一株枝孢菌及其在降解聚氨酯塑料中的应用的制作方法

本发明属于生物处理技术领域，涉及一株枝孢菌及其在降解聚氨酯塑料中的应用。

背景技术：

聚氨酯(pu)是由多异氰酸酯、多元醇和扩链剂三种组分缩合而成的含有氨基甲酸酯键重复单元结构的聚合物。它是一种半结晶的热固性塑料，其中异氰酸酯是构成结晶部分，称为pu的硬段，决定其硬度和拉伸强度；而多元醇和扩链剂是构成非结晶部分，称为pu的软段，决定其弹性及延伸特性。通过改变多元醇和异氰酸酯的类型和比例，可以产出各种性质pus。因此，pu的产品比其他塑料更加多样化，且由于其优良的机械性能，pu塑料被广泛的应用于保温建材、包装材料、汽车材料、合成革、鞋类材料、涂料、医用材料等。而大量pu产品的广泛使用产生了很多的废弃塑料，而又缺乏合理的回收处理，因此对生态系统造成了严重的破坏与威胁。

pu具有高度疏水性且自然条件下难以降解，要直接以此为底物着手筛选到能高效降解pu塑料的微生物或酶非常困难。目前大多数研究都是以impranildln作为结构模拟物来筛选pu塑料的降解菌。impranildln被称为水性聚酯型聚氨酯分散体，呈乳白色液体状，是一种大小为0.1～0.2μm的纳米颗粒，可以均匀的分散在水中。由于impranildln不透明的性质，因此可以制成乳白色，不透明的平板，通过其被水解而形成的水解圈去筛选降解微生物。目前有一些对impranildln有降解效果的微生物被分离出来：一种从番石榴茎中分离得到的内生真菌(pestalotiopsismicrosporae2712a)，它可以利用impranildln作为唯一的碳源，两周内能够降解近99％的impranildln；pseudomonasputida对impranildln表现出很强的水解活性，4天内对其降解率可达92％。但是降解pu塑料的微生物或酶种类非常少，还处于挖掘阶段，而本研究筛选到的降解菌株将为pu塑料的生物降解研究奠定良好的理论基础与借鉴。

技术实现要素：

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株枝孢菌。

本发明还要解决的技术问题是提供上述枝孢菌在降解聚氨酯塑料中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一株枝孢菌，其分类命名为枝孢菌(cladosporiumsp.)，菌株名为p7，已保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，菌株保藏编号为cctccno：m2020627，保藏日期为2020年10月23日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。

其中，所述的枝孢菌的筛选方法为以impranildln为唯一碳源的无机盐养基，在该培养基作为介质，从垃圾填埋场中连续富集驯化具有聚氨酯塑料利用能力的菌株，即对垃圾填埋场土壤中的pu降解菌株进行分离筛选。具体地，以垃圾填埋场土壤作为筛选目标，利用含不同浓度impranildln的无机盐培养基作为介质，连续富集驯化具有impranildln利用能力的菌株，将无机盐培养基稀释涂布于含有1％(v/v)impranildln的无机盐固体培养基，30℃培养7-14d，将具有水解圈的菌株，划线分离获得纯培养，命名为菌株p7；将菌株p7于30℃培养箱，培养5天后，菌落呈圆形或椭圆形，菌落表面有暗色绒毛状菌丝，向上突起，并有褶皱，边缘和背部呈现黑色。将菌株p7的its序列在ncbi中进行比对，结果发现与枝孢菌属(cladosporiumsp.)同源性最高，且与cladosporiumpini-ponderosae(nr_119730.1)的相似性高达99.01％，因此被鉴定为cladosporiumsp.p7。其中，所述枝孢菌的its的核苷酸序列如seqidno.1所示。

一种微生物菌液，其包括上述的枝孢菌，也在本发明的保护范围之内。

上述枝孢菌或上述微生物菌液在降解水性聚氨酯(impranildln)中的应用，也在本发明的保护范围之内。

其中，所述的应用为将所述枝孢菌的种子液接种于含有impranildln的无机盐培养基中，培养，即能降解impranildln。

其中，所述的种子液的制备方法为将所述的菌株接种到pda固体培养基上，于30℃培养5天，取10ml无菌水滴于平板上，用涂布棒刮取表面的菌丝体及孢子，通过血球计数板计数，稀释成终浓度为1×10⁶孢子/ml浓度的菌悬液作为降解试验种子液。

其中，将所述枝孢菌的种子液以1％以上的体积比接种于含有impranildln的无机盐培养基中。

其中，所述的含有impranildln的无机盐培养基中impranildln的终浓度为0.25％～1.5％v/v。

其中，所述的培养为在25～40℃、ph6.0～8.0的条件下进行培养。

上述枝孢菌或上述微生物菌液在降解聚氨酯中的应用，也在本发明的保护范围之内。

其中，所述的应用为将所述枝孢菌的种子液接种于含有聚氨酯(pu)的培养基中，培养，即能降解聚氨酯。

其中，将所述枝孢菌的种子液以10％的体积比接种于含有聚氨酯的培养基中。

其中，所述的含有聚氨酯的培养基中聚氨酯的终浓度为4g/l。

其中，所述的培养基为50％马铃薯液体培养基。

其中，所述的培养为在25～40℃、120rpm的条件下进行培养。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

(1)本发明以垃圾填埋场土壤为分离材料，分离纯化到一株可以高效降解pu模拟物impranildln的微生物，对pu和其他塑料生物降解具有非常具有现实意义与借鉴的价值。本发明该菌株对pu模拟物impranildln和偏向真实塑料pu泡沫的降解效果都处于较高水平，适合应用在pu垃圾的生物治理上。

(2)发明所采用的菌株p7可以利用impranildln为唯一碳源生长，在7天内对水性聚氨酯impranildln的降解率达95.8％。此外，该菌株对聚氨酯泡沫有着较高的降解效果，在15d可降解86.6％聚氨酯泡沫。因此，本发明对于塑料废弃物的生物治理上有着极其重要的应用价值。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为不同浓度impranildln对应吸光值的标准曲线。

图2为菌株p7和相关种its序列系统发育树。

图3为菌株p7对impranildln的降解曲线。

图4为菌株p7降解impranildln中胞外上清酯酶活性变化。

图5为菌株p7对impranildln的降解性能研究：(a)不同温度对菌株p7降解impranildln的影响；(b)不同ph对菌株p7降解impranildln的影响；(c)不同底物浓度对菌株p7降解impranildln的影响；(d)不同接菌量对菌株p7降解impranildln的影响。

图6为菌株p7对聚氨酯泡沫的降解水平研究：(a)菌株p7降解pu泡沫15d后泡沫的降解实物图；(b)p7对pu泡沫的降解随时间变化图。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1：对高效降解impranildln菌株cladosporiumsp.p7的分离筛选及菌株鉴定

取5g垃圾填埋场土壤样品置于100ml含0.2％(v/v)impranildln的富集培养基中，于30℃、180rpm培养7d。用紫外分光光度计测定富集液中对impranildln的降解情况，确定对impranildln被降解后，以10％(v/v)的接种量接入到含0.4％(v/v)impranildln富集培养基中，继续富集并测定降解情况，按此方法直至impranildln浓度提高至1％(v/v)，接着传代4次。

将对impranildln富集液经梯度稀释后涂布于以1％(v/v)impranildln为唯一碳源的无机盐平板上，于30℃培养箱中分别培养1～7d。将菌落形态不同的单菌落分别划线于lb平板纯化，并接种于以0.5％(v/v)impranildln为唯一碳源的液体无机盐培养基中，于30℃、180rpm摇床培养7d后，取1ml样品离心收集上清，用紫外分光光度计来检测impranildln的含量。通过紫外分光光度计测得od600值发现，与对照不加菌的摇瓶对比，编号为p7的菌株的上清液的od600值下降的最为明显。

上述无机盐培养基是由硝酸铵1.0g，氯化钠1.0g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾1.5g，加水至1.0l配制，调节ph值至7.0，固体培养基加入琼脂20.0g、121℃灭菌20min，使用前添加impranildln作为碳源。

上述lb培养基是由蛋白胨10.0g，酵母粉5g，氯化钠5.0g，加水至1.0l配制，调节ph值至7.0，固体培养基加入琼脂20.0g，121℃灭菌15min。

对菌株p7进行its鉴定：利用引物its1：5`-tccgtaggtgaacctgcgg-3`和its4：5`-tcctccgcttattgatatgc-3`扩增p7的its序列，通过t/a克隆的方式连接至克隆载体pmd19t，构建重组克隆载体pmd19t-16s，将其转化到克隆宿主菌escherichcolidh5α获得重组微生物escherichcolidh5α(pmd19t-16s)，将所获得的重组微生物外源片段进行测序，ncbi数据库比对该its序列，构建了菌株p7和相关种its序列系统发育树，在分子水平上将菌株p7鉴定至枝孢菌属(图2)，其its的核苷酸序列如序列表中seqidno.1所示。

实施例2：cladosporiumsp.p7对impranildln的降解曲线及降解过程中酯酶活性的变化

(1)不同浓度impranildln标曲的制作：分别配置浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0％(v/v)的impranildln无机盐培养基(其中1％v/v等于6g/l的dln)，分别于od600nm测定，绘制标准曲线，如图1所示。

dln降解率计算公示如下：

dln降解率％＝(初始浓度-终浓度)/初始浓度*100％

(2)从pda平板上用无菌水洗下p7菌丝体，用涂布棒刮取表面的菌丝体及孢子，通过血球计数板计数，制成终浓度为1×10⁶孢子/ml浓度的菌悬液，即种子液。

(3)在impranildln浓度为1％(v/v)的无机盐培养基中，按5％(v/v)接种量接入种子液，于30℃、150rpm震荡培养，每隔24h取样一次，4000rpm、4℃条件下离心5min(将菌体聚集于底部降低菌体对透明度的影响)，测定发酵上清液的od600nm，并根据图1所示的标准曲线计算impranildln的浓度。

由图3可以看出，对照组(不接菌)并没有降解迹象，说明impranildln不会自发进行水解；处理组中，菌株p7接种到培养基中1d，就开始降解impranildln，而没有明显的延滞现象；之后降解速率逐渐增加，在第六天降解率达95.8％，随后保持稳定。对菌株p7在降解过程中的胞外酯酶活性进行了检测，发现是存在酯酶的，并且在72h酯酶活性达到最高为1.24u/ml(图4)，因此推测酯酶在impranildln降解的过程中起到非常重要的作用。

实施例3：cladosporiumsp.p7对impranildln降解性能的研究

将1×10⁶孢子/ml的种子液以10％(v/v)接种量接入impranildln终浓度为1％(v/v)的无机盐培养基中，分别于20、25、30、37和42℃，120rpm摇床培养7d，检测impranildln残留量，计算降解率，研究温度对降解impranildln的影响。如图5a所示，菌株p7的最适降解温度为30℃，此时impranildln的降解率最高，降解率为97％；在温度为25℃和37℃时，菌株p7的降解百分比分别为88％和77％；在温度较低(20℃)或较高(42℃)时，菌株p7对impranildln的降解率都低于40％。这说明低温不利于菌株p7对impranildln的降解。

将1×10⁶孢子/ml的种子液以10％(v/v)接种量分别接种于初始ph为4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0的无机盐培养基中，其中impranildln终浓度为1％(v/v)，30℃、120rpm摇床培养7d，检测impranildln残留量，计算降解百分比，研究ph对降解impranildln的影响。如图5b所示，菌株p7的最适降解ph为7.0，此时impranildln的降解率最高。在ph范围为6.0～8.0时，impranildln的降解百分比都维持在70％以上，说明在弱酸和弱碱的条件下对impranildln的降解影响不大。而当ph小于6或者大于8的时候，其降解效果显著降低。

将1×10⁶孢子/ml的种子液以10％(v/v)接种量分别接种于impranildln终浓度为0.5、0.75、1、2％(v/v)的无机盐培养基中，30℃、120rpm摇床培养，每隔24h取样检测impranildln残留量，计算降解率，研究底物浓度对降解impranildln的影响。如图5c所示，impranildln初始浓度对菌株p7的降解有显著的影响。当impranildln浓度低于1％(v/v)时，菌株p7可以在168h完全降解impranildln。而当底物浓度为2％(v/v)时，impranildln的降解率仅为40.2％，这表明当底物浓度过高时，菌株p7的生长受到抑制，从而降低对impranildln的降解效果。

将1×10⁶孢子/ml的种子液分别以1％(v/v)、5％(v/v)、10％(v/v)、20％(v/v)接种量接入impranildln终浓度为1％(v/v)的无机盐培养基中，30℃、120rpm摇床培养，每隔24h取样检测impranildln残留量，计算降解率，研究不同接种量对降解impranildln的影响。如图5d所示，当接种量为5％、10％、20％时，168h后菌株p7对impranildln的降解率都可达到97％以上，且降解率随着接种量的增大而增大。结果表明菌株p7可以impranildln为唯一碳源生长代谢，且降解效果与接种量成正比。

通过以上实验，确定了降解菌株p7可以利用impranildln为唯一碳源，并且在168h菌株p7对impranildln的降解率可达到97％。

实施例4：cladosporiumsp.p7对pu泡沫降解能力的研究

将pu泡沫切成4*2.5*0.8cm的大小(0.3g左右)，浸泡于75％酒精中10min，取出烘干，接种前紫外灭菌30min。将1×10⁶孢子/ml的种子液以10％(v/v)接种量接入灭菌后的含0.2g的50mlpu泡沫的50％马铃薯液体培养基中，30℃，120rpm震荡培养。在第5，10，15d分别取样，将泡沫上的菌体用2％sds去除，再用蒸馏水清洗干净，于50℃培养箱烘干至恒重，使用分析天平进行称重。

由图6可以看到对照在15d内没有明显的质量损失，在第15d的质量损失仅为2.8％；但菌株p7对泡沫有着较好的降解效果，在5，10，15d的时候质量损失分别达15.23％，40.45％和86.6％。由于只是初步降解实验探索，因此仅考察到第15d，后续将拉长周期研究其降解效果。确定了菌株p7可以利用pu泡沫，在15d对其降解率高达86.6％。因此该菌株不仅能利用水性聚氨酯impranildln，也能利用更加接近真实塑料的pu泡沫，将为pu的生物降解研究奠定坚实的理论基础，在pu以及其他塑料的生物治理上具有巨大潜能。

本发明提供了一株枝孢菌及其在降解聚氨酯塑料中的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

序列表

<110>南京工业大学

<120>一株枝孢菌及其在降解聚氨酯塑料中的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>535

<212>dna

<213>枝孢菌(cladosporiumsp.)

<400>1

ctcgtgacacggtctacaccgggatgttcataaccctttgttgtccgactctgttgcctc60

cggggcgaccctgccttcgggcgggggctccgggtggacacttcaaactcttgcgtaact120

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