利用海洋真菌黄柄曲霉HN4-13生产大黄素的培养基及其制备方法与流程

本发明属于微生物技术领域，具体地说，是涉及用于生产重要中药活性分子大黄素的培养基的技术领域，更具体地说，是关于一种利用海洋真菌黄柄曲霉生产大黄素的培养基及其制备方法。

背景技术：

重要中药活性分子大黄素因其药用价值而闻名，具有多种重要的生物活性。近年来，许多学者通过对大黄素药理作用机制的大量深入研究，发现大黄素不但具有抗菌抗炎、抑制细胞增殖和提高免疫的药理作用，还具有治疗糖尿病肾病、肝硬化、抗肿瘤的作用，是治疗阿尔茨海默病和肝病的潜在药物，除了药物应用，大黄素还具有工业应用，可作为食品添加剂、染料、造纸和化妆品中的组分。大黄素可以从植物、真菌甚至一些动物中分离出来，但迄今为止，大多数仍是从草药中获得的，例如掌叶大黄。大黄虽然种植成本低，但是具有较长的生长周期，且不能连续种植，后续加工繁琐，人工成本高，占用大量耕地。因此，迫切需要具有更高效、更廉价和环境更友好的方式生产大黄素。因此通过微生物发酵法生产中药活性分子，可以缓解中医药领域“好药无源”、“过度采伐(挖)”和“与粮争地”等问题。

海洋真菌黄柄曲霉(aspergillusflavipes)的菌株编号：hn4-13，属半知菌纲、壳霉目(sphaeropsidales)、杯霉科(discellaceae)、曲霉属(aspergillus)真菌，由南京大学谭仁祥教授团队提供。海洋真菌黄柄曲霉hn4-13经液体或固体发酵可产生多种代谢物，包括生物碱类、萜类化合物、蒽醌类化合物等天然物质。大黄素是其产生的一种蒽醌类次级代谢物，大黄素纯品是一种橙黄色长针状结晶，其具有抗微生物、抗肿瘤活性、免疫抑制等作用，是一种重要的中药活性分子。

黄柄曲霉在初始发酵工艺下的大黄素产量极低，产率极差，发酵水平处于摇瓶水平，发酵工艺尚未优化，因此，从大黄素高产培养基开发、发酵工艺优化，生物反应器水平的发酵规模化放大角度进行研究，存在巨大的开发潜力。因此通过改善其发酵培养基，优化发酵工艺以提高大黄素产率已成为当务之急。

目前比较成熟的优化培养基的方法有单因素实验、plackett-burman(筛选实验设计，简称pb)设计、正交实验、响应面设计等。

其中，plackett-burman设计，可对多个不同因子的响应值的显著性进行分析，从而找出对发酵产量或者细胞生长最为重要的培养基组分，该方法分别对每个因子取高(+1)和低(-1)两个水平，通过每个因子两水平之间的差异与整体差异之间的统计分析来确定各因子对相应变量的显著性。该方法可大大提高筛选效率，能以最少的试验次数使因素的主效果得到尽可能精准的估计。

响应面设计方法由box-wilson方法发展而来，它是采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过响应面和等高线分析，能够精准地研究各因子与响应变量之间的关系，优化出最佳工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。响应面法是一种适用性强的实验设计方法，包括实验设计、建模及寻求因子水平最佳操作条件等功能，显示出了其他方法所不具备的优点。该方法不但具备试验次数少、周期短、精度高等优点，而且可以对各因子水平及其交互作用进行优化和评价，可快速有效的确定多因子系统的最佳条件。

技术实现要素：

本发明的主要目的就是针对以上现状，解决限制对海洋真菌黄柄曲霉产大黄素产率低的瓶颈问题，提供一种能显著提高大黄素的产量的用于发酵海洋真菌黄柄曲霉生产大黄素的培养基及其制备方法，及使用该培养基发酵大黄素的方法。为此，本发明通过联用pb设计和响应面设计，通过摇瓶实验确定重要因素，再针对重要因素得到最佳的组分水平，发现可大大加快获得最佳的培养基组成，且获得的培养基的成分简单，制备方法操作方便，成本低廉，不需特殊设备，而使用该培养基发酵海洋真菌黄柄曲霉hn4-13生产大黄素，能显著提高大黄素的产量。因此，本发明的第一个目的是提供一种利用海洋真菌黄柄曲霉hn4-13生产大黄素的培养基。本发明的第二个目的是提供一种上述所述的培养基的制备方法。本发明的第三个目的是一种使用上述所述的培养基发酵生产大黄素的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

作为本发明的第一个方面，一种利用海洋真菌黄柄曲霉hn4-13生产大黄素的培养基，每升培养基包括如下重量份的组分：

可溶性淀粉40-60g、酵母浸膏10-15g、磷酸二氢钾0.5-1.5g、海盐30-45g、七水硫酸镁0.5-0.75g、七水硫酸亚铁0.01-0.015g，余量为去离子水。

根据本发明，所述培养基的ph值为5.0-5.5。

根据本发明，每升所述培养基包含如下重量份的组分：可溶性淀粉40-60g、酵母浸膏8-12g、海盐30-45g、磷酸二氢钾0.8-1.2g、七水硫酸镁0.4-0.6g、七水硫酸亚铁0.008-0.012g，余量为去离子水。

优选的，每升所述培养基包含如下重量份的组分：可溶性淀粉50g、酵母浸膏10g、海盐30g、磷酸二氢钾1g、七水硫酸镁0.5g、七水硫酸亚铁0.01g，余量为去离子水。

作为本发明的第二个方面，一种如上述所述的利用海洋真菌黄柄曲霉hn4-13生产大黄素的培养基的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、将可溶性淀粉、酵母浸膏、海盐、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、七水硫酸亚铁按上述重量份称量后，加入去离子水中定容至1l；

步骤二、以盐酸调节ph值至5.0-5.5，然后在121℃下灭菌15-30分钟，灭菌后即得海洋真菌黄柄曲霉生产大黄素的培养基。

作为本发明的第三个方面，一种使用上述所述的培养基发酵生产大黄素的方法，包括如下步骤：

步骤一、将冷冻保存的海洋真菌黄柄曲霉hn4-13解冻后，在固体平板培养基中央进行点样并活化培养4-6天，获得新鲜固体平板培养基，固体平板培养基每隔30天重新活化一次；

步骤二、从步骤一的海洋真菌黄柄曲霉hn4-13的固体平板培养基中挖取1块琼脂块，接种至种子培养基发酵培养1-3天，获得新鲜种子液；

步骤三、取步骤二的新鲜种子液，按6-22％(v/v)的接种量接入上述所述的培养基，以30±2℃、180±20rpm摇床振荡培养6-8天后，获得发酵液；

步骤四、取步骤三的发酵液进行超声萃取、减压旋蒸、纯化，获得大黄素。

根据本发明，每升所述的固体平板培养基包含有如下重量份的组分：葡萄糖40g、蛋白胨10g、海盐30g、磷酸二氢钾40g、琼脂粉15-20g，余量为去离子水。

根据本发明，每升所述的种子培养基包含有如下重量份的组分：葡萄糖40g、蛋白胨10g、海盐30g，余量为去离子水。

本发明的有益效果：

1、本发明的培养基成分包括可溶性淀粉、酵母浸膏、海盐、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、七水硫酸亚铁，其原料易得，价格低廉，有利于推广应用；

2、制备本发明的培养基只需将上述原料以去离子水溶解，方法简单，难度低，无需专门技术培训及特殊仪器设备；

3、采用本发明的培养基及方法发酵培养海洋真菌黄柄曲霉，该菌株在该培养基中生长迅速，使用该培养基发酵培养黄柄曲霉生产大黄素，可提高目标产物大黄素的产量，为后期纯化工作降低难度，如图1所示，大黄素的最高产量可达到124.90mg/l，是原始水平的11倍；

4、本发明的转化应用将有利于野生中药材资源的复苏和保护，促进中药资源的可持续发展和利用，保障中国人民耕地安全和身体健康。

附图说明

图1-2为本发明的筛选碳氮源优化基础培养基过程的实验结果图；

图3为本发明的基础培养基对比原始培养基的实验结果图；

图4为基于plackett-burman实验结果，以可溶性淀粉(x1)为确定最优区域的中心点而进行的单因素的实验结果图；

图5为基于plackett-burman实验结果，以磷酸二氢钾(x2)为确定最优区域的中心点而进行的单因素的实验结果图；

图6为基于plackett-burman实验结果，以七水硫酸亚铁(x3)为确定最优区域的中心点而进行的单因素的实验结果图；

图7-9为利用designexpert12数据处理软件，建立回归方程后获得的三个因子可溶性淀粉、磷酸二氢钾、七水硫酸亚铁对大黄素产量的响应面分析图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或厂商提供的条件进行。

应当说明，本发明选用的培养基成分均为市售产品。可溶性淀粉、硫酸镁、硫酸亚铁购自国药集团化学试剂有限公司；酵母浸膏购自上海麦克林生化科技有限公司，海盐购自山东潍坊百年盐业；磷酸二氢钾购自上海泰坦科技股份有限公司。

1、本发明的所用的菌种：

海洋真菌黄柄曲霉aspergillusflavipeshn4-13，由南京大学谭仁祥教授团队提供。

2、固体平板培养基：

每升所述的固体平板培养基包含有如下重量份的组分：葡萄糖40g、蛋白胨10g、海盐30g、磷酸二氢钾40g、琼脂粉15-20g，余量为去离子水。

3、种子培养基：

每升所述的种子培养基包含有如下重量份的组分：葡萄糖40g、蛋白胨10g、海盐30g，余量为去离子水。

实施例1

1、碳氮源优化

在筛选了20余种培养基后，确定培养基配方为葡萄糖40g/l，蛋白胨10g/l，海盐30g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁0.5g/l，硫酸亚铁0.01g/l。将基础发酵培养基的葡萄糖分别替换为蔗糖、甘露醇、麦芽糖、可溶性淀粉，每种碳源的c摩尔数量相同。将蛋白胨分别替换为黄豆粉、玉米浆、硫酸铵、酵母提取粉、酵母浸膏。每种氮源的n摩尔数量相同。其他组分不变，每组3个平行。实验结果如图1至图2所示。图1和图2的结果显示，最优碳源为可溶性淀粉，最优氮源为酵母浸膏。

2、培养基的配置

1)原始培养基的配置(对照组)

准确称取葡萄糖40g/l，蛋白胨10g/l，海盐30g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁0.5g/l，硫酸亚铁0.01g/l。以去离子水溶解，并定容至1000ml。

2)发酵培养基的配制(实验组)

准确称取可溶性淀粉50g、酵母浸膏10g、海盐30g、磷酸二氢钾1g、七水硫酸镁0.5g、七水硫酸亚铁0.01g，以去离子水溶解，并定容至1000ml。

3、发酵操作过程

将-80℃保存的海洋真菌黄柄曲霉解冻后，用接种针在固体平板培养基中央进行点样，置于28℃恒温培养箱，活化培养4-6天，获得新鲜固体平板培养基，然后置于4℃冰箱保存。用接种铲从新鲜的海洋真菌黄柄曲霉的固体平板培养基中挖取1块5×5mm琼脂块，接种至装有50ml种子培养基的250ml摇瓶中，以28℃、180rpm摇床发酵培养1-3天，获得新鲜种子液。取新鲜种子液，按6-22％(v/v)的接种量接入所述的培养基(包括实验组和对照组)，以32℃、180rpm摇床振荡培养7天，获得发酵液。

3)大黄素产量检测

取50ml所获发酵液于250ml锥形瓶中，加入100ml乙酸乙酯密封后，置于超声下萃取0.5小时，并重复三次，然后取上层有机相进行减压旋转蒸馏除去乙酸乙酯，残留物用20ml无水甲醇溶解；在相对离心力为13780×g的条件下离心3分钟后，取500μl上清液，用高效液相色谱法测定大黄素的含量，进而通过标准曲线换算成所述发酵液中大黄素的实际含量。实验结果如图3所示。

结果显示，采用实验组的基础培养基测得目标产物大黄素的产量为124.90mg/l。

实施例2试验设计、数据分析及检测结果

1)plackett-burman试验设计

plackett-burman试验设计，可对多个不同因子对响应值的显著性进行分析，从而找出对发酵产量或细胞生长最为重要的培养基组分，分别对每个因子取高(+1)和低(-1)两个水平，通过每个因子两水平之间的差异与整体差异之间的统计分析来确定各因子对相应变量的显著性。通过designexpert12数据处理软件设计，本实验选取影响因素5个(海盐是海洋真菌黄柄曲霉生长必要成分，海盐过高，渗透压过高，影响生长，海盐过低，无法生长。因此，海盐通常设置在30-45g/l。因此此实验不将其包含在内)，选用了n＝12的pb试验设计表。各参数所代表的因素及水平见表格(参见表1和表2)。表1中x1，x2，x3，x4，x5分别代表可溶性淀粉、酵母浸膏、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、七水硫酸亚铁。实验结果分析见表3。

表1plackett-burman设计实验结果

表2plackett-burman设计实验培养基浓度

表3plackett-burman设计实验结果分析

通过大黄素的产量和产率对五个因子进行分析，分析结果如表1，3所示，其中当p<0.05时，表明该因子对于大黄素的产量和产率有显著影响，故选择可溶性淀粉、磷酸二氢钾、七水硫酸亚铁三种因子进行下一步的响应面优化。

实施例3单因子梯度试验

基于plackett-burman实验结果，选取可溶性淀粉(x1)、磷酸二氢钾(x2)、七水硫酸亚铁(x3)进行响应面分析，以考察其相互作用关系并优化其组成。为得到较为准确的响应面分析结果，首先确定接近最优区域的中心点。采用单因子梯度变化确定中心点，实验结果如图4至图6所示，可溶性淀粉50g/l、磷酸二氢钾1g/l、七水硫酸亚铁0.01g/l最有利于大黄素的生产。因此，最终选定此组合作为中心点进行下一步响应面优化实验。

实施例4响应面试验设计

响应面实验采用三元一次中心组合设计(centralcompositedesign)，每组3个平行，采用统计学软件designexpert12设计实验，各因素水平安排及大黄素产量见表4，各因子编码水平按(-1.68,-1,0,1,1.68)分别对应可溶性淀粉x1(33.2,40,50,60,66.8g/l)、磷酸二氢钾x2(0.664,0.8,1,1.2,1.336g/l)及七水硫酸亚铁x3(0.00664,0.008,0.01,0.012,0.01336g/l)，其他组分不变。

表4中心组合设计表及大黄素产量

采用designexpert12对实验结果进行数据处理，中心组合实验数据方差分析结果见表5、6，p<0.05表示相关显著，得到方程为：

y＝124.15+17.51x1+2.19x2-1.79x3+7.16x1x2+2.78x1x3-3.22x2x3-10.25x1²-21.47x2²-13.5x3²

方程决定系数r²＝0.9665(由designexpert12给出)表明实验结果的96.65％可以被模型解释，方程拟合良好。相对偏差cv＝7.5％在合理范围内。调整决定系数adjr²＝0.9364与决定系数接近，进一步证明了模型的可靠性。

表5中心组合设计实验结果方差分析

表6中心组合设计实验结果方差分析

图7至图9为中心组合设计实验所得的响应面图(可溶性淀粉x1，磷酸二氢钾x2，七水硫酸亚铁x3)，由图可知各拟合曲面有最大值(响应面顶点)，即各因子两两间相互作用，存在有利于大黄素生产的最优组合。因此，在上述分析的基础上，通过designexpert12软件进行优化预测(即对拟合方程求偏导)。最终优化结果为可溶性淀粉59.3g/l(编码值0.926)，磷酸二氢钾1.04g/l(编码值0.205)，七水硫酸亚铁0.01001g/l(编码值0.005)时，大黄素有最大产量132.47mg/l。

实施例5摇瓶试验

为检验该统计学方法的有效性和可靠性，后续需要按上述预测配方进行实验验证，验证3次，每次3个平行。实验结果如表7所示。最终，实验结果132.40mg/l与预测值132.47mg/l相近，证明了回归方程的可靠性和统计学方法的有效性。

表7优化后培养基产量验证

综上所述，本发明的培养基成分简单，制备方法操作方便，成本低廉，不需要特殊设备，能显著提高海洋真菌黄柄曲霉aspergillusflavipeshn4-13生产大黄素的产量。

以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。