专利名称：一种猪内源性反转录病毒载体及其构建方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及反转录病毒载体及其构建方法，特别是涉及猪内 源性反转录病毒载体及其构建方法。
背景技术：
反转录病毒载体是临床基因治疗试验中较常使用的基因转移载体，与其它非病毒 载体和病毒载体相比具有许多独特的优点，包括可高效转导多种类型的细胞、能够整合进 宿主细胞染色体中并长期稳定表达其携带的外源基因。目前人们使用的反转录病毒载体中 都移除了结构蛋白编码序列gag、poKerw基因的大部分，使病毒丧失复制形成病毒粒子的 能力。载体包装系统中需包括这三种病毒结构蛋白，方法是构建表达这三种蛋白的共转 染质粒，或将这三种基因预先整合到包装细胞系中。病毒结构还应包括必须的包装病毒RNA 的序列(包装信号Ψ+)、编码病毒RNA的反转录以及前病毒整合的序列(长末端重复序列 LTR, RNA引物结合位点PBS以及聚嘌呤区域PP)。绝大多数反转录病毒载体都是基于莫罗尼小鼠白血病病毒(Mo-MLV)构建的，含 有延伸包装信号(extended Ψ+)，普遍认为它能提高定位于gag基因开放读码框(ORF)上 的RNA分子在核质传输中的效率，并且能增加病毒滴度。延伸包装信号(extended Ψ+)即 包装信号(Ψ+)延伸至gag基因编码区的5’端，gag基因起始密码子ATG需突变为终止密 码子TAG，以防止野病毒(RCR)的产生。小鼠干细胞病毒(MSCV)载体来源于小鼠胚胎干细胞病毒(MESV)以及LN系列反 转录病毒载体(L代表逆转录病毒的LTR，具有启动子功能，N代表了 neo基因)。MSCVne0载 体转染到包装细胞系后瞬时表达或者整合后稳定表达，载体包含延伸的包装信号Ψ+，新霉 素抗性基因，以及目的基因。该载体通过一段经特殊设计的5’长末端重复序列(LTR)在造 血和胚胎细胞中稳定高表达。LTR使目的基因在干细胞或者其他哺乳动物细胞系中高水平 持续表达。目的基因被插入到LTR下游调控序列-多克隆位点(MSC)中。鼠磷酸甘油酸脂 激酶(PKG)启动子调控其下游序列在真核细胞中用于抗性筛选的新霉素抗性基因(NecZ)。 MSCVneo载体还包含有大肠杆菌质粒骨架，包括大肠杆菌(E. coli ori.)和氨苄青霉素抗 性β内酰胺酶基因(Amp1O。反转录病毒的整合可以发生在基因组的任何位置，存在着激活原癌基因的潜在危 险性。猪内源性反转录病毒(PERV)是在长期的进化过程中整合进猪基因组中的前病毒序 列，迄今为止，未有文献报道PERV在猪体内的整合能引发猪体的病变或变异(如原癌基因 的激活等)，由此看来，与其它常用的反转录病毒相比，用PERV构建载体可能具有更好的安 全性。目前，已经发现多群PERV，包括Y群的1 5亚群、β群的1 4亚群 等。Akiyoshi(Akiyoshi DE, et al. Identification of a full-length cDNA for an endogenousretrovirus of miniature swine. J Virol, 1998, 72 (5) :4503_4507·)等克隆的小型猪PERV-MSL的序列长度为8132bp。与其它反转录病毒相似，PERV的基因组结构包 括 5，区、gag、pol、env、3，区等 5 部分。1997年，PERV在体外对人源细胞具有感染性的发现，引起了人们对猪-人异种移 植病原安全性的广泛性关注，也使得PERV的研究成为了一个热点问题。经过了几年的努 力，有关PERV的生物学及分子生物学特性已比较清楚，对其遗传背景及特性也比较清晰。 PERV感染的人源细胞从其生长特性及折光性上均未发现变化，且感染的细胞也无细胞病 变的发生，对其病原性的评估还未有一致的结论。应该指出的是，人与猪有着几千年的亲 密接触史，至今未见PERV感染人的报道，Heneine等(Heneine W, et al. No evidence of infection with porcine endogenous retrovirus inrecipients of porcine islet-cell xenografts. Lancet. 1998,352(9129) 695-9.)曾对接受过猪胰岛移植的160例糖尿病病 人进行了多年的跟踪检测，未发现有PERV感染的证据，这暗示着PERV对人致病的可能性很 小。由于PERV是以前病毒的形式存在于猪细胞基因组中的，根据基因同源重组的原 理，在PERV清晰的分子生物学背景的基础上，用其构建新型的反转录病毒载体，对于转基 因猪及PERV生物学特性的研究具有重要的意义。目前，国际上对PERV的研究均着眼于异种移植中其病原安全性的评价等方面，至 今尚未见有利用其作为反转录病毒载体的报道。
发明内容
本发明提供了在猪源细胞中特异表达或可在其它哺乳动物细胞表达的质粒型反 转录病毒载体PM-I。本发明所提供的猪内源性反转录病毒载体PM-I由下列DNA元件组成DPERV 的 5，LTR 启动子；2) MSCVneo 的延伸包装信号(extended Ψ+);3)小鼠磷酸甘油酸脂激酶(PGK)启动子及位于PGK启动子下游并受其调控的新霉 素抗性基因(neor)；4) PERV的聚嘌呤区域PP及其3，LTR启动子；5)大肠杆菌质粒骨架，包括大肠杆菌(E. coli ori.)和氨苄青霉素抗性β内酰胺 酶基因(Ampr)。具体来讲，所述反转录病毒载体PM-I的核苷酸序列如序列表中序列11所示。本发明还提供了上述猪内源性反转录病毒载体PM-I的构建方法。本发明所提供的构建方法，包括以下步骤1)按照猪PERV全基因序列与MSCVne0序列设计5对引物，扩增P_5，LTR片段的引 物对具有序列表中序列1和序列2的核苷酸序列，扩增Ψ片段的引物对具有序列表中序列 3和序列4的核苷酸序列，扩增P_3’LTR片段的引物对具有序列表中序列5和序列6的核苷 酸序列，扩增neo片段的引物对具有序列表中序列7和序列128的核苷酸序列，扩增O-Amp 片段的引物对具有序列表中序列9和序列10的核苷酸序列，然后PCR扩增得到P-5’ LTR、 Ψ、P-3，LTR、neo 和 O-Amp 片段；2)通过重叠PCR技术及酶切连接的方法构建出猪内源性反转录病毒载体PM-1。
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在上述载体的构建方法中，所述步骤1)的PCR反应体系包括0. 5 μ 1 cDNA(100ng/y 1)，弓I物R禾口 F各1μ 1(20μΜ)，4μ 1 dNTP (2. 5mM), 0. 5 μ 1 Super-Ltaq DNA 聚合酶，5 μ 1 10XPCR Buffer，38 μ 1灭菌水。PCR反应条件为先94°C变性3min ；然后 940C 30s, 560C 45s, 72°C lmin30s，30 个循环；最后 72°C 7min。步骤2)的重叠 PCR 的反应体系包括0. 5 μ 1 cDNA 1 (lOOng/ μ 1) +0. 5 μ 1 cDNA2 (lOOng/ μ 1)，弓 | 物 R 禾口 F 各 1 μ 1 (20 μ Μ)，4 μ 1 dNTP (2. 5mM)，0· 5 μ 1 Super-Ltaq DNA聚合酶，5μ1 IOXPCR Buffer，37. 5 μ 1灭菌水。反应条件为先94°C变性3min ；然后 940C 30s, 560C lmin，72°C lmin30s，30 个循环；最后 72°C 7min。含有猪内源性反转录病毒载体PM-I的表达载体、转基因细胞系和宿主菌也属于 本发明的保护范围。上述在猪源细胞中特异表达或可在其它哺乳动物细胞表达的质粒型反转录病毒 载体PM-I可在多克隆位点处插入外源基因。本发明提供了在猪源细胞中特异表达或可在其它哺乳动物细胞表达的质粒型反 转录病毒载体PM-I及其构建方法。本发明构建的载体具有以下优点1)能高效感染多种细胞，具有广泛的宿主范围；2)能高效地将目的基因整合进所侵染的细胞基因组中，并高水平表达；3)具有高效侵染的特性，能将重组目的基因传递给整个细胞群体，更适合于基因 治疗等用途；4)与组织特异性启动子结合，则可能达到目的基因在特定组织或器官中定位表达 的目的。由于我国有着异常非富的小型猪种资源，其遗传背景清晰。本发明以我国特有五 指山猪来源的PERV为基础，进行反转录病毒载体的研究。以此为基础所进行的新型反转录 病毒载体包装细胞系的探索工作也是对病毒载体基因转移系统的完善和发展，特别是能为 转基因猪的建立和开发以及基因转移技术提供一条新的途径。本发明为转基因猪的研究提 供一种新的思路，可利用此载体进行封闭PERV转录的研究，培育无PERV表达的猪品系。此外，通过建立猪内源性反转录病毒新型载体以及筛选高滴度重组病毒的包装细 胞株，以达到高效表达外源基因，可以用于转基因猪的建立和开发；也可用于无内源性反转 录病毒表达的猪品系的培育，消除人们对异种移植病毒安全性的疑虑，为我国特有小型猪 种的开发奠定基础；还有可能成为基因治疗的一种工具。本发明通过与猪源细胞DNA的同源重组，从而达到目的基因的高效定点整合和表 达，为转基因猪源细胞/转基因猪的研究和应用及重组基因疫苗的研究奠定基础，还有可 能成为基因治疗的一种工具。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为PERV全长序列结构2为MSCVneo载体的图谱图3A-图3C为重组PERV载体PM-I的构建流程4为从PERV和MSCVne0模板中PCR扩增的目的片段的琼脂糖凝胶电泳检测结果图 5 为重叠 PCR 方法扩增的 P-5，LTR+ Ψ、P_5，UTR+P-gag、neo+P-3，LTR 的琼脂 糖凝胶电泳检测结果图6为酶切回收目的片段的琼脂糖凝胶电泳检测结果图7为PM-I的酶切鉴定结果图8为PCR扩增的GFP基因的琼脂糖凝胶电泳检测结果图9为PM-1-GFP-21的酶切鉴定结果
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1、猪内源性反转录病毒载体PM-I的构建用本发明的方法构建猪内源性反转录病毒载体PM-I (如图3A-图3C所示)，具体 方法如下按照五指山小型猪PERV(WZS-PERV)全基因序列(GenBank号EF133960，结构如图 1 所示)与 MSCVneo 序列(序列见 www. clontech. com,Protocol # PT3301-5，图谱见图 2) 设计了 5对引物。P-5，LTR和P-3，LTR片段通过PCR方法从WZS-PERV的基因组DNA中扩 增得到，Ψ、neo和O-Amp片段通过PCR方法从MSCVne0载体中扩增得到。引物序列如下Pl :5，LTR-F CGG r|GGTACC| TGAAAGGATGAAAATGCAACCT (序列表中序列 1)P2 :5，LTR-R ATCTCGGTGGAACCTCCATGAAAGGCCAGTCGA (序列表中序列 2)
P3 Ψ-F CTCGACTGGCCTTTCATGGAGGTTCCACCGAGA(序列表中序列 3)P4 Ψ -R CCG ^TCGA^ GTTAACGAATTCCGGCGCC (序列表中序列 4)P5 :3，LTR-F ACCTGTAGGTTTGGCAAGAACTATTAACAAGAG (序列表中序列 5)P6 :3，LTR-R CTAG )TCTAGA( CTGAAAGGCCAGTCGAGTTA (序列表中序列 6)P7 Pneo-F CCG ^TCGAGl AGATCTAATTCTACCGGGT (序列表中序列 7)P8 =Pneo-R TCTCTTGTTAATAGTTCTTGCCAAACCTACAGG (序列表中序列 8)P9 OAmp-F CTAG |TCTAGA| TGGGTAACAGTTTCTTGAAGTTGGA (序列表中序列 9)PlO OAmp-R CGG |GGTACC| TTCCCCCCTTTTTCTGGAGACT (序列表中序列 10)50μ 1反应体系包括0. 5μ 1 cDNA (lOOng/μ 1)，引物R (上游引物)和F (下 游弓I物)各 1μ 1(20μΜ)，4μ 1 dNTP (2. 5mM), 0. 5 μ 1 Super-L taq DNA 聚合酶(NEB 公 司)，5μ1 10XPCR Buffer，38 μ 1 灭菌水。反应条件为94°C变性 3min ;94°C 30s, 56°C 45s, 72°C lmin30s，30 个循环；72°C 7min。将 PCR 扩增的 P_5，LTR、P_3，LTR、Ψ、neo 和 O-Amp片段进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示(a. P_5’ LTR 702bp，b. P_3’ LTR 730bp, c. f. DL2000 Marker, g. Ψ 890bp, h. neol453bp, i. DL15000 Marker, j. O-Amp 3125bp,k. Marker III)，与预期结果相符。反应产物经Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega公司，美国)回收纯化，得到目的DNA片段。P-5，LTR+ Ψ、neo+P-3，LTR 片段分别由 P_5，LTR 与 Ψ，neo 与 P_3，LTR 片段通 过重叠 PCR(SOE)方法得到。50μ 1 反应体系包括0. 5μ 1 cDNA 1 (lOOng/μ 1)+0. 5 μ 1
6cDNA 2(100ng/y 1),引物 R 和F 各 1 μ 1 (20 μ Μ)，4 μ 1 dNTP (2. 5mM), 0. 5 μ 1 Super-L taq DNA 聚合酶(NEB 公司)，5 μ 1 10XPCR Buffer，37. 5 μ 1 灭菌水。反应条件为94°C 变性 3min;94°C 30s, 56°C lmin,72°C lmin30s，30 个循环；72°C 7min。将重叠 PCR 扩 增的P-5，LTR+ Ψ、neo+P-3 ’ LTR片段进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5所示 (a. P-5，LTR+ Ψ 1592bp, c.重叠 PCR 扩增 neo+P-3，LTR 2183bp, d. DL2000 Marker)，与预 期结果相符。反应产物经Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega 公司，美国) 回收纯化，得到目的DNA片段。然后用限制性内切酶Kpn I和XhoI消化PCR回收产物P-5，LTR+Ψ，用Xho I和 Xba I消化PCR回收产物neo+P-3’LTR，用Xba I与Kpn I消化PCR回收产物Oamp，37°C消 化4h后将酶切片段进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图6所示(a. Kpn I和Xho I双酶 切 P-5，LTR+ Ψ 回收产物 1592bp, c. DL2000 marker, d. Xho I 和 XbaI 双酶切 neo+P-3，LTR 回收产物2183bp，e. Marker III,f. Xba I与Kpn I双酶切OAmp回收产物3125bp)，与预期 结果相符。反应产物经Wizard SV Gel and PCRClean-Up System回收纯化。将上述酶切回收产物P-5，LTR+ Ψ，neo+P-3，LTR和Oamp三个片段用T4 DNA连接 酶(NEB公司)4°C连接16h，转化入E. coli DH5 α感受态细胞，筛选获得克隆质粒，命名为 PM-I0提取质粒，用限制性内切酶消化鉴定，鉴定结果如图7所示(a. DL15000Marker,b. Xho I 酶切鉴定 PM-I 6900bp, c. Kpn I 和 Xba I 酶切鉴定 PM_13775bp 和 3125bp，d. IOkb DNA ladder)，与预期结果相符，再送华大中生科技发展有限公司测序(3730自动测序仪)，测序 结果表明PM-I具有序列表中序列11的核苷酸序列，全长6900bp，序列正确，上述结果表明 获得了序列正确的猪内源性反转录病毒载体PM-1。实施例2、表达质粒PM-1-GFP-21的构建根据GFP基因编码区的序列分别引入Xho I和Bgl II酶切位点合成引物，引物序 列及多聚酶链式反应(PCR)的条件如下P15 =GFPXho I CCG |CTCGAG) CCATGGTGAGCAAGGGCGAP16 =GFPBgl II GGA ^GATCT| TTACTTGTACAGCTCGTCCAT50μ 1 反应体系包括0. 5μ 1 cDNA (lOOng/μ 1)，引物 R 和 F 各 1 μ 1 (20 μ Μ)， 4μ 1 dNTP (2. 5mM) ,0. 5μ 1 Super-L taq DNA 聚合酶(NEB 公司)，5 μ 1 10 X PCRBuffer, 38 μ 1 灭菌水。反应条件为94°C变性 3min ；94°C 30s, 54°C 45s, 72°C lmin30s,，30 个循 环；72°C 7min。将PCR扩增的GFP基因片段进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图8所示 (a. DL2000 Marker，b. GFP 基因 740bp)，与预期结果相符。反应产物经Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega公司，美国)回收纯化，得到目的DNA片段。用限制性内切酶Xho I和Bgl II消化PCR回收纯化产物GFP以及PM-I和PM-2载 体，经 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega 公司，美国)回收纯化，得到目 的DNA片段。将酶切消化的GFP片段分别插入酶切消化的PM-I载体，筛选得到目的表达载 体PM-1-GFP-21。提取质粒用限制性内切酶消化鉴定，PM-1-GFP-21的酶切鉴定结果如图9 所示(a. Marker III，b. Nco I 酶切 PM-l-GFP-21 1840bp 和 5800bp, c. Xho I 与 Bgl II 酶 切 PM-l-GFP-21 6900bp 和 740bp, d. Xho I 酶切 PM-l-GFP-21 7640bp, e. DLlOOO Marker)， 均与预期结果相符。送华大中生科技发展有限公司(3730自动测序仪)测序，测序结果表明获得了序列及插入位置正确的序列表
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基因目的表达载体PM-1-GFP-21。
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权利要求
猪内源性反转录病毒载体PM 1，由下列DNA元件组成1)PERV的5’LTR启动子；2)MSCVneo的延伸包装信号；3)小鼠磷酸甘油酸脂激酶启动子及位于PGK启动子下游并受其调控的新霉素抗性基因；4)PERV的聚嘌呤区域PP及其3’LTR启动子；5)大肠杆菌质粒骨架，包括大肠杆菌和氨苄青霉素抗性β内酰胺酶基因。
2.根据权利要求1所述的猪内源性反转录病毒载体ΡΜ-1，其特征在于所述反转录病 毒载体PM-I的核苷酸序列如序列表中序列11所示。
3.权利要求1所述猪内源性反转录病毒载体PM-I的构建方法，包括以下步骤1)按照猪PERV全基因序列与MSCVne0序列设计5对引物，扩增P_5’LTR片段的引物 对具有序列表中序列1和序列2的核苷酸序列，扩增Ψ片段的引物对具有序列表中序列3 和序列4的核苷酸序列，扩增P-3’ LTR片段的引物对具有序列表中序列5和序列6的核苷 酸序列，扩增neo片段的引物对具有序列表中序列7和序列8的核苷酸序列，扩增O-Amp片 段的引物对具有序列表中序列9和序列10的核苷酸序列，然后PCR扩增得到P-5’LTR、Ψ、 P-3，LTR、neo 和 O-Amp 片段；2)通过重叠PCR技术及酶切连接的方法构建出猪内源性反转录病毒载体PM-1。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于所述步骤1)的PCR反应体系包括 0. 5μ 1 cDNAdOOng/μ 1)，弓 ι物 R 禾口 F 各 1μ 1(20μΜ)，4μ 1 dNTP (2. 5mM), 0. 5 μ 1 Super-L taq DNA聚合酶，5 μ 1 10XPCR Buffer, 38 μ 1灭菌水；PCR反应条件为先94°C变性3min ； 然后 94°C 30s, 56°C 45s, 72°C lmin30s，30 个循环；最后 72°C 7min。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于所述步骤2)的重叠PCR的反 应体系包括0·5μ1 cDNA KlOOng/μ 1)+0. 5μ 1 cDNA 2 (lOOng/μ 1)，弓| 物 R 禾口 F 各 1 μ 1 (20 μ Μ), 4 μ 1 dNTP (2. 5mM), 0. 5 μ 1 Super-L taq DNA聚合酶，5 μ 1 10XPCR Buffer, 37. 5μ1 灭菌水；反应条件为先 94°C 变性 3min;然后 94°C 30s, 56 °C lmin，72°C Imin 30s, 30 个循环；最后 72°C 7min。
6.含有权利要求1或2所述猪内源性反转录病毒载体PM-I的表达载体、转基因细胞系 或宿主菌。
7.—种表达外源基因的方法，是在权利要求1或2所述在猪源细胞中特异表达或可 在其它哺乳动物细胞表达的质粒型反转录病毒载体PM-I的多克隆位点处插入其它外源基 因，当转染细胞后可被包装成复制缺陷型的猪内源性反转录病毒粒子，直接感染体外培养 的细胞系，在细胞系中表达外源基因。
全文摘要
本发明公开了猪内源性反转录病毒载体及其构建方法与应用。本发明构建的载体具有以下优点1)能高效感染多种细胞，具有广泛的宿主范围；2)能高效地将目的基因整合进所侵染的细胞基因组中，并高水平表达；3)具有高效侵染的特性，能将重组目的基因传递给整个细胞群体，更适合于基因治疗等用途；4)与组织特异性启动子结合，则可能达到目的基因在特定组织或器官中定位表达的目的。
文档编号C12N5/10GK101899472SQ20091024339
公开日2010年12月1日 申请日期2009年12月22日 优先权日2009年12月22日
发明者丁芳, 冯书堂, 吕茂民, 吴健敏, 徐述, 章金刚, 马玉媛 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所;广西壮族自治区兽医研究所