一种塞尼卡谷病毒抗原的纯化方法与流程

本发明涉及疫苗中抗原的分离纯化技术领域，特别是涉及一种塞尼卡谷病毒抗原的纯化方法。

背景技术：

塞尼卡谷病毒(senecavalleyvirus，svv)，又叫做senecavirusa(sva)，是无囊膜的单股正链rna病毒，是小rna病毒科(picornaviridae)塞尼卡病毒属(seneca-virus)的唯一成员，是近年来新发现的一种能引起猪水泡样症状的病毒，被认为是引起猪原发性水疱病(pivd)的主要原因。该病毒感染动物(尤其是猪)后,可引起繁殖母猪和公猪的鼻吻、冠状带和蹄部出现水疱性病变，偶见腹泻症状，成年猪感染通常呈亚临床感染。更可怕的是，该病毒还会引起新生仔猪的死亡，1-3日龄新生仔猪病死率可达30％-70％。猪被该病毒感染后，在临床上其发病症状与口蹄疫、猪水疱病和猪水泡性口炎很难区分，往往会因诊断不及时而耽误治疗。

自20世纪80年代后期以来，美国猪群中便存在svv。自2002年确定svv病毒存在至2015年初，svv感染的猪病例只有在美国和加拿大零星发生。但自2015年下半年后，在巴西、美国、加拿大、中国、哥伦比亚等多国相继发生了svv感染的疫情，并且呈蔓延之势。截至2015年9月底,美国已有11个州确诊猪svv感染病例,加拿大、意大利和巴西出现疑似svv感染病例。

猪svv作为近两年在全球多地出现的一种跨境动物疾病病毒，已经对多国养殖业造成了不同程度的影响。我国作为养猪大国，生猪养殖总量约为全球50％，因此，有必要对svv流行态势密切关注并尽快建立全方位的应对措施。目前，我国对svv的报道并不多，大多养殖户对该病没有引起足够的重视，但该病已经形成全球蔓延的趋势，一旦大规模爆发，势必会造不可估量的经济损失。

因此，研制该病毒的疫苗是预防该病毒大规模蔓延的最主要途径之一，而病毒的纯化是疫苗制备的关键。目前，病毒纯化的方法主要有蔗糖或氯化铯密度梯度离心法、聚乙二醇(peg)沉淀法等。以上方法耗时长，使用的部分试剂对环境有污染，且处理过程中病毒的完整性易遭到破坏，使得抗原回收率低，不宜进行工业化生产，例如：聚乙二醇(peg)沉淀法，用该方法纯化病毒后，抗原回收率低于65％，且化学试剂残留，免疫动物后易产生副反应。因此，需要寻找一种有效的方法对塞尼卡谷病毒进行纯化。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，提供一种快速高效的塞尼卡谷病毒抗原的纯化方法，是从塞尼卡谷病毒悬浮培养液中纯化得到塞尼卡谷病毒抗原，包括经离心澄清、超滤浓缩和凝胶过滤层析等步骤。

所述凝胶过滤层析具体为：用超滤浓缩得到的浓缩液上样，用平衡液洗脱，收集所需流穿样，即为纯化后的塞尼卡谷病毒抗原液。

所述平衡液为磷酸盐缓冲液，电导值为15-20ms/cm，ph为7.0-8.5。

用平衡液洗脱时，收集从紫外检测信号出现至紫外检测信号下降至平稳期间的流穿样，即为所需流穿样，紫外检测波长为280nm。

所述超滤浓缩具体为：用切向流超滤浓缩对离心澄清获得的上清液进行超滤浓缩得到浓缩液。

所述超滤浓缩中使用切向流过滤系统对离心澄清获得的上清液进行超滤浓缩，再用缓冲液进行等体积流加方式洗滤，缓冲液流加速率等于上清液的透过速率，取浓液区的液体得到浓缩液，浓缩倍数为5-20倍。

所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。

所述切向流过滤系统中的切向流过滤膜为中空纤维或膜包，切向流过滤膜的截留分子量为300-750kda。

所述超滤浓缩的操作压力小于2bar。

所述离心澄清具体为：将塞尼卡谷病毒悬浮培养液在3000-8000rpm下离心15-30min，弃沉淀，收集上清液。

本发明提供的svv抗原的纯化方法，采用切向流过滤和凝胶过滤柱层析相结合的方式对svv抗原进行纯化，具有操作简单的特点；相较密度梯度离心法、聚乙二醇(peg)沉淀法等无需繁琐耗时的人工操作，该方法纯化速度快，易于进行工业化大规模生产。该方法能在svv活病毒和灭活病毒的纯化中应用，抗原回收率>80％，蛋白去除率>90％，能制备出高纯度的svv抗原。

附图说明

图1所示为实施例1的凝胶过滤层析图；

图2所示为实施例1纯化前、后塞尼卡谷病毒抗原的sds-page蛋白电泳图。

具体实施方式

本发明提出一种不同以往的塞尼卡谷病毒抗原的纯化方法，首次提出用切向流过滤和凝胶过滤柱层析相结合的方式对svv抗原进行纯化，并对该新的纯化方式提供连贯、完整、步骤关联的实施方案，具体包括以下步骤：

(1)、去除细胞碎片：在转速3000-8000rpm下，svv抗原用连续流离心机离心15-30min，弃去细胞碎片等沉淀，收集上清液备用。

(2)、初步浓缩纯化：采用切向流过滤系统(使用切向流过滤膜)对步骤(1)得到的上清液进行超滤浓缩，并进行等体积流加方式洗滤，洗滤时缓冲液流加速率等于上清液透过切向流过滤膜的透过速率，收集切向流过滤系统浓液区的液体，即为浓缩液；过滤系统中的切向流过滤膜为中空纤维或膜包，可根据分子的大小选择性滤过，使小分子物质透出，从而达到浓缩和初步纯化的目的，其截留分子量300-750kda，操作压力小于2bar，浓缩倍数为5-20倍。

(3)、精细纯化：考虑到凝胶过滤介质与svv抗原不发生吸附，svv在洗脱时会首先被洗脱下来，从而与其它物质分离开来，能将病毒液中的svv抗原与其他杂质分离开来，达到svv抗原纯化的目的。具体为：步骤(2)得到的浓缩液直接上样在凝胶过滤层析柱(其中的凝胶过滤介质购自博格隆(上海)生物技术有限公司)上，上样量最高可达到50％cv，用平衡液洗脱，收集所需流穿样，即紫外吸收的第一个吸收峰，洗脱所用的平衡液为20mm磷酸盐缓冲液，电导值为15-20ms/cm，ph为7.0-8.5；纯化结束后，可对凝胶过滤层析柱中的凝胶过滤介质进行清洗再生，具体为：用纯水冲洗凝胶过滤介质2cv，用0.5-1mnaoh原位清洗至2cv后，用纯水冲洗凝胶过滤介质至ph为中性，然后20％乙醇冲洗1cv进行保存。

本发明提供了一种塞尼卡谷病毒抗原的纯化方法，为塞尼卡谷病毒快速提纯、浓缩提供了可工业化生产的工艺方法，为高效制备塞尼卡谷病毒疫苗提供了技术支撑。通过细胞悬浮培养的方式对塞尼卡谷病毒进行增殖培养后，本发明方法采用切向流过滤对增殖的病毒进行浓缩和粗提纯，然后用凝胶过滤柱层析对病毒进行精细纯化，制备得到的塞尼卡谷病毒抗原纯度可大于85％。该方法可根据生产规模进行扩缩，用于生产高抗原含量的精制塞尼卡谷病毒疫苗。

以下结合具体实施例，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明进行限制。

实施例1：

(1)、取a型塞尼卡谷病毒悬浮培养液6l，tcid50/ml为7.0，蛋白含量为4807μg/ml；将该塞尼卡谷病毒悬浮培养液经4000r/min离心25min，丢弃细胞碎片等沉淀，收集上清液备用。

(2)、将步骤(1)中上清液用截留分子量为500kda的中空纤维膜(gehealthcare)进行超滤浓缩，浓缩倍数为10倍，超滤过程中压力控制小于2bar，得到浓缩液。

(3)、使用凝胶过滤介质进行层析柱装填，配制电导值为15ms/cm，ph为7.0的磷酸盐缓冲液作为平衡液，采用自动层析系统对步骤(2)中的浓缩液进行上样，上样结束后使用平衡液对层析柱进行洗脱，收集出峰直至紫外检测信号下降至平稳的流穿样(见图1，横坐标代表运行体积，纵坐标代表紫外吸收值大小，即收集运行体积62-150ml的流穿样，为含有目标蛋白的流穿样)，即为纯化后的塞尼卡谷病毒抗原液。

纯化结束后，可使用1.0m的naoh溶液对层析柱的凝胶过滤介质进行再生处理。

对步骤(2)得到的超滤浓缩液和步骤(3)收集的流穿样分别使用tcid50方法测定svv抗原含量，计算回收率；使用bca蛋白检测试剂盒测定蛋白含量，计算蛋白去除率。对收集的流穿峰样进行sds-page检测，检测结果如图2所示(图中画框的条带为目标蛋白的条带)。计算和检测结果显示，步骤(2)得到的svv病毒10倍浓缩液中tcid50/ml为8.0，蛋白含量为3844μg/ml，蛋白去除率92.0％，抗原回收率100％；步骤(3)收集的流穿样体积为890ml，tcid50/ml为7.75，蛋白含量为132μg/ml，蛋白去除率94.9％，抗原回收率83.4％。抗原回收率高也表明了用本发明方法纯化后的病毒完整性好。

实施例2：

(1)、取a型塞尼卡谷病毒悬浮培养液2l，tcid50/ml为7.0，蛋白含量为4807μg/ml；将该塞尼卡谷病毒悬浮培养液经6000r/min离心20min，丢弃细胞碎片等沉淀，收集上清液备用。

(2)、将步骤(1)中上清液用截留分子量为500kda的中空纤维膜(gehealthcare)进行超滤浓缩，浓缩倍数为10倍，超滤过程中压力控制小于2bar，得到浓缩液。

(3)、使用凝胶过滤介质进行层析柱装填，配制电导值为20ms/cm，ph为7.8的磷酸盐缓冲液作为平衡液，采用自动层析系统对步骤(2)中的浓缩液进行上样，上样结束后使用平衡液对层析柱进行洗脱，收集出峰直至紫外检测信号下降至平稳的流穿样，即为纯化后的塞尼卡谷病毒抗原液。

纯化结束后，可使用1.0m的naoh溶液对层析柱的凝胶过滤介质进行再生处理。

对步骤(2)得到的超滤浓缩液和步骤(3)收集的流穿样分别使用tcid50方法测定svv抗原含量，计算回收率；使用bca蛋白检测试剂盒测定蛋白含量，计算蛋白去除率。计算结果显示，步骤(2)得到的svv病毒10倍浓缩液中tcid50/ml为8.25，蛋白含量为3747μg/ml，蛋白去除率92.12％，抗原回收率100％；步骤(3)收集的流穿样体积为355ml，tcid50/ml为8.5，蛋白含量为112μg/ml，蛋白去除率94.7％，抗原回收率99.83％。

可见，本发明纯化方法纯化效果好，杂蛋白去除率高，纯化后没有化学试剂残留；用本发明方法纯化后的塞尼卡谷病毒抗原纯度较高，用来免疫动物安全性高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的内容。