一种基因敲除载体质粒的构建方法
【专利摘要】本发明涉及分子生物学和生物【技术领域】，特别是涉及一种基因敲除载体质粒的构建方法。本发明从脐孢木霉菌0248菌丝体中提取基因组，利用融合PCR方法构建 tri14 基因敲除载体，并将该载体应用于 tri14 基因的敲除以及该基因功能的研究。本发明提供了一种基因敲除载体质粒的构建方法，同时也提供了这种基因敲除载体质粒在木霉菌基因功能研究中的应用，为木霉菌中基因功能的研究提供了新的方法和技术。
CGMCC No. 6985
2012.12.12
【专利说明】一种基因敲除载体质粒的构建方法
[0001]
【技术领域】
[0002] 本发明涉及分子生物学和生物【技术领域】，特别是涉及一种基因敲除载体质粒的构 建方法。
【背景技术】
[0003] 你概木霉儀(Jrichodenna brevicompactum)是一种广泛存在于土壤、植物中的 木霉菌。木霉菌主要通过拮抗作用、竞争作用以及抗生作用等，对常见的多种病原真菌具 有抑制作用，如黄瓜立枯病菌(/PAizocioflia 5·〇^3/?Υ)、番爺灰霉病菌CZfciizyii1S ciflerea) 和黄瓜枯萎病菌等，因而具有良好的生防应用前景。木霉素 (Trichodermin)--单端孢霉烯类化合物的一种，它对常见9种植物病原真菌的菌丝生长 和孢子萌发均有不同程度的抑制作用，对黄瓜立枯病和番茄灰霉病等真菌病害有良好的生 防效果。据报道，木霉素主要由脐孢木霉菌合成，但目前木霉素在脐孢木霉菌中的合成途径 尚未明确。探明木霉素的合成途径，对木霉素的工业生产和应用具有重要意义。
[0004] 研究发现单端孢霉烯类化合物代谢途径中的相关基因大多位于iri基因簇 中。镰刀菌中iri基因簇的研究较多，该基因簇中大多基因的功能已经知 晓，然而tri#基因功能尚未明确。華状木霉（7： a/Y/flt/iflacew?)也能合成单端孢霉 烯类化合物Harzianum A (HA)。木霉素和HA的结构非常相似，唯一区别在于C-4位侧 链基团的不同，木霉素 C-4位是乙酰基团，HA上是octa-2,4,6_trienedioic acid。在 T1. a/Y/flt/iflacew?中，trichodiene经加氧、环化、轻基化和乙酰化等4步反应最终合成 HA。催化3步氧化反应，rairiii编码的酶催化C-4轻基化反应（Cardoza R E, Malmierca MG, Hermosa MR, Alexander NJ, McCormick SP, Proctor RH, Tijerino AM, Rumbero A, Monte E, Gutierrez S. Identification of Loci and Functional Characterization of Trichothecene Biosynthesis Genes in Filamentous Fungi of the Genus fricAoofe/ma· Appl Environ Microb, 2011,77(14): 4867-4877)。胳抱木 霉菌中相关基因的功能研究报道很少，除了对基因外，其他基因的功能均有待研究 (Tijerino A, Cardoza RE, Moraga J, Malmierca M G, Vicente F, Aleu J, Collado I G, Gutierrez S, Monte E, Hermosa R. Overexpression of trichodiene synthase gene tri5 increases trichodermin production and antimicrobial activity in Trichoderma brevicompactum. Fungal Genet Biol, 2011,48:285-296)。
[0005] 基因敲除是基因功能研究中最具有说服力的方法之一。传统基因敲除质粒载体构 建方法是将待敲除基因上游，下游DNA片段和抗生素抗性基因片段分别通过酶切和连接的 方法克隆到基因敲除骨架载体的多克隆位点上。传统构建基因敲除质粒，有两个弊端：（1) 构建一个完整的基因敲除质粒，至少要做三次克隆，每一次克隆都需要重复酶切和连接转 化等繁琐步骤，降低了工作效率；（2)只能选择在骨架载体多克隆位点中所对应的限制性 内切酶，且选择的内切酶不能在待敲除基因的上、下游DNA片段和抗生素抗性基因中存在 相应的酶切位点。而在实际操作中，在基因的上、下游DNA片段和抗生素抗性基因中可能存 在较多的酶切位点序列，导致在多克隆位点中很难找到相对应的内切酶，限制了其应用。
【发明内容】
[0006] 本发明从脐孢木霉菌0248菌丝体中提取基因组，利用融合PCR方法构建基 因敲除载体，并将该载体应用于基因的敲除以及该基因功能的研究。
[0007] 本发明目的是针对现有技术的不足，提供了一种基因敲除载体质粒的构建方法； 本发明的另一目的是提供了这种基因敲除载体质粒在木霉菌基因功能研究中的应用，为木 霉菌中基因功能的研究提供了新的方法和技术。
[0008] 本发明脐孢木霉菌（fricAoofe/ma A/wico聲》acia?)，定名为脐孢木霉菌0248。该 菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址北京市朝阳区北 辰西路1号院3号，保藏日期2012年12月12日，保藏登记号CGMCC No. 6985。
[0009] 本发明目的通过以下技术方案来实现： 一种基因敲除载体质粒的构建方法，按以下步骤进行： 1.基因全长的克隆以及敲除片段的构建 (1) 根据我们前期测的脐孢木霉菌0248转录组数据和信息，得到基因的DNA序 列信息； (2) 用DNA Walking试剂盒分别扩增得到基因上游和下游同源片段； (3) 设计带接头的引物，从质粒pUC-Hyg上克隆得到潮霉素抗性基因片段； (4) 利用融合PCR克隆技术将基因上游片段、潮霉素抗性基因片段、基因 下游片段首尾连接，构建敲除片段。
[0010] 2.基因敲除载体的构建及农杆菌介导转化至脐孢木霉菌0248 (1) 根据限制性酶切位点上的粘性末端将步骤1 (4)中获得的敲除片段连接到基因敲 除载体质粒PCAMBIA0380上； (2) 将步骤2 (1)中敲除载体质粒转化至农杆菌感受态细胞； (3) 利用农杆菌介导技术将基因敲除片段转化至脐孢木霉菌0248中； 3. 基因敲除转化株的验证 使用PCR检测转化菌株中基因，以验证阳性转化株，并检测基因敲除后对 与单端孢霉烯类化合物合成相关的基因表达的影响。
[0011] 本发明的有益效果：一是提供了一种基因敲除载体质粒的构建方法；二是提供了 这种基因敲除载体质粒在木霉菌基因功能研究中的应用，为木霉菌中基因功能的研究提供 了新的方法和技术。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1胳抱木霉0248广木霉素相关基因 cDNA全长序列。
[0013] 图2质粒构建图，将融合PCR产物通过酶切位点连接到基因敲除骨架质粒上，形成 新的敲除质粒PCAMBIA0380H。
[0014] 图3得到的19株转化株中基因 PCR检测电泳图第6泳道和第16泳道为阳 性克隆，第20泳道为DL2000 Marker。
【具体实施方式】
[0015] 实施例I 基因全长的克隆以及敲除片段的构建） 按以下步骤进行： (1) 根据脐孢木霉菌0248转录组提供的基因序列信息，设计特异性引物： tril4-F ：GGATAACCCAATCTTCA tril4-R ：GTTACCCCTCAATCAGA 提取脐孢木霉菌0248总DNA，使用Taq PCR Master Mix (2X ,blue dye)进行PCR扩 增基因片段，反应体系为50 yL:Mix25 yL，正引物I yL，反引物I yL，DNA模 版1 μ L，ddH20 22 μ L。反应程序如下：
【权利要求】
1. 一种基因敲除载体质粒的构建方法。
2. 权利要求1所述的方法，其中基因敲除载体质粒利用融合PCR方法构建。
3. 权利要求1所述的方法，其特征在于敲除的基因为脐孢木霉菌0248中的基 因。
【文档编号】C12N15/66GK104313047SQ201410543633
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月15日 优先权日:2014年10月15日
【发明者】申屠旭萍, 汤谷, 袁小枫, 俞晓平 申请人:中国计量学院