一种Rab23的shRNA及其慢病毒载体和应用的制作方法

专利名称：一种Rab23的shRNA及其慢病毒载体和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于皮肤鳞癌防治技术领域，涉及一种Rab23的shRNA及其慢病毒载体和应用。
背景技术：
Rab23是RAS原癌基因成员，其编码的蛋白是小GTP酶超家族Rab家族成员，其突变可引起小鼠开脑综合征(open brain syndrome),因此又称为opb基因。2001年，Eggenschwiler等研究发现,Rab23是Sonic Hedgehog信号通路必要的负调控因子,而近几年，Rab23作为原癌基因的作用越来越被学者重视。研究发现，Rab23参与肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、和甲状腺癌的发生发展，并在胃癌中首次发现与肿瘤侵袭密切相关。现有技术中，有学者直接将化学合成的SiRNA片段转染哺乳动物细胞能特异性抑制细胞内同源基因的表达，但转染效率低、细胞内siRNA片段很容易被降解，因此这种方法不能实现稳定的RNA干扰。慢病毒载体在哺乳动物体内感染效率高、免疫原性低、且能感染分裂相和非分裂相细胞。由于病毒载体的这些特性，慢病毒介导RNA干扰能在各类哺乳动物细胞长期稳定表shRNA，抑制基因表达，具有高效、稳定、特异性强、适用范围广的特点，已成为RNA干扰技术的主要研究工具。RNA干扰技术在生物医药研究上的应用为临床肿瘤的应用基础研究增加了强有力的手段。

发明内容
本发明解决的问题在于提供一种Rab23的shRNA及其慢病毒载体和应用，该慢病毒载体的转染能够抑制鳞癌细胞中的Rab23基因的表达，抑制鳞癌细胞的侵袭。本发明是通过以下技术方案来实现一种干扰Rab23基因的shRNA，该shRNA是针对Rab23基因的靶点序列形成的短发卡RNA,所述的祀点序列为gcgacaaatt caagttaat。所述的Rab23的shRNA，其中的一条链的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I或SEQ.ID. NO. 2 所示。一种干扰Rab23基因的载体，该载体包含由SEQ. ID. NO. I和SEQ. ID. NO. 2所示的序列构成的双链shRNA。所述的干扰Rab23基因的载体，该载体为GV248_Rab23_shRNA，是在GV248载体中克隆入由SEQ. ID. NO. I和SEQ. ID. NO. 2所示的序列构成的双链shRNA。一种抑制鳞癌细胞的重组慢病毒，是由包装质粒Helper I. O、Helper 2. O表达的蛋白包裹含有GV248-Rab23-shRNA载体的基因组；该慢病毒是将GV248-Rab23-shRNA表达质粒与包装质粒Helper I. O,Helper 2. O混合感染宿主细胞，经培养后裂解而产生。 针对Rab23基因靶点序列的干扰shRNA作为抗皮肤鳞癌药物的制备的应用。所述的祀点序列为gcgacaaattcaagttaat。
所述的干扰shRNA为由SEQ. ID. NO. I和SEQ. ID. NO. 2所示的序列构成的短发卡RNA。所述的干扰shRNA包装为慢病毒由包装质粒Helper I. 0> Helper 2. O表达的蛋白包裹含有GV248-Rab23-shRNA载体的基因组。所述的抗皮肤鳞癌药物为抗鳞癌细胞侵袭性的药物。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果本发明提供的干扰Rab23基因的shRNA及其抗皮肤鳞癌的应用是基于Rab23蛋白的表达与皮肤鳞癌的发展正相关，尤其是与鳞癌的侵袭能力相关，干扰Rab23蛋白的表达能够使鳞癌细胞的侵袭能力下降。所述的相关性表现为使用免疫组织化学的方法检测手术切除后人正常皮肤、皮肤鳞癌的癌前病变光 线性角化病、原位鳞癌和侵袭性鳞癌组织中Rab23的表达差异，结果表明人正常皮肤中不表达Rab23蛋白，光线性角化病组织中Rab23蛋白低表达，原位鳞癌和侵袭性鳞癌组织中Rab23蛋白高表达，侵袭性鳞癌组织中Rab23蛋白表达量明显高于原位鳞癌组织。Rab23蛋白的表达与皮肤鳞癌的发展正相关提示Rab23基因或蛋白能够作为皮肤鳞癌防治的靶点。进一步,本发明提供了针对Rab23基因的特异性短发卡RNA (short hairpin RNA,shRNA)，然后构建载有该shRNA的慢病毒载体，使用针对Rab23基因的shRNA的慢病毒载体、辅助质粒Helper I. O和Helper 2. O包装慢病毒并感染鳞癌细胞，导入鳞癌细胞中后，能够有效的抑制鱗癌细胞中的Rab23的表达。而且慢病毒感染后，能够持续抑制的鱗癌稳转细胞，通过Transwell侵袭实验发现鳞癌细胞的侵袭能力明显下降。这表明所构建的慢病毒能够应用于鳞癌细胞的防治，或者抗鳞癌细胞药物的制备。


图I为免疫组织化学的方法检测正常皮肤、皮肤鳞癌的癌前病变光线性角化病、原位鳞癌和侵袭性鳞癌组织中Rab23的表达差异结果图；图2为GV248质粒的质粒图谱示意图；图3 为 Western-blot 检测 GV248_Rab23_shRNA 质粒 RNA 干涉效果结图；图4为Helperl. O质粒的质粒图谱示意图；图5为Helper2. O质粒的质粒图谱示意图；图6-1 图6-2为HSQ-89NC及Rab23_shRNA稳转细胞结果图；图7-1 图7-3为Rab23干扰降低鳞癌细胞侵袭性的结果图。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述，所述是对本发明的解释而不是限定。I、Rab23蛋白的表达与皮肤鳞癌的相关性正常皮肤、皮肤鳞癌的癌前病变光线性角化病、原位鳞癌和侵袭性鳞癌组织中Rab23的表达差异收集手术切除后正常皮肤组织(Normal) 31例，皮肤鳞癌的癌前病变光线性角化病组织(AK) 31例，原位鳞癌组织(Bowen’s)42例，侵袭性鳞癌组织(SCC)45例。经15%福尔马林固定，行石蜡包埋后切片。石蜡切片经二甲苯及梯度乙醇脱蜡复水后，柠檬酸缓冲液煮沸做抗原修复，10% BSA封闭37°C lh，加入工作浓度为I μ g/ml的小鼠抗人Rab23 —抗，4°C孵育过夜。加入I : 1000稀释后的HRP标记的羊抗小鼠二抗37°C孵育2小时。PBS洗涤后，用DAB溶液显色，室温3-5分钟，自来水冲洗后作苏木精衬染，二甲苯透明化后中性树胶封片。显微镜下观察，根据着色程度判定Rab23表达程度。如图I的免疫组化结果所示，Rab23在正常皮肤中不表达，皮肤鳞癌的癌前病变光线性角化病中低表达，而在原位鳞癌及侵袭性鳞癌中表达明显增加；并且侵袭性鳞癌组织中Rab23蛋白表达量明显高于原位鳞癌组织。Rab23蛋白的表达与皮肤鳞癌的发展正相关提示Rab23基因或蛋白能够作为皮肤鳞癌防治的靶点。进一步分析发现，Rab23的表达与鳞癌细胞的分化程度呈负相关，即鳞癌分化程度越低，Rab23的表达越强。而且，曝光部位的鳞癌组织中Rab23表达也显著增加，这些均提示Rab23表达可能与鳞癌的侵袭性有关。2、Rab23基因的shRNA序列的设计及载体的构建 2. I设计针对人Rab23基因shRNA序列从genebank 中调取 human Rab23 基因序列(NM_016277),根据 Rab23CDS 序列，使用BLOCK-iT RNAiDesigner在线软件设计针对Rab23基因RNAi的有效靶点，筛选的靶点序列为 GCGACAAATTCAAGTTAAT。随后设计合成特异性短发卡RNA，所述短发卡RNA由一正义链和一反义链组成正义链5' -C c ggGAGCGACAAATTCAAGTTAATct cgagATTAACTTGAATTTGTCGCTCtttttg-3'反义链5' -aattcaaaaaGCGACAAATTCAAGTTAATCTCGAGATTAACTTGAATTTGTCGC-3/2. 2 构建 GV248-Rab23_shRNA 重组质粒取合成并纯化的正义链和反义链片段溶解于退火缓冲液中，90°C水浴15min，然后自然况却至室温，退火形成互补双链。将Age I和EcoR I双酶切后纯化的GV248质粒(质粒结构如图2)和退火形成的互补双链以I : 2比例混匀，用T4连接酶连接过夜，转化进DH5 α感受态细胞，用氨苄青霉素筛选含有形成GV248-Rab23-shRNA重组质粒单菌落，挑取单菌落培养，提取质粒并进行序列测定，与合成片段对比后确认合成序列正确，无基因突变。将GV248-Rab23_shRNA载体转染HSQ-89鳞癌细胞，筛选出成功转染的阳性细胞后，在以未转染的细胞作为对照，Western-blot检测细胞中的Rab23蛋白的表达。检测的结果如图3所示，可以看到对照细胞中的Rab23蛋白正常表达，而转染载体的细胞对Rab23基因进行干涉后，Rab23蛋白几乎不表达。这表明所构建的载体能够干扰Rab23基因的表达，从而抑制Rab23蛋白的表达。2. 3 包装 GV248-Rab23_shRNA 重组病毒颗粒I.转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10%血清的高糖DMEM培养基调整细胞密度为I. 2X IO7个/ml，重新接种于15cm细胞培养皿，37°C、5% CO2培养箱内培养。24h待细胞密度达70% 80%时即可用于转染。2.转染前2h将细胞培养基更换为无血清的高糖DMEM培养基。
3.向一灭菌离心管中加入各DNA溶液GV248_Rab23_shRNA质粒20 μ g, Helper
I.O质粒(商购，其质粒结构如图4所示)15 μ g，Helper 2. O质粒(商购，其质粒结构如图5所示)10 μ g，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为2. 5ml，在室温下温育5分钟。4.将 Lipofectamine 2000 试剂轻柔摇勻，取 100 μ I Lipofectamine 2000 试剂在另一管中与2. 4ml Opti-MEM混合，在室温下温育5分钟。5.把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合,轻轻地颠倒混勻。6.混合后，在室温下温育20分钟，以便形成DNA与Lipofectamine2000稀释液的 转染复合物。7.将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37°C,5% CO2细胞培养箱中培养。8.培养8h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20ml的PBS液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。9.每瓶细胞中加入含10%血清的高糖DMEM细胞培养基25ml，于37°C、5% C02培养箱内继续培养48小时。10.收集转染后48小时的293T细胞上清液。11.于4°C，4000g离心lOmin，除去细胞碎片。12.以0.45 μ m滤器过滤上清液于40ml超速离心管中。13.将病毒上清做50000rpm超速离心，吸取病毒上清层。14.采用孔稀释法测定毒滴度，用PBS调整病毒滴度为I X 108Tu/mL,分装后_80°C冻存。3、重组慢病毒感染鳞癌细胞及Tanswell侵袭实验I.病毒感染前一天，消化生长状态良好的HSQ-89细胞，使用96孔板中的9个孔(NC对照病毒组3孔、GV248-Rab23-shRNA重组病毒组3孔、Mock对照组3孔)，每个孔加IXlO4个细胞，体积为90 μ I。2. NC对照病毒组、Rab23-shRNA重组病毒组每孔加入10 μ I IX 108Tu/mL的NC对照病毒和GV248-Rab23-shRNA重组病毒，Mock对照组每孔加入10 μ I培养液。3.感染8h后，弃培养液，加入100 μ I新鲜培养液，于37°C、5% CO2培养箱内继续培养72小时，倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达，带有绿色荧光的细胞即为病毒感染成功的细胞。4. NC对照病毒组、Rab23-shRNA重组病毒组每孔加入2. 5 μ g/ml浓度的嘌呤霉素杀死未感染的鳞癌细胞HSQ-89，于37°C、5% CO2培养箱内继续培养48小时，倒置荧光显微镜下观察正常视野和荧光视野下细胞绿色荧光蛋白表达，正常视野下的细胞在荧光视野下都带有绿色荧光即为获得的HSQ-89NC(如图6-1所示)及HSQ-89Rab23_shRNA稳转细胞(如图6-2所示)。5.由于肿瘤细胞通过膜表面特定受体与Transwell小室上室面中的基质粘连,而后可以释放蛋白水解酶或激活基质中已存在的酶原，降解基质，进而细胞运动到被水解的基质空隙处。这个过程不断重复，肿瘤细胞最终穿过基质进入Transwell小室下室面，穿过的肿瘤细胞越多说明肿瘤细胞的侵袭能力越强。为此选择孔径为8 μ m的Transwell小室，使用BD公司的基质胶与无血清高糖DMEM培养基I : 8稀释包被基质胶，37°C风干，使用前用高糖DMEM水化基底膜。6.分别常规消化HSQ-89NC细胞和HSQ_89Rab23_shRNA细胞，PBS洗2遍，用无血清高糖DMEM培养基重悬，调整细胞浓度至5 X IO5个/ml，然后分别加入到不同的Transwell小室中上室加入细胞悬液200 iil，下室加入含10% FBS的高糖DMEM培养基900 iil，确保
下室培养液与小室间无气泡，常规培养。
7.每隔4h取出一个样本观察，下室有适量细胞且无增殖时终止培养。取出小室，棉签轻轻擦去小室上室面细胞，100%甲醇固定30min，0.4%结晶紫染色液染色15min，清洗，晾干后倒置显微镜下拍照并计数，采用Prism 5. 0统计软件作图并使用独立样本t检验分析两组数据差异。如图7结果所示HSQ-89Rab23-shRNA稳转细胞(图7-2)与HSQ-89NC稳转细胞(图7-1)相比Transwell小室中由上室面穿出至下室面的细胞数较对照组明显减少，随机选取10个视野拍照并计数，采用Prism 5. 0统计软件作图并使用独立样本t检验分析两组数据差异，结果显示HSQ-89Rab23-shRNA稳转细胞较HSQ-89NC稳转细胞袭能力下降，两组数据就有统计学差异，P <0.05以*表示(图7-3)。以上实验结果表明下调Rab23基因表达后HSQ-89鳞癌细胞的侵袭能力明显降低，Rab23基因可作为抑制鳞癌侵袭的靶分子。鉴于Rab23基因与皮肤鳞癌的发展正相关，针对Rab23基因进行干扰能影响、阻断皮肤鳞癌的发展；而对于侵袭性鳞癌细胞，干扰Rab23基因能够降低鳞癌细胞的侵袭性，因此该技术可与化疗药物联用进行鳞癌的治疗，也可以作为手术后防止鳞癌细胞侵袭的辅助治疗手段。因此，针对Rab23基因靶点序列的shRNA能够应用于皮肤鳞癌的防治，是潜在的新型抗皮肤鳞癌药物。
权利要求
1.一种干扰Rab23基因的shRNA，其特征在于，该shRNA是针对Rab23基因的靶点序列形成的短发卡RNA,所述的祀点序列为gcgacaaatt caagttaat。
2.如权利要求I所述的干扰Rab23的shRNA，其特征在于，所述的shRNA为短发卡RNA，其中的一条链的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I或SEQ. ID. NO. 2所示。
3.一种干扰Rab23基因的载体，其特征在于，该载体包含由SEQ. ID. NO. I和SEQ.ID. NO. 2所示的序列构成的shRNA。
4.如权利要求3所述的干扰Rab23基因的载体，其特征在于，该载体为GV248-Rab23-shRNA,是在GV248载体中克隆入由SEQ. ID. NO. I和SEQ. ID. NO. 2所示的序列构成的shRNA。
5.一种抑制鳞癌细胞的重组慢病毒，其特征在于，是由包装质粒Helperl. O、Helper2. O表达的蛋白包裹含有GV248-Rab23-shRNA载体的基因组； 该慢病毒是将GV248-Rab23-shRNA表达质粒与包装质粒Helper I. O,Helper 2· O混合感染宿主细胞，经培养后裂解而产生。
6.针对Rab23基因靶点序列的shRNA作为抗皮肤鳞癌药物的制备的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的祀点序列为gcgacaaattcaagttaatο
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的shRNA为由SEQ.ID. NO. I和SEQ.ID. NO. 2所示的序列构成的短发卡RNA。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的shRNA包装为慢病毒由包装质粒Helper I. O, Helper 2· O表达的蛋白包裹含有GV248_Rab23_shRNA载体的基因组。
10.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的抗皮肤鳞癌药物为抗鳞癌细胞侵袭性的药物。
全文摘要
本发明公开了干扰Rab23基因的siRNA，该siRNA是针对Rab23基因的靶点序列形成的发卡RNA，所述的siRNA为双链siRNA，其中的一条链的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1或SEQ.ID.NO.2所示。Rab23蛋白的表达与皮肤鳞癌的发展正相关，尤其是与鳞癌的侵袭能力相关，干扰Rab23蛋白的表达能够使鳞癌细胞的侵袭能力下降。针对Rab23基因靶点序列的干扰shRNA作为抗皮肤鳞癌药物的制备的应用。
文档编号A61K48/00GK102643819SQ201210123970
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月25日 优先权日2012年4月25日
发明者刘博强, 唐利, 李承新, 简强, 苗叶, 薛柯 申请人:中国人民解放军第四军医大学