一种定量检测样品中mTORmRNA相对表达量的试剂及检测方法与流程

mrna相对表达量的试剂和试剂盒。
[0008]
本发明提供了一种定量检测样品中mtor mrna相对表达量的试剂，包括检测用上/下游引物mtor-f/mtor-r和探针mtor-probe，以及内参用上/下游引物actin-f/actin-r探针actin-probe分别是：
[0009]
mtor-f：gggactacagggagaagaagaa
[0010]
mtor-r：gcatcagagtcaagtggtcatag
[0011]
mtor-probe：fam-tccttctcaacatcgagcatcgca-tamra
[0012]
actin-f：tgagcgaggctacagctt
[0013]
actin-r：tccttgatgtcgcgcacgattt
[0014]
actin-probe：fam-accaccacggccgagcgg-tamra。
[0015]
本发明提供了一种定量检测样品中mtor mrna相对表达量的试剂盒，包括rna提取液、检测体系pcr反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品；所述检测体系pcr反应液包括thunderbird probe qpcr mix(toyobo，qps-101)、检测用上/下游引物mtor-f/mtor-r和探针mtor-probe、内参用上/下游引物actin-f/actin-r探针actin-probe；其中，
[0016]
mtor-f：gggactacagggagaagaagaa
[0017]
mtor-r：gcatcagagtcaagtggtcatag
[0018]
mtor-probe：fam-tccttctcaacatcgagcatcgca-tamra
[0019]
actin-f：tgagcgaggctacagctt
[0020]
actin-r：tccttgatgtcgcgcacgattt
[0021]
actin-probe：fam-accaccacggccgagcgg-tamra。
[0022]
进一步地，检测用上下游引物和探针的比例优选为：mtor-f：mtor-r：mtor-probe的摩尔比为2：2：1。
[0023]
参照用上下游引物和探针的比例优选为：actin-f：actin-r：actin-probe的摩尔比为2：2：1。
[0024]
所述阳性对照品为含有mtor基因组的溶液；所述阴性对照品为无mtor基因组的溶液。
[0025]
rna提取液可用商业产品qiagen rneasy ffpe kit石蜡rna抽提试剂盒替代。
[0026]
本发明提供了一种定量检测样品中mtor mrna相对表达量的方法，其步骤如下：
[0027]
(1)提取样品中的组织rna；
[0028]
(2)将(1)中提取出的组织rna逆转录为cdna；
[0029]
(3)加入(2)中所述的cdna到反应管中，利用检测用检测用上/下游引物mtor-f/mtor-r和探针mtor-probe定量检测样本中的mtor融合基因表达量；利用内参基因内参用上/下游引物actin-f/actin-r探针actin-probe定量检测样本中的abl表达量，其中，
[0030]
mtor-f：gggactacagggagaagaagaa
[0031]
mtor-r：gcatcagagtcaagtggtcatag
[0032]
mtor-probe：fam-tccttctcaacatcgagcatcgca-tamra
[0033]
actin-f：tgagcgaggctacagctt
[0034]
actin-r：tccttgatgtcgcgcacgattt
[0035]
actin-probe：fam-accaccacggccgagcgg-tamra
[0036]
(4)计算样本中的pcm1-jak2融合基因相对表达量。
[0037]
本发明的有益效果：本发明根据临床上作为对照组的健康人样品的检测结果，统计出正常人的表达范围为(5.27
±
2.22)*10-4
。利用双标准曲线法，计算出样本中mtor的相对表达量，将检测结果与正常人的表达水平相比，能衡量受测者体内mtor基因表达水平是否正常，该方法是一种新型的用于评价患者mtor表达水平的方法，有助于患者的后期治疗方案的确定。相比于原有的单纯个体检测，参考本发明提供mtor正常表达范围，方便对受测者体内mtor基因相对表达量检测结果进行分析，有助于辅助临床上肿瘤患者的用药和预后判断。另外使用本发明的试剂盒，特异性好，灵敏度高，检测精准，而且操作简单，可降低检测成本，节约检测时间。
附图说明
[0038]
图1为mtor基因相对表达量高表达的样品检测示意图。
具体实施方式
[0039]
实施例1
[0040]
本发明的用于定量检测样品中mtor mrna相对表达量的试剂盒，包括：
[0041]
rna提取液：qiagen rneasy ffpe kit。
[0042]
检测体系pcr反应液：thunderbird probe qpcr mix(2
×
)、mtor上下游引物各0.16um、mtor-probe(探针)0.08um；actin上下游引物各0.16um、actin-probe(探针)0.08um；其中，
[0043]
mtor-f：gggactacagggagaagaagaa
[0044]
mtor-r：gcatcagagtcaagtggtcatag
[0045]
mtor-probe：fam-tccttctcaacatcgagcatcgca-tamra
[0046]
actin-f：tgagcgaggctacagctt
[0047]
actin-r：tccttgatgtcgcgcacgattt
[0048]
actin-probe：fam-accaccacggccgagcgg-tamra。
[0049]
阳性对照品：含mtor基因组溶液；
[0050]
阴性对照品：不含mtor基因组溶液。
[0051]
实施例2
[0052]
本发明试剂盒的使用方法：
[0053]
(1)抽提石蜡切片中的组织rna:切取组织或者石蜡片样本于1.5ml离心管中(刮拭)；加入1ml组织透明液，振荡混匀后13000rpm离心1min；去除上清，加入500ml组织透明液，振荡混匀后13000rpm离心1min；去除上清，加入1ml无水乙醇，振荡混匀后13000rpm离心1min；去除上清后于37度金属浴10min(开盖)，直至液体干燥；参考qiagen rneasy ffpe kit石蜡rna抽提试剂盒说明书，提取样本rna。
[0054]
(2)参考toyobo公司的revertra ace qpcr rt kit试剂盒说明书，将rna反转为cdna。
[0055]
(3)试剂配置：按检测人份数配置检测体系pcr反应液各x ul，每人份23ul分装：
[0056]
x＝23ul反应液
×
(8份内参(标准曲线)+8份目的基因(标准曲线)+n份标本+1份阳
性对照+1份阴性对照+1份空白对照)。
[0057]
(4)加样：加入检测体系pcr反应液中2ul cdna；阳性对照和阴性对照直接加2ul阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2ul生理盐水或不加任何物质。
[0058]
(5)检测：检测在实时荧光pcr仪上进行，可用仪器包括abi7300，7500(美国applied biosystems公司)等。反应条件：95℃预变性1min；95℃15s，58℃35sec 40个循环，荧光信号于58℃35sec时采集。
[0059]
(6)结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和ct值自动计算出拷贝数。按照以下公式进行计算mtor相对表达量：
[0060]
mtor相对表达量＝mtor起始拷贝数/actin起始拷贝数
[0061]
正常人的mtor相对表达量范围为(5.27
±
2.22)*10-4
，
[0062]
当mtor相对表达量<3.05*10-4
时，为低表达；
[0063]
当3.05*10-4
<mtor相对表达量<7.49*10-4
时，为正常表达；
[0064]
当mtor相对表达量>7.49*10-4
时，为高表达。
[0065]
实施例3
[0066]
采用本发明核酸检测方法检测临床标本
[0067]
取送检的肾肿瘤和甲状腺肿瘤患者的石蜡切片标本14例，按实施例2所述方法提取基因组rna、配制试剂并检测。
[0068]
每份检测体系pcr反应液中加入标本2ul，每个样本2次重复，内参基因/目的基因的标准曲线各一份，同时做一份阳性对照，一份阴性对照和一份空白对照。一台96孔的荧光pcr仪可同时检测20份样品，检测时间仅为60分钟。实验结果如下表1：
[0069]
表1为本次实验的结果
[0070]
样本mtor表达量actin表达量相对表达量*10000表达水平116.364610.5635.5高25.42098.4425.7高341.7111367.2936.7高44.482479.3118.1高54.11974.7542.2高610.91707.663.8高715.466252.5924.7高864.6124528.426.3高946.8713928.6733.7高10259.3855930.6346.4高11145.742744353.1高1266.9615691.2342.7高13161.2134120.8647.2高14150.670469.6521.4高
[0071]
样本检测结果显示：14个肿瘤样本的mtor基因的表达量均高于正常表达量，与免疫组化等其他检测方法的检测结果一致。从文献报道看，肿瘤患者的mtor信号通路的一般会出现表达异常的情况，mtor基因的表达量较高，本研究也发现检测的这14个肿瘤患者的
mtor基因的表达量较高。本研究正是因为有正常人表达量范围作为参照，最终能够对受测者的mtor表达水平进行评价，从而指导后期治疗与用药。该法不但结果准确性高，而且对于临床有一定的指导意义。
[0072]
实施例4临床样品检测
[0073]
样品1为经临床验证的甲状腺肿瘤患者的石蜡切片，按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。
[0074]
检测体系pcr反应液中加入样品cdna 2ul。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。用荧光pcr仪检测，时间为60分钟。
[0075]
样品1的检测结果图如图1所示，内参基因actin的扩增信号显示被检样本基因组提取成功。根据内参基因actin和目的基因mtor各自的定量标准曲线得到样品1的mtor基因的相对表达量为42.4*10-4
，高于正常人mtor基因相对表达量范围(5.27
±
2.22)*10-4
，因此样品1的mtor基因相对表达量为高表达。