一种磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒及其使用方法与流程

一种磁珠法提取血液基因组dna的试剂盒及其使用方法
技术领域
[0001]
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种磁珠法提取血液基因组dna的试剂盒及其使用方法。


背景技术：

[0002]
近年来分子生物学技术飞速发展，基因组水平上的研究已成为广大研究者们的研究的热点。全基因组dna是遗传信息的载体，包括编码序列和非编码序列在内的全部基因信息。从人体或动物的血液中提取高质量的dna是基因检测、精准医疗及其他分子生物学研究的重要前提。核酸分子生物学的很多常规实验都需要以提取基因组dna为前提，无论是基因测序、pcr扩增、基因组文库的构建等，而且提取的基因组dna的总量及纯度和分子的结构的完整度都会影响下游的分子实验。目前已知的酚氯仿法、盐析法、吸附柱法、免疫亲和法、磁珠法等。现有dna提取方法中可用于血液dna提取的主要有吸附柱法和磁珠法，其中吸附柱法提取效果和所提取dna浓度上都有明显不足，磁珠法是以磁珠为载体的分离技术具有操作简单，快速，重复性好，能从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中分离出dna和rna，可应用在疾病控制中心、临床疾病诊断、输血安全、法医学鉴定、环境微生物检测、食品安全检测、畜牧业和分子生物学研究等多种领域，是未来核酸提取发展的重要方向。
[0003]
现有的磁珠法要经过多次重复的离心，不仅费时，而且多次离心过程中产生的剪切力会对核酸造成破坏，还会带来交叉污染，因此有必要开发高效率、提取高质量dna的方法。


技术实现要素：

[0004]
有鉴于此，本发明提出了一种高效率、低成本、操作简单、高质量的dna的磁珠dna提取方法。
[0005]
本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供了一种提取血液基因组dna的试剂盒，其特征在于，包括预处理液、细胞裂解液、结合液、蛋白酶k溶液、磁珠混悬液、清洗液和洗脱液，上述溶液的溶剂均为去离子水。
[0006]
在以上技术方案的基础上，优选的，所述预处理液为羟乙基淀粉溶液、氯化钠溶液、pbs溶液、氯化铵溶液中一种或几种溶液混合物。
[0007]
在以上技术方案的基础上，优选的，所述羟乙基淀粉溶液质量分数为6％，氯化钠溶液质量分数为0.1％-1.0％，pbs溶液浓度为0.1-1.0mol/l，氯化铵溶液浓度为0.15-0.50mol/l。
[0008]
在以上技术方案的基础上，优选的，所述结合液中异硫氰酸胍溶液浓度为4.5-5.0mol/l，tris-hcl溶液浓度为0.01-0.05mol/l，tris-hcl溶液的ph为6.4，edta溶液浓度为0.5-1.0mmol/l，edta溶液的ph为8.0，曲拉通x-100溶液体积分数0.1％-10％。
[0009]
在以上技术方案的基础上，优选的，所述裂解液包括tris-hcl溶液、edta溶液和sds溶液，tris-hcl溶液浓度为0.1-1.0mol/l，tris-hcl溶液的ph为7.5，edta溶液浓度为
0.02-0.05mol/l，edta溶液的ph为8.0，sds溶液体积分数1.25％-2.0％。
[0010]
在以上技术方案的基础上，优选的，所述磁珠混悬液浓度为40-50mg/ml。
[0011]
在以上技术方案的基础上，优选的，所述洗脱液包括tris-hcl溶液和edta溶液，tris-hcl溶液浓度为8-10mmol/l，edta溶液浓度为0.5-1.0mmol/l。
[0012]
所述磁珠溶液的磁珠采用内核为超顺磁性四氧化三铁，表面包覆有硅羟基磁珠。
[0013]
在以上技术方案的基础上，优选的，所述清洗液包括第一清洗液和第二清洗液，第一清洗液包括tris-hcl溶液、氯化钠溶液、异硫氰酸胍溶液和乙醇溶液，tris-hcl溶液浓度为10-20mmol/l，tris-hcl溶液的ph为8.0，氯化钠溶液浓度为10-20mmol/l、异硫氰酸胍溶液浓度为3-5mol/l，乙醇溶液体积分数为55％-70％；第二清洗液为乙醇溶液，体积分数为70％-80％。
[0014]
本发明还提供了一种磁珠法提取血液基因组dna的方法，具体包括：
[0015]
s1，向1.5ml的离心管中加入200-400μl的血样和800-1600μl预处理液，震荡混匀，转速12000r/min条件下离心3-5min，去除上清液，得到沉淀物；
[0016]
s2，向上述沉淀物中加入200-400μl裂解液和20-50μl蛋白酶k溶液，涡旋振荡离心管30s使其充分混匀，置于恒温金属浴中60℃-65℃温浴10-20min，温浴期间拿出离心管涡旋震荡3-4次，每次30s；
[0017]
s3，将离心管从恒温金属浴中取出，加入2-3mg磁珠溶液，250-300μl结合液，涡旋振荡5min后，将离心管置于磁力架上静止至磁珠完全吸附，去除上清液；
[0018]
s4，将离心管从磁力架上取下，加入500-700μl的第一清洗液，涡旋振荡30s，重新将混匀好的离心管放置磁力架上静止至磁珠完全吸附，去除上清液，用第二清洗液重复上述清洗操作2次；
[0019]
s5，将离心管放置56℃的恒温金属浴中温浴3-5min，取出离心管，加入50-100μl洗脱液，涡旋振荡30s后放置56℃的恒温金属浴内温浴3-5min；
[0020]
s6，取出离心管，放置于磁力架上30s，吸出洗脱液转移至新的1.5ml的离心管中，获得提取后的dna产物。
[0021]
在以上技术方案的基础上，优选的，所述血液基因组dna提取试剂盒在血液、组织、唾液、细胞内的基因组dna提取上的应用。
[0022]
本发明相对于现有技术具有以下有益效果：
[0023]
1.本发明试剂盒无有毒、无有刺激性气体等试剂，提高了整个操作的安全性。
[0024]
2.本发明操作简单快速，提取一个样本只需30min，工作效率得到大幅度的提升，适合大批样本的处理。本专利还可提取大体系的基因组dna，根据实验体系扩大试剂用量，仍可获得高质量的基因组dna。
[0025]
3.本发明提取前对全血细胞进行预处理，去除血液中红细胞，沉淀白细胞，有利于提取高质量的dna；添加的结合液有促进磁珠和裂解的dna结合的作用，通过减少多次离心步骤，避免了离心过程中可能带来的交叉污染和多次离心过程中产生的剪切力对核酸的破坏，提取的dna纯度高。
附图说明
[0026]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现
有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0027]
图1为试剂盒检测结果。
[0028]
附图说明：编号1-7为本试剂盒从全血细胞中提取的基因组dna产物的电泳胶图，编号8为qiagen试剂盒(过柱法)提取的基因组dna产物的电泳胶图。
具体实施方式
[0029]
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
[0030]
实施例1
[0031]
检测血样来源：申请人公司员工志愿者
[0032]
试剂盒试剂：
[0033]
预处理液：羟乙基淀粉溶液质量分数为6％。
[0034]
裂解液：tris-hcl溶液浓度为0.1mol/l，tris-hcl溶液ph为7.5，edta溶液浓度为0.02mol/l，edta溶液的ph为8.0，sds溶液质量分数为1.25％。
[0035]
结合液：异硫氰酸胍溶液浓度为4.5mol/l，tris-hcl溶液浓度为0.01mol/l，tris-hcl溶液ph为6.4，edta溶液浓度为0.5mmol/l，tris-hcl溶液ph为8.0，曲拉通x-100溶液体积分数为0.1％。
[0036]
磁珠溶液：磁珠混悬液的浓度为40mg/ml。
[0037]
第一清洗液：tris-hcl溶液浓度为10mmol/l，tris-hcl溶液ph为8.0，氯化钠溶液浓度为10mmol/l，异硫氰酸胍溶液浓度为3mol/l，乙醇溶液体积分数为55％。
[0038]
第二清洗液：乙醇溶液的体积分数为70％。
[0039]
洗脱液：tris-hcl溶液浓度为8mmol/l，edta溶液浓度为0.5mmol/l。
[0040]
提取方法：
[0041]
s1，向1.5ml的离心管中加入200μl血样和800μl预处理液，震荡混匀，转速12000r/min条件下离心3min，去除上清液，得到沉淀物；
[0042]
s2，向上述沉淀物中加入200μl裂解液和20μl蛋白酶k溶液，涡旋振荡离心管30s使其充分混匀，置于恒温金属浴中60℃温浴10min，温浴期间拿出离心管涡旋震荡3次，每次30s；
[0043]
s3，将离心管从恒温金属浴中取出，加入2mg磁珠溶液，250μl结合液，涡旋振荡5min后，将离心管置于磁力架上静止至磁珠完全吸附，去除上清液；
[0044]
s4，将离心管从磁力架上取下，加入500μl的第一清洗液，涡旋振荡30s，重新将混匀好的离心管放置磁力架上静止至磁珠完全吸附，去除上清液，用第二清洗液重复上述清洗操作2次；
[0045]
s5，将离心管放置56℃的恒温金属浴中温浴3min，取出离心管，加入50μl洗脱液，涡旋振荡30s后放置56℃的恒温金属浴内温浴3min；
[0046]
s6，取出离心管，放置于磁力架上30s，吸出洗脱液转移至新的1.5ml的离心管中，获得提取后的dna产物。
[0047]
实施例2
[0048]
检测血样来源：申请人公司员工志愿者
[0049]
试剂盒试剂：
[0050]
预处理液：氯化钠溶液质量分数为0.1％。
[0051]
裂解液：tris-hcl溶液浓度为1mol/l，tris-hcl溶液ph为7.5，edta溶液浓度为0.05mol/l，edta溶液的ph为8.0，sds溶液质量分数为2％。
[0052]
结合液：异硫氰酸胍溶液浓度为5mol/l，tris-hcl溶液浓度为0.05mol/l，tris-hcl溶液ph为6.4，edta溶液浓度为1mmol/l，tris-hcl溶液ph为8.0，曲拉通x-100溶液体积分数为10％。
[0053]
磁珠溶液：磁珠混悬液的浓度为50mg/ml。
[0054]
第一清洗液：tris-hcl溶液浓度为20mmol/l，tris-hcl溶液ph为8.0，氯化钠溶液浓度为20mmol/l，异硫氰酸胍溶液浓度为5mol/l，乙醇溶液体积分数为70％。
[0055]
第二清洗液：乙醇溶液的体积分数为80％。
[0056]
洗脱液：tris-hcl溶液浓度为10mmol/l，edta溶液浓度为1mmol/l。
[0057]
提取方法：
[0058]
s1，向1.5ml的离心管中加入400μl血样和1600μl预处理液，震荡混匀，转速12000r/min条件下离心5min，去除上清液，得到沉淀物；
[0059]
s2，向上述沉淀物中加入400μl裂解液和50μl蛋白酶k溶液，涡旋振荡离心管30s使其充分混匀，置于恒温金属浴中65℃温浴20min，温浴期间拿出离心管涡旋震荡4次，每次30s；
[0060]
s3，将离心管从恒温金属浴中取出，加入3mg磁珠溶液，300μl结合液，涡旋振荡5min后，将离心管置于磁力架上静止至磁珠完全吸附，去除上清液；
[0061]
s4，将离心管从磁力架上取下，加入700μl的第一清洗液，涡旋振荡30s，重新将混匀好的离心管放置磁力架上静止至磁珠完全吸附，去除上清液，用第二清洗液重复上述清洗操作2次；
[0062]
s5，将离心管放置56℃的恒温金属浴中温浴3min，取出离心管，加入100μl洗脱液，涡旋振荡30s后放置56℃的恒温金属浴内温浴5min；
[0063]
s6，取出离心管，放置于磁力架上30s，吸出洗脱液转移至新的1.5ml的离心管中，获得提取后的dna产物。
[0064]
实施例3
[0065]
检测血样来源：申请人公司员工志愿者
[0066]
试剂盒试剂：
[0067]
预处理液：pbs溶液浓度为0.1mol/l。
[0068]
裂解液：tris-hcl溶液浓度为0.5mol/l，tris-hcl溶液ph为7.5，edta溶液浓度为0.04mol/l，edta溶液的ph为8.0，sds溶液质量分数为1.5％。
[0069]
结合液：异硫氰酸胍溶液浓度为4.7mol/l，tris-hcl溶液浓度为0.03mol/l，tris-hcl溶液ph为6.4，edta溶液浓度为0.8mmol/l，tris-hcl溶液ph为8.0，曲拉通x-100溶液体
积分数为5％。
[0070]
磁珠溶液：磁珠混悬液的浓度为45mg/ml。
[0071]
第一清洗液：tris-hcl溶液浓度为15mmol/l，tris-hcl溶液ph为8.0，氯化钠溶液浓度为15mmol/l，异硫氰酸胍溶液浓度为4mol/l，乙醇溶液体积分数为60％。
[0072]
第二清洗液：乙醇溶液的体积分数为75％。
[0073]
洗脱液：tris-hcl溶液浓度为9mmol/l，edta溶液浓度为0.7mmol/l。
[0074]
提取方法：
[0075]
s1，向1.5ml的离心管中加入300μl血样和1000μl预处理液，震荡混匀，转速12000r/min条件下离心5min，去除上清液，得到沉淀物；
[0076]
s2，向上述沉淀物中加入300μl裂解液和40μl蛋白酶k溶液，涡旋振荡离心管30s使其充分混匀，置于恒温金属浴中63℃温浴15min，温浴期间拿出离心管涡旋震荡4次，每次30s；
[0077]
s3，将离心管从恒温金属浴中取出，加入2.5mg磁珠溶液，280μl结合液，涡旋振荡5min后，将离心管置于磁力架上静止至磁珠完全吸附，去除上清液；
[0078]
s4，将离心管从磁力架上取下，加入600μl的第一清洗液，涡旋振荡30s，重新将混匀好的离心管放置磁力架上静止至磁珠完全吸附，去除上清液，用第二清洗液重复上述清洗操作2次；
[0079]
s5，将离心管放置56℃的恒温金属浴中温浴4min，取出离心管，加入80μl洗脱液，涡旋振荡30s后放置56℃的恒温金属浴内温浴4min；
[0080]
s6，取出离心管，放置于磁力架上30s，吸出洗脱液转移至新的1.5ml的离心管中，获得提取后的dna产物。
[0081]
实施例4
[0082]
检测血样来源：申请人公司员工志愿者
[0083]
试剂盒试剂：
[0084]
预处理液：氯化铵溶液浓度为0.15mol/l。
[0085]
裂解液：tris-hcl溶液浓度为0.3mol/l，tris-hcl溶液ph为7.5，edta溶液浓度为0.04mol/l，edta溶液的ph为8.0，sds溶液质量分数为1.45％。
[0086]
结合液：异硫氰酸胍溶液浓度为4.6mol/l，tris-hcl溶液浓度为0.02mol/l，tris-hcl溶液ph为6.4，edta溶液浓度为0.6mmol/l，tris-hcl溶液ph为8.0，曲拉通x-100溶液体积分数为3％。
[0087]
磁珠溶液：磁珠混悬液的浓度为44mg/ml。
[0088]
第一清洗液：tris-hcl溶液浓度为12mmol/l，tris-hcl溶液ph为8.0，氯化钠溶液浓度为13mmol/l，异硫氰酸胍溶液浓度为4.5mol/l，乙醇溶液体积分数为58％。
[0089]
第二清洗液：乙醇溶液的体积分数为73％。
[0090]
洗脱液：tris-hcl溶液浓度为8.5mmol/l，edta溶液浓度为0.6mmol/l。
[0091]
提取方法：
[0092]
s1，向1.5ml的离心管中加入250μl的血样和1300μl预处理液，震荡混匀，转速12000r/min条件下离心3.5min，去除上清液，得到沉淀物；
[0093]
s2，向上述沉淀物中加入350μl裂解液和39μl蛋白酶k溶液，涡旋振荡离心管30s使
其充分混匀，置于恒温金属浴中64℃温浴18min，温浴期间拿出离心管涡旋震荡4次，每次30s；
[0094]
s3，将离心管从恒温金属浴中取出，加入2.8mg磁珠溶液，280μl结合液，涡旋振荡5min后，将离心管置于磁力架上静止至磁珠完全吸附，去除上清液；
[0095]
s4，将离心管从磁力架上取下，加入650μl的第一清洗液，涡旋振荡30s，重新将混匀好的离心管放置磁力架上静止至磁珠完全吸附，去除上清液，用第二清洗液重复上述清洗操作2次；
[0096]
s5，将离心管放置56℃的恒温金属浴中温浴4.5min，取出离心管，加入90μl洗脱液，涡旋振荡30s后放置56℃的恒温金属浴内温浴4min；
[0097]
s6，取出离心管，放置于磁力架上30s，吸出洗脱液转移至新的1.5ml的离心管中，获得提取后的dna产物。
[0098]
实施例5
[0099]
检测血样来源：申请人公司员工志愿者
[0100]
试剂盒试剂：
[0101]
预处理液：羟乙基淀粉溶液浓度为6％，氯化铵溶液浓度为0.5mol/l。
[0102]
裂解液：tris-hcl溶液浓度为0.2mol/l，tris-hcl溶液ph为7.5，edta溶液浓度为0.03mol/l，edta溶液的ph为8.0，sds溶液质量分数为1.35％。
[0103]
结合液：异硫氰酸胍溶液浓度为4.7mol/l，tris-hcl溶液浓度为0.03mol/l，tris-hcl溶液ph为6.4，edta溶液浓度为0.7mmol/l，tris-hcl溶液ph为8.0，曲拉通x-100溶液体积分数为4％。
[0104]
磁珠溶液：磁珠混悬液的浓度为43mg/ml。
[0105]
第一清洗液：tris-hcl溶液浓度为13mmol/l，tris-hcl溶液ph为8.0，氯化钠溶液浓度为17mmol/l，异硫氰酸胍溶液浓度为4.7mol/l，乙醇溶液体积分数为59％。
[0106]
第二清洗液：乙醇溶液的体积分数为77％。
[0107]
洗脱液：tris-hcl溶液浓度为7.5mmol/l，edta溶液浓度为0.7mmol/l。
[0108]
提取方法同实施例2。
[0109]
实施例6
[0110]
检测血样来源：申请人公司员工志愿者
[0111]
试剂盒试剂：
[0112]
预处理液：氯化钠溶液质量分数为1.0％，pbs溶液浓度为1.0mol/l，氯化铵溶液浓度为0.3mol/l。
[0113]
裂解液：tris-hcl溶液浓度为0.8mol/l，tris-hcl溶液ph为7.5，edta溶液浓度为0.03mol/l，edta溶液的ph为8.0，sds溶液质量分数为1.46％。
[0114]
结合液：异硫氰酸胍溶液浓度为4.7mol/l，tris-hcl溶液浓度为0.03mol/l，tris-hcl溶液ph为6.4，edta溶液浓度为0.9mmol/l，tris-hcl溶液ph为8.0，曲拉通x-100溶液体积分数为9％。
[0115]
磁珠溶液：磁珠混悬液的浓度为49mg/ml。
[0116]
第一清洗液：tris-hcl溶液浓度为19mmol/l，tris-hcl溶液ph为8.0，氯化钠溶液浓度为19mmol/l，异硫氰酸胍溶液浓度为4.7mol/l，乙醇溶液体积分数为60％。
[0117]
第二清洗液：乙醇溶液的体积分数为77％。
[0118]
洗脱液：tris-hcl溶液浓度为9.5mmol/l，edta溶液浓度为0.7mmol/l。
[0119]
提取方法同实施例1。
[0120]
实施例7
[0121]
检测血样来源：申请人公司员工志愿者
[0122]
试剂盒试剂：
[0123]
预处理液：羟乙基淀粉溶液浓度为6％，氯化钠溶液质量分数为0.4％，pbs溶液浓度为0.25mol/l，氯化铵溶液浓度为0.4mol/l。
[0124]
裂解液：tris-hcl溶液浓度为0.2mol/l，tris-hcl溶液ph为7.5，edta溶液浓度为0.02mol/l，edta溶液的ph为8.0，sds溶液质量分数为1.55％。
[0125]
结合液：异硫氰酸胍溶液浓度为4.8mol/l，tris-hcl溶液浓度为0.03mol/l，tris-hcl溶液ph为6.4，edta溶液浓度为0.6mmol/l，tris-hcl溶液ph为8.0，曲拉通x-100溶液体积分数为2％。
[0126]
磁珠溶液：磁珠混悬液的浓度为41mg/ml。
[0127]
第一清洗液：tris-hcl溶液浓度为11mmol/l，tris-hcl溶液ph为8.0，氯化钠溶液浓度为17mmol/l，异硫氰酸胍溶液浓度为4.5mol/l，乙醇溶液体积分数为68％。
[0128]
第二清洗液：乙醇溶液的体积分数为76％。
[0129]
洗脱液：tris-hcl溶液浓度为9.5mmol/l，edta溶液浓度为0.6mmol/l。
[0130]
提取方法同实施例3。
[0131]
实施例8
[0132]
用qiagen试剂盒(过柱法)提取相同血液、相同体积的dna样本，做1个平行对照实验。
[0133]
编号1-7为实施例1-7的检测结果，编号8为qiagen试剂盒(过柱法)的检测结果，检测结果见下表。
[0134]
琼脂糖凝胶电泳检测：对上述实验所得8份dna回收产物，分别取2μl上样，进行琼脂糖凝胶电泳，胶图(见图1)显示所获得全基因组dna产物平行性好，条带清晰，无拖尾和杂带，表明提取的基因组dna完整性好，且无其它dna污染。
[0135]
od值检测：使用超微量紫外-可见光分光光度计对8份基因组dna回收产物进行了od值检测(见表1)。检测结果显示：本申请试剂盒所提取的dna浓度普遍略高于qiagen试剂盒，表明本试剂盒提取得到的dna产物含量高且纯度更好。
[0136]
表1全血细胞中提取的基因组dna的产物总量结果
[0137]
编号a260/a280a260/a230浓度(ng/μl)11.732.0232.3121.741.9932.2831.722.0432.2741.702.1132.3351.752.0832.3061.712.0432.3271.732.0232.34
81.711.9528.45
[0138]
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。