一种人RNF20基因过表达质粒载体的构建及其抑制癌细胞的作用的制作方法

一种人rnf20基因过表达质粒载体的构建及其抑制癌细胞的作用
技术领域
[0001]
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人rnf20基因过表达质粒载体的构建过程及其抑制癌细胞的作用。


背景技术：

[0002]
在酵母和哺乳动物中，泛素是一种含有76个氨基酸多肽链的高度保守的生物大分子，其分子量为8.5kda。组蛋白泛素化是一个能量驱动的酶联反应过程，需要三类酶依次激活：泛素激活酶e1、泛素结合酶e2和泛素连接酶e3。目前研究较为充分的是组蛋白h2b单泛素化(h2bub1)，h2bub1在酵母中受e3泛素连接酶bre1调控，发生在组蛋白h2b第123位赖氨酸上，在哺乳动物中，发生于组蛋白h2b第120位赖氨酸上，主要受异源二聚体复合物rnf20/rnf40调控。
[0003]
rnf20(ring fingerprotein 20)是一种环指蛋白，由976个氨基酸残基组成，定位于人染色体9q31.1位置，属于ring结构域家族泛素连接酶，在转录的起始和延伸中均发挥重要作用。rnf20催化h2bub1形成，而后h2bub1分别与compass和dot1的cryo-em结构结合，compass和dot1作为一种dna甲基转移酶，分别催化h3k4和h3k79的甲基化，从而活化转录。此外，rnf20与paf1复合物的亚基cdc73相互作用，而后paf1复合物与tfⅱs相互作用使得rna聚合酶ⅱ松弛，从而促进转录延伸。
[0004]
免疫组化分析表明，大量原发肿瘤h2bub1表达下调或缺失，且h2bub1的缺失加速肿瘤的进程，催化h2bub1形成的rnf20基因可以选择性调控基因表达，被公认为肿瘤抑制子。鉴于人rnf20基因在肿瘤中的作用，构建一种能够高表达人rnf20基因的质粒载体，进而研究其在肿瘤发生发展中的作用机制至关重要。目前并没有构建人rnf20基因过表达载体的相关报导，本发明通过分子相关技术，构建了一种人rnf20基因过表达质粒载体，发现其在抑制癌细胞的增殖和迁移，促进癌细胞的凋亡中发挥重要作用。本发明应用分子生物学相关技术，为癌症的预防和治疗提供了一种新的思路，同时为抗癌药物或制剂的筛选和制备提供了一种新的方案。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种人rnf20基因过表达载体的构建方法及其抑制结肠癌细胞的作用研究。该质粒载体在构建时利用已有的双酶切技术，通过基因改造构建人rnf20基因过表达质粒载体，通过体外细胞实验，发现人rnf20基因在抑制癌细胞增殖和迁移，促进癌细胞凋亡方面发挥重要作用。
[0006]
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0007]
一种人rnf20基因过表达质粒载体，构建步骤如下：
[0008]
(1)结合pcmv-tag2b质粒和人rnf20片段基因图谱，设计人rnf20基因的上游引物seq id no.1和下游引物seq id no.2，以人间充质干细胞hmsc的cdna为模板，利用pcr技术
扩增该序列，获得人rnf20基因。
[0009]
(2)采用双酶切方法切割pcmv-tag2b质粒，使其线性化，然后用t4连接酶将人rnf20基因片段和线性化的pcmv-tag2b质粒拼接重组，构建人rnf20基因过表达质粒载体。
[0010]
运用相关分子技术，构建的人rnf20基因质粒载体，其特征在于，在pcmv-tag2b质粒载体上cmv启动子和cmv增强子的作用下，带动下游目的片段人rnf20基因的高表达。
[0011]
为了进一步探究人rnf20基因在癌症的发生发展中的作用，本发明选取人结肠癌hct116和ht29作为模型细胞。
[0012]
本发明取得的优点和积极效果为：
[0013]
1、本发明运用双酶切的方法，构建了一种人rnf20基因过表达质粒载体，能够显著提高肿瘤抑制子人rnf20基因在mrna水平和蛋白水平的表达量，在转染试剂turbofect的辅助下，该质粒载体能够高效导入结肠癌hct116和ht29细胞，特异性促进人rnf20基因的转录和翻译，升高人rnf20基因的表达水平，显著抑制结肠癌细胞的增殖和迁移能力，促进结肠癌细胞的凋亡。
[0014]
2、本发明构建的人rnf20基因过表达质粒载体，在抑制癌细胞方面发挥重要作用，可作为癌症治疗的潜在靶点，用于研究癌症发生发展中的相关信号通路，为癌症的预防和治疗提供了一种新的思路，同时为抗癌药物或制剂的筛选和制备提供了一种新的方案。
附图说明
[0015]
图1为pcmv-tag2b质粒dna图谱；
[0016]
图2为人rnf20基因dna图谱；
[0017]
图3为pcmv-tag2b质粒和构建成功的人rnf20基因过表达质粒的琼脂糖凝胶电泳图；
[0018]
图4为人rnf40基因过表达质粒转染人结肠癌ht29细胞24h后，rnf20 mrna的表达水平显著升高；
[0019]
图5为人rnf20基因过表达质粒转染人结肠癌hct116和ht29细胞24h后，显著抑制细胞的增殖；
[0020]
图6为人rnf20基因过表达质粒转染人结肠癌hct116和ht29细胞24h后，显著抑制细胞的迁移；
[0021]
图7为人rnf20基因过表达质粒转染人结肠癌hct116和ht29细胞24h后，显著促进细胞的凋亡。
具体实施方式
[0022]
下面结合具体实施方案对本发明作进一步的详细叙述，本实施例仅是为了叙述本发明，而不是限定本发明的范围。
[0023]
下述实施例中所使用的实验方法，若无特殊说明，均为常规实验方法。下述实施例中所使用的试剂和仪器，若无特殊说明，均为本实验室常用试剂和仪器，可以通过常规途径购买。
[0024]
本发明的设计思路是：运用双酶切的方法构建一种人rnf20基因过表达质粒载体，与转染试剂turbofect共同孵育，通过瞬转方法转染结肠癌细胞，在提高人rnf20基因表达
水平后，可以有效抑制结肠癌细胞的增殖和迁移，并促进结肠癌细胞的凋亡。
[0025]
实施例1：人rnf20基因过表达质粒载体的制备
[0026]
1、人rnf20基因的制备
[0027]
从ncbi网站的genbank中选取人rnf20(nm_019592.7)基因的编码区序列，运用primer5软件，根据pcmv-tag2b质粒载体图谱，结合本实验室现有的限制性内切酶，选取bamhⅰ和hindⅲ两个酶切位点，设计人rnf20基因的上游引物和下游引物。以人间充质干细胞hmsc的cdna为模板，利用pcr技术扩增该序列，获得目的基因，即人rnf20基因。其中，运用primer5软件设计的人rnf20基因的上游引物序列为seq id no.1，下游引物序列为seq id no.2，利用pcr技术进行序列扩增的反应体系如表1所示，利用pcr技术扩增序列的反应条件如表2。
[0028]
表1：pcr扩增序列反应体系
[0029][0030][0031]
表2：pcr扩增序列反应条件
[0032][0033]
2、重组质粒的制备
[0034]
用限制性内切酶bamhⅰ和hindⅲ37℃切割pcmv-tag2b质粒2h，将其线性化后与纯化后的人rnf20基因双链dna oligo，运用t4连接酶16℃过夜连接，将连接产物转化入新鲜大肠杆菌dh5α感受态细胞中，涂布在含有卡那霉素的lb平板上，筛选出含有重组质粒的菌株。
[0035]
挑取单个单克隆至含有卡那霉素的lb液体培养基中，置于37℃摇床培养12-16h，收集含有重组质粒的大肠杆菌菌体，提取质粒。运用双酶切方法验证，将验证后的阳性重组质粒送公司测序，运用dnaman软件将测序结果与人rnf20基因的序列比对，比对正确的阳性重组质粒即为人rnf20基因过表达质粒载体，将其命名为pcmv-tag2b-rnf20，保存于-20℃，重组菌置于15-30％的甘油中，-80℃保存。
[0036]
其中，双酶切的反应体系如表3所示，t4连接酶的连接体系如表4所示，pcmv-tag2b
为公开获取的质粒，dna图谱如图1，rnf20基因为公开基因，dna图谱如图2，pcmv-tag2b和pcmv-tag2b-rnf20的琼脂糖凝胶电泳图如图3。
[0037]
表3：双酶切反应体系
[0038][0039]
表4：t4连接酶连接体系
[0040][0041]
实施例2：运用实时荧光定量rt-pcr检测转染pcmv-tag2b-rnf20质粒载体后人rnf20基因的高表达效率
[0042]
用胰酶将处于对数生长期的人ht29细胞消化下来，用含有10％ausgenex血清的d-mem/f-12培养基制备成细胞悬浮液，以每孔1.2
×
106个细胞接种于6孔板中，然后将其放置于37℃，5％co2的培养箱内培养，使其细胞贴壁。待细胞密度生长到70-80％时可以开始转染，根据质粒浓度和转染试剂turbofect的说明书，按照转染体系制备转染混合物。其中，6孔板转染体系如表5所示。
[0043]
表5：6孔板转染体系
[0044]
[0045]
将前述转染混合物置于37℃，5％co2的培养箱内孵育20min，然后转入ht29细胞中，再加入基础培养基补足至每孔2ml，培养6h后，用含有10％ausgenex血清的d-mem/f-12培养基洗去转染复合物，放入37℃，5％co2的培养箱内继续培养24h，收取细胞。根据trizol试剂的使用说明书，抽提总rna。根据m-mlv逆转录酶的使用说明书，将rna逆转录为cdna，在37℃水浴锅中反应1h，然后在70℃水浴锅中水浴10min使逆转录酶失活。其中，逆转录体系如表6。
[0046]
表6：逆转录体系
[0047][0048]
通过网站在线设计rnf20基因的上游rt引物，序列为seq id no.3和下游rt引物，序列为seq id no.4，此外，设计gapdh基因的上游rt引物，序列为seq id no.5和下游rt引物，序列为seq id no.6，并以gapdh基因为内参基因，运用rt-pcr仪器实时定量检测人rnf20基因。其中，rt-pcr反应体系如表7，rt-pcr仪器反应条件如表8。
[0049]
表7：rt-pcr反应体系
[0050][0051]
将rt-pcr仪器的程序设置为：预变性95℃，2min；之后进行40个循环，每个循环为变性95℃，10sec，退火延伸60℃，30sec；pcr结束后，95℃变性1min，接着冷却至55℃，使得dna双链充分结合；从55℃开始到95℃，每一步增加0.3℃，保持1min，同时读取吸光值。采取δδct法分析计算人rnf20基因的mrna水平，结果如图4所示，与转染了pcmv-tag2b质粒的
rnf20质粒的hct116和ht29结肠癌细胞，在培养12、24、48h后，癌细胞的迁移受到明显抑制，远低于对照组癌细胞的迁移速度，表明人rnf20基因过表达导致癌细胞的迁移能力被抑制。
[0062]
实施例5：检测转染了pcmv-tag2b-rnf20质粒对癌细胞凋亡的影响
[0063]
用胰酶将处于对数生长期的人hct116和ht29细胞消化下来，分别用含有10％ausgenex血清的d-mem/f-12培养基和含有10％ausgenex血清的dmem高糖培养基制备成细胞悬浮液，以每孔1.2
×
106个细胞接种于6孔板中，然后将其放置于37℃，5％co2的培养箱内培养，使其细胞贴壁。待细胞密度生长到70-80％时可以开始转染，根据质粒浓度和转染试剂turbofect的说明书，按照表5所示转染体系制备转染混合物。
[0064]
将前述转染混合物置于37℃，5％co2的培养箱内孵育20min，然后转入hct116和ht29细胞中，再分别加入d-mem/f-12基础培养基和dmem高糖基础培养基补足至每孔2ml，培养6h后，分别用含有10％ausgenex血清的d-mem/f-12培养基和含有10％ausgenex血清的dmem高糖培养基洗去转染复合物，放入37℃，5％co2的培养箱内，继续培养24h后，收集并用pbs清洗细胞，然后加入annexin v-fitc和pi，室温避光孵育后使用流式细胞仪检测，结果如图7所示。
[0065]
如图7结果所示，与转染了pcmv-tag2b质粒的对照癌细胞相比，转染pcmv-tag2b-rnf20质粒的hct116和ht29结肠癌细胞，在培养24h后，癌细胞凋亡细胞增加，表明人rnf20基因过表达促进癌细胞的凋亡。
[0066]
序列表：
[0067]
seq id no.1：5
’-
cgcggatccatgtcaggaattggaaataaaagagcagc-3
’
[0068]
seq id no.2：5
’-
cccaagctttcaaccaatgtagatgcgatgaaaatc-3
’
[0069]
seq id no.3：5
’-
cagtctgtatggcggcacaa-3
’
[0070]
seq id no.4：5
’-
tccgcaattccaccttcagc-3
’
[0071]
seq id no.5：5
’-
cgagatccctccaaaatcaa-3
’
[0072]
seq id no.6：5
’-
ttcacacccatgacgaacat-3
’
[0073]
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。