细菌亦可产生杀菌作用，对流感杆菌甚至在较低浓度时即可产生杀菌作用。氯霉素对革兰阳性、阴性细菌均有抑制作用，且对后者的作用较强。其中对伤寒杆菌、流感杆菌、副流感杆菌和百日咳杆菌的作用比其他抗生素强，对立克次体感染如斑疹伤寒也有效，但对革兰阳性球菌的作用不及青霉素和四环素。抗菌作用机制是与核蛋白体50s亚基结合，抑制肽酰基转移酶，从而抑制蛋白质合成。各种细菌都能对氯霉素发生耐药性，其中以大肠杆菌、痢疾杆菌、变形杆菌等较为多见，伤寒杆菌及葡萄球菌较少见。细菌对氯霉素产生耐药性比较慢，可能是通过基因的逐步突变而产生的，但可自动消失。细菌也可以通过r因子的转移而获得耐药性，获得r因子的细菌能产生氯霉素乙酰转移酶(acetyltransferase)使氯霉素灭活。技术实现要素：针对上述
背景技术：
，本发明目的是提供氯霉素的新型抗性基因，本发明是从鞘氨醇单胞菌中发现了氯霉素的新型耐药基因gmc基因，补充了氯霉素耐药的数据库，为对抗细菌耐药奠定基础。本发明第一个方面是提供新型抗性基因，所述抗性基因序列如seqidno.1所示，命名为gmc基因。本发明第二个方面是提供一种重组载体，所述重组载体包括第一个方面所述的新型抗性基因。本发明第三个方面是提供一种转化体，所述转化体含有第一个方面所述的新型抗性基因，或者第二个方面所述的重组载体。本发明第三个方面是提供一种鞘氨醇单胞菌的gmc基因作为耐药基因的应用，所述gmc基因序列如seqidno.1所示，所述耐药是指对氯霉素类抗生素耐药。与现有技术相比，本发明所具有的有益效果为：本发明新型抗性基因，发现了氯霉素的一个潜在的耐药基因，补充了氯霉素耐药的数据库，对了解氯霉素的耐药机制提供了帮助，也为以后科研人员解决氯霉素耐药提供靶点，为对抗细菌耐药奠定基础。附图说明图1为pbbr1mcs-2质粒示意图；图2为pbbr1mcs-2-gmc的重组质粒构建的流程图；图3为基因gmc构建成功的ncbi上blast序列比对结果图。具体实施方式下面通过具体实施方式例对本发明进行详细描述。本发明的范围并不受限于该具体实施方式。下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明所保护的范围。从环境中发现一株鞘氨醇单胞菌对氯霉素具有很高的耐药性，经基因组的三代测序后，没有在基因组上发现目前已知的耐药基因，之后通过rna的测序，发现gmc编码的氧化还原酶在抗生素的作用时，具有很高的转录表达量。为了具体研究氯霉素的新型抗性基因gmc基因的功能，本发明包括以下实施例：实施例1一、材料方法1.选择合适的载体选择pbbr1mcs-2质粒，如图1所示是pbbr1mcs-2质粒的示意图，该质粒是广宿主蛋白表达和克隆质粒，具有高拷贝、多克隆位点、稳表达和组成型质粒等特性。2.酶切引物的设计上游引物下游引物tcccccgggctgcaggaattctcagtggcttcttcggatcagaattc表示ecori酶切位点，表示sd序列，具有增强基因表达的功能，表示额外添加的起始密码子序列，防止插入外源序列基因不复制。启动子序列为质粒pbbr1-mcs2自带的lac启动子，tttacactttatgcttccggctcgtatgttg3.重组载体的构建3.1目的基因gmc的获取聚合酶链式反应(pcr)是一种用于放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术，能将微量的dna大幅增加。本试验采用20μl反应体系，20ul的pcr反应体系的基因组dna是利用天根基因组小提试剂盒提取鞘氨醇单胞菌的金银组dna为模板，如表1所示为20μlpcr反应体系，采用反应程序为：反应程序为：反应完成后将产物置于4℃冰箱保存即可。表120μlpcr反应体系3.2pbbr1mcs-2质粒提取采用pbbr1mcs-2质粒的细菌大肠杆菌dn5α，该菌种由实验室保存，将菌种接入5mllb培养液中，37℃，180rpm震荡培养过夜使其活化后，在超净台中吸取100l菌液接种至一新的lb培养液试管中，37℃，180rpm震荡扩大培养，3h后待菌液不再清亮即可进行后续操作。使用天根(tiangen)生化科技有限公司生产的质粒小提试剂盒，按以下步骤提取pbbr1mcs-2质粒。3.3载体与目的基因单酶切pbbr1mcs-2质粒上有一系列的不同的限制性内切酶的酶切位点，包括ecori限制性内切酶的酶切位点，切除后不影响质粒的自我复制。目的基因gmc基因在pcr大量扩增时设计的引物中已经引入了限制性内切酶ecori的特异性酶切位点。因此采用单酶切后目的基因两端和质粒的缺口能够特异性吻合，这为下一步的连接奠定基础。对目的基因gmc基因和载体的单酶切反应采用50μl的反应体系，如表2所示，加样后用移液枪轻轻吹打混匀，置于37℃水浴锅中进行酶切反应，4h后取出即可。表250μl的单酶切反应体系3.4回收酶切产物中加入终浓度为1x的loadingbuffer，用移液枪轻轻吹打混匀后，全部进行琼脂糖凝胶电泳，再使用天根(tiangen)生化科技有限公司生产的dna纯化回收试剂盒对紫外灯下电泳胶块上切下的高亮条带分别进行回收。3.5连接将载体与目的基因gmc基因连接构建成重组载体是使目的基因在表达菌株中大量表达的基础。连接的具体操作为：测定回收产物的浓度后，根据连接产物的摩尔比公式计算体系中各组分添加量。本次试验测得双酶切后gmc的浓度为84.3ng/μl，单酶切后的pbbr1mcs-2的浓度为46.1ng/μl。采用10μl体系，做四组平行试验，连接体系如表3所示，将产物依次加入到250μl小管中用移液枪轻轻吹打混匀后，将其置于4℃的冰箱中过夜，即可完成连接反应。表3酶切产物10μl连接体系3.6转化3.6.1制备dh5α感受态细胞重组载体要转入有活性的菌株中才能进行自我复制，因此首先要使细菌处于易于接受外源性质粒的状态即感受态。本试验采用大肠杆菌dh5α来作为重组载体复制的场所，用tss法来制备dh5α感受态细胞。具体操作步骤为：(a)取-50℃保存甘油菌，按1：100比例将过夜培养的菌液加入到两个盛有50ml新鲜lb培养液容积为250ml的三角瓶中，于37℃振荡(225rpm)培养至前指数期(od600约为0.3-0.4，培养时间2h-2.5h)，lb液体培养基为od值测量空白对照。(b)离心沉淀，1×tss溶液重悬细胞，分装保存至各转移至1个50ml洁净离心管中，冰浴15-30分钟使培养物降至0℃，4℃、1000g离心10min，弃上清，收获细菌。(c)加入5ml的1×tss液(冰预冷30min)悬浮细胞，冰上继续放置5-15min，制成感受态细胞。然后按100μl/份分装至预冷的1.5ml离心管中，即可用于转化，于-50℃冰箱中冻存。3.6.2转化dh5α感受态细胞通过转化能将重组载体导入受体菌继而得到含有目的dna插入的转化菌株，转化有多种方法，本试验用kcm法来进行转化操作。具体步骤为：(a)将盛有感受态细胞的ep管置于冰上，使其融化；(b)重新取1.5ml的离心管，加入20μl的5×kcm，5μl重组质粒，加ddh2o至100μl，混匀后放置冰中；(c)向上述ep管中缓慢均匀加入100μl感受态细，轻柔吹打混匀，继续冰上放置30min；(d)42℃热休克90s，再插入冰中30min(e)加入1ml37℃预热的lb培养液，放置于37℃摇床上90rpm培养20min，200rpm40min；(f)取100μl菌液，接种于含kan的lb平皿中或者将菌液8000rpm离心1min，用预热的lb重悬细菌，再将其接种于含kan的lb平皿上，在37℃培养箱倒置培养过夜。另以含有kan抗性lb作为ck1组(即空白对照组)，ck2涂有未转化dh5α感受态细胞，ck3为涂有空载体pbbr1mcs-2转化的大肠杆菌dh5α。如图2所示为构建得到的重组载体，即pbbr1mcs-2-gmc的重组质粒。3.6.4验证转化的目的是构建含有目的基因gmc的大肠杆菌dh5α菌株，因此对转化的结果要进行多种途径的检验，从而确定含有目的基因gmc的大肠杆菌dh5α菌株是否构建成功。其中，最有说服力的就是在已构建的菌株中含有目的基因gmc的序列。如表4所示为ncbi上blast比对的结果，从表4中可以看出，两个序列是一致的，基因gmc构建成功，基因gmc构建成功的ncbi上blast序列比对结果图如图3所示，从图3中可以看到比对上的序列信息。表4blast序列比对结果maxscoretotalcoverquerycoverevalueper.identaccession29642964100.00％0.0100.00％query_574474.mic验证基因功能将重组载体电转化到恶臭假单胞菌kt2中检测其对氯霉素的最小抑菌浓度mic值之后发现，含pbbr1mcs-2-gmc+质粒的kt2菌株对氯霉素的mic值能到240ug/ml，而不含pbbr1mcs-2-gmc+质粒的kt2菌株对氯霉素的mic值是2ug/ml。说明gmc编码的氧化还原酶基因使得菌株对氯霉素具有抗性，gmc也是氯霉素的潜在耐药基因。上面仅对本发明的较佳实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化，各种变化均应包含在本发明的保护范围之内。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。sequencelisting<110>清华大学深圳国际研究生院<120>氯霉素的新型抗性基因及其应用<130>2020<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>1605<212>dna<213>鞘氨醇单胞菌属<400>1gtgcaagatattagaactacggactttatcgtcgttgggggcggttcgagtggcgcggtg60gtcgcatctcggctaagcgaagagaagcgttttgaggtcgcgttgctcgaagccggcggg120tgggacagctcgcctttcattcggattccggcgggctcgatcaaagcgatcatgaatcct180gagtacaactggttctatcaagcggaaccggatgcctcacgaaacgatcgagcagacatg240tggccggccggcaaagtcctcggcggcggctcgtcgatcaacgggatgatgtatgttcgc300ggcaatcgcggcgattatgatcaatgggctcagctcggctgcaagggctggtcctatgac360gacgtgcttccgttctttaacaaggccgagacgaacgaaaacggcggctcgcgctttcgc420ggcgacaagggccctctgcgcgtatcgaatgcccgcctatcgaccacgttggccgacgca480ttcatcgcttctggcgtacgtgcggggattccgcacaatccggataccaacggtgccgag540caagagggtatcggcccctgccaagccacccagaacaagggttggcgacattcaacggca600cgcgcctatctggccaaggcgaagcgccgatccaatctgaaggtcgagacgcatttcatg660gtcagtcgggtactgatcgagaaaggccgcgcgatcggcgtcgaaggcgttcagaacggg720cgcacggttcgctacttggcaaacaaggaggtcattctttgcggcggcgcgttgtcgtcg780ccgaaaatattgatgctctcgggcattggcccggcaaagcatcttggcgagcatggcatc840cctgttgtcgtcgattccccgggagtggggcaaaatctgcaggaacatcccggagtgttg900atgtcgacccatgtcggcatcgatagcctcaatgtcgaagtgcaaagcgtcgccaggata960gtcaagcatggcttgaacttcgctttgtttgggcgagggccagccacggcatgcgttgcc1020tccgctctcgcgttcattcgcacgcgagaccatctcgagtggcccaacatccaactgtcg1080ttctcgccgatcgcgtacgacttcacgccggacggcgtacacctgtacaagcgtgcggca1140attggcgttgccatcaacatctgccggcccgagacgcgcggtcagttgctgctccgctcc1200accgatccaagtgagcggccgattatccaacatgagctgctcggcggagatgatgagatc1260aagcagctcatcgaaggatgccggatcgtgcgcaagattttccgttccaagccattcagt1320gaatatgacaaaggtgaacgcttacccggaaagcaggtcgaaaccgacgctgattggatc1380gagtatatccgtcagagcgccttcctgatgtaccacccgactggcacttgcgcgatggga1440attgggccgacagcggttctcgatccggagttgcgcgtcaagggcgtcaccggtcttcgc1500gttgcggatgcctcgatcatgccgacgctggttagcgcgaatacaaatgcaccgtgcatc1560atgattggcgaacgggcggccgatctgatccgaagaagccactga1605当前第1页12