诱导新疆细虫草的无性型羽束梗孢进行微循环产孢的培养基和高效发酵方法

1.本发明属于属于新疆细虫草人工发酵培养，具体涉及一种诱导新疆细虫草的无性型羽束梗孢进行微循环产孢的培养基和高效发酵方法。


背景技术：

2.新疆细虫草(ophiocordyceps gracilis)，又名黑槌虫草、阿尔泰虫草等，是其无性型羽束梗孢(paraisaria dubia)的子囊孢子、分生孢子或者菌丝侵染寄主阿尔泰蝠蛾(hepialus altaicola)的幼虫或者蛹之后，形成的虫与菌的复合体。新疆细虫草与冬虫夏草同属于同一属ophiocordyceps，而且都以蝠蛾幼虫为寄主，药理药效与冬虫夏草类似，甚至某些方面优于冬虫夏草，也是中国一种名贵的中草药，常被用做冬虫夏草的代用药，已被收入新疆维吾尔自治区药品标准一书中。虽然新疆细虫草的价格远低于冬虫夏草，但是最近几年也面临着过度的采挖，使得其生境遭到严重破坏，资源严重锐减的问题，因此为了保护新疆细虫草资源，同时又能满足人们对新疆细虫草的需求，新疆细虫草的人工发酵培养成为解决这一问题的首选方案。
3.研究发现新疆细虫草的无性型菌羽束梗孢的液体发酵存在培养周期长、菌丝生物量低的问题，这使得工业化生产的成本高昂，严重制约了其工业化生产的进程，为解决这一问题，需要对其液体发酵培养进行探究。
4.产孢是真菌生活史中的重要环节，分生孢子是真菌的无性繁殖体，除正常产孢模式外，还有一种产孢模式为微循环产孢，是指有性或无性孢子萌发后，无营养菌丝生长或仅有极弱菌丝生长，而直接重复产孢的现象。迄今为止已在100多个物种中报道了微循环产孢，如：刺盘孢属、目霉属、青霉属等，其中冬虫夏草也具有微循环产孢，研究表明除自发进行微循环产孢的真菌外，不同真菌孢子通过高温、光、代谢产物诱导、营养缺失等逆境胁迫可诱导产生微循环产孢现象。


技术实现要素：

5.发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种诱导新疆细虫草的无性型羽束梗孢进行微循环产孢的培养基和方法，使用该培养基和方法可以显著缩短发酵周期由20d缩短为7d左右，提高菌丝生物量，增长率达300％，降低工业化生产成本，适合推广应用。
6.技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种诱导新疆细虫草的无性型羽束梗孢进行微循环产孢的培养基，包括微循环产孢培养基、孢子萌发培养基和优质发酵培养基；
7.所述微循环产孢培养基的配方为：葡萄糖15
‑
25g/l、蛋白胨10
‑
15g/l、znso4·
7h2o 0.01
‑
2g/l、mgso4·
7h2o 0.4
‑
1g/l、kh2po
4 1.5
‑
3g/l；
8.所述孢子萌发培养基的配方为：葡萄糖15
‑
25g/l、玉米水溶蛋白10
‑
15g/l、酵母粉3
‑
10g/l、mgso4·
7h2o 0.4
‑
1g/l、kh2po
4 1.5
‑
3g/l；
9.所述优质发酵培养基的配方为：葡萄糖15
‑
25g/l、玉米水溶蛋白10g/l、酵母粉3
‑
10g/l、znso4·
7h2o 0.001
‑
0.03g/l、mgso4·
7h2o 0.4
‑
1g/l、kh2po
4 1.5
‑
3g/l、cacl
2 1
‑
2g/l。
10.作为优选，
11.所述微循环产孢培养基的的配方为：葡萄糖20g/l、蛋白胨10g/l、znso4·
7h2o 0.7g/l、mgso4·
7h2o 0.8g/l、kh2po
4 2g/l；
12.所述孢子萌发培养基的配方为：葡萄糖20g/l、玉米水溶蛋白10g/l、酵母粉5g/l、mgso4·
7h2o 0.8g/l、kh2po
4 2g/l；
13.所述优质发酵培养基的配方为：葡萄糖20g/l、玉米水溶蛋白10g/l、酵母粉5g/l、znso4·
7h2o 0.005g/l、mgso4·
7h2o 0.8g/l、kh2po
4 2g/l、cacl
2 1.5g/l。
14.本发明所述诱导新疆细虫草的无性型羽束梗孢进行微循环产孢的高效发酵方法，包括如下步骤：
15.(1)配制普通基础培养基、微循环产孢培养基、孢子萌发培养基和优质发酵培养基；
16.(2)羽束梗孢菌种的活化：将斜面保存的羽束梗孢菌种转接至普通基础培养基进行菌种活化，培养，获得羽束梗孢菌球；
17.(3)孢子悬液的制备：将活化的羽束梗孢菌球接种于微循环产孢培养基中，接种后培养，获得孢子悬液。
18.(4)萌发态孢子液的制备：将制备的孢子悬液接种于孢子萌发培养基中，接种后培养，获得萌发状态的孢子液，萌发态孢子液作为后续液体发酵的种子液；
19.(5)液体发酵培养：将萌发态孢子液作为菌种接种于优质发酵培养基中，进行发酵培养。
20.其中，羽束梗孢菌种的活化：将斜面保存的羽束梗孢菌种转接至普通基础培养基中进行菌种活化，120r/min，20℃条件下培养约20d左右，获得羽束梗孢菌球；所述普通基础培养基的配方为：葡萄糖15
‑
25g/l、蛋白胨10
‑
15g/l、mgso4·
7h2o 0.4
‑
1g/l、kh2po
4 1.5
‑
3g/l，培养基于121℃蒸汽灭菌20min。
21.其中，步骤(3)接种量为5
‑
15％(体积比)，100
‑
160r/min，18
‑
25℃条件下培养约7d左右，获得孢子悬液。
22.作为优选，步骤(3)将活化的羽束梗孢菌球接种于微循环产孢培养基中，接种量为10％，120r/min，20℃条件下培养约7d左右，获得孢子悬液(4℃冰箱保存≤90d)，需要使用时可直接将孢子悬液接种于孢子萌发培养基中培养4
‑
7d，制备萌发态孢子液作为液体发酵的种子液。
23.其中，步骤(4)接种量为5
‑
15％(体积比)，100
‑
160r/min，18
‑
25℃条件下培养约4d左右。
24.作为优选，步骤(3)将制备的孢子悬液接种于孢子萌发培养基中，接种量为10％，120r/min，20℃条件下培养约4d左右，获得萌发状态的孢子液，萌发态孢子液作为后续液体发酵的种子液。
25.其中，步骤(5)接种量为5
‑
20％(体积比)，100
‑
160r/min，18
‑
25℃培养7d左右。
26.作为优选，步骤(5)将萌发态孢子液作为菌种接种于优质发酵培养基中，接种量为15％。120r/min，20℃条件下培养约7d左右。
27.本发明所述利用zn离子在诱导新疆细虫草的无性型羽束梗孢进行微循环产孢中的应用。
28.本发明发现微量元素zn作为液体发酵添加物可诱导新疆细虫草的无性型羽束梗孢进行微循环产孢，可以说使得液体培养中孢子由无到有，由原先液体培养的几乎不产孢增长为1.2
×
107个/ml。微循环产孢使得发酵液中含有大量出芽形成的分生孢子，而这些孢子大大提高了接种点，在此基础上本发明利用羽束梗孢的微循环产孢特点，采用三种培养基(微循环产孢培养基、孢子萌发培养基、优质发酵培养基)相结合的发酵策略使得羽束梗孢液体发酵周期缩短，菌丝产量提高。
29.本发明中使用的微量元素zn不同于常规真菌培养基，常规的真菌培养基中不含有zn或者添加了zn只是作为微量元素，并未明确指出其特定的功效。而在本发明中首次发现除高温、光、代谢产物诱导、营养缺失等逆境胁迫诱导真菌微循环产孢之外，微量元素也可影响真菌使其进行微循环产孢，本发明发现zn作为发酵添加物，可诱导羽束梗孢液体培养发生微循环产孢，玉米水溶蛋白显著刺激孢子萌发。羽束梗孢在液体普通培养基中乎不产孢，且孢子萌发周期长，这是其发酵周期长，菌丝生物量低的主要原因，所以本发明以含有zn的微循环产孢培养基培养，诱导羽束梗孢进行微循环产孢获得大量孢子液，以萌发态培养基培养孢子液，获得大量萌发态孢子悬液，以此接种于含有微量zn和玉米水溶蛋白为氮源的高效发酵培养基进行培养，可使得高效发酵培养中不断有新的孢子产生和萌发，故而能持续不断的产生新的接种点，来缩短发酵周期和提升菌丝生物量。
30.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
31.本发明提出了一种全新的诱导新疆细虫草的无性型羽束梗孢进行微循环产孢的培养基，并结合该培养基提出了一种高效发酵的方法，本发明经微循环产孢培养后由几乎不产孢增至孢子量可达1.2
×
107个/ml，以本发明提出的培养基相结合使用，按照本发明的培养策略，可使羽束梗孢的培养周期由原先的20d缩短为7d，菌丝生物量增长率达300％，由6g/l增长为24g/l。
32.本发明培养基的原料来源丰富易得，组成简单合理，发酵方法操作简单、条件稳定、易控制、成本低，为新疆细虫草的工业化发酵生产提升产量、降低成本，加快新疆细虫草的开发提供技术支撑。
附图说明
33.图1为诱导新疆细虫草微循环产孢的高效发酵培养方法的具体实施流程图；
34.图2为新疆细虫草的无性型羽束梗孢在不同培养条件下的菌液显微图；
35.图3为新疆细虫草的无性型羽束梗孢在zn诱导下的微循环产孢方式。
具体实施方式
36.根据下述实施例，可以更好地理解本发明。本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
37.羽束梗孢菌种为新疆细虫草的无性型由南师师范大学食品与制药工程学院提供，
也可采用任何野生型新疆细虫草的无性型菌羽束梗孢其效果相同。
38.水溶性玉米蛋白粉为br级，购自solarbio。
39.实施例1
40.以去离子水为溶剂配制各培养基
41.普通基础培养基的配方为：葡萄糖20g/l、蛋白胨10g/l、mgso4·
7h2o 0.8g/l、kh2po
4 2g/l，培养基于121℃蒸汽灭菌20min；
42.微循环产孢培养基的配方为：葡萄糖20g/l、蛋白胨10g/l、znso4·
7h2o 0.7g/l、mgso4·
7h2o 0.8g/l、kh2po
4 2g/l，培养基于121℃蒸汽灭菌20min；
43.孢子萌发培养基的配方为：葡萄糖20g/l、玉米水溶蛋白10g/l、酵母粉5g/l、mgso4·
7h2o 0.8g/l、kh2po
4 2g/l培养基于121℃蒸汽灭菌20min；
44.优质发酵培养基的配方为：葡萄糖20g/l、玉米水溶蛋白10g/l、酵母粉5g/l、znso4·
7h2o 0.005g/l、mgso4·
7h2o 0.8g/l、kh2po
4 2g/l、cacl
2 1.5g/l培养基于121℃蒸汽灭菌20min。
45.具体培养方法如下：将pda斜面保存的羽束梗孢菌种转接至普通基础培养基中进行活化，120r/min，20℃摇瓶培养20d，获得羽束梗孢菌球，再将活化后的菌球转接至微循环产孢培养基中(接种量10％)，120r/min，20℃摇瓶培养7d获得孢子悬液，紧接着将孢子悬液转接至孢子萌发培养基中(接种量10％)，120r/min，20℃培养4d获得萌发状态的孢子液，然后将萌发态孢子液转接至发酵培养基中(接种量15％)，120r/min，20℃进行液体深层发酵7d后孢子增至1.2
×
107个/ml，菌丝生物量达到为24g/l。
46.具体的诱导新疆细虫草微循环产孢的高效发酵培养方法的流程如图1所示，图3是羽束梗孢在微循环产孢液体培养中zn的诱导下的微循环产孢方式，具体特征为图中白色箭头所指。图3a是分生孢子萌发的菌丝上长出新的分生孢子；图3b是分生孢子顶端出芽长出新的分生孢子，而出芽生成的分生孢子在未脱落时也可以再出芽长出新的分生孢子，成串状；图3c是芽生孢子母细胞产生芽生孢子；图3d是zn诱导下微循环产孢的菌液显微图。
47.实施例2
48.以去离子水为溶剂配制各培养基
49.普通基础培养基的配方为：葡萄糖25g/l、蛋白胨15g/l、mgso4·
7h2o 1g/l、kh2po
4 3g/l，培养基于121℃蒸汽灭菌20min；
50.微循环产孢培养基的配方为：葡萄糖25g/l、蛋白胨15g/l、znso4·
7h2o 2g/l、mgso4·
7h2o 1g/l、kh2po
4 3g/l，培养基于121℃蒸汽灭菌20min；
51.孢子萌发培养基的配方为：葡萄糖25g/l、玉米水溶蛋白10g/l、酵母粉10g/l、mgso4·
7h2o 1g/l、kh2po
4 3g/l，培养基于121℃蒸汽灭菌20min；
52.优质发酵培养基的配方为：葡萄糖25g/l、玉米水溶蛋白10g/l、酵母粉10g/l、znso4·
7h2o 0.03g/l、mgso4·
7h2o 1g/l、kh2po
4 3g/l、cacl
2 2g/l，培养基于121℃蒸汽灭菌20min。
53.具体培养方法如下：将pda斜面保存的羽束梗孢菌种转接至普通基础培养基中进行活化，120r/min，20℃摇瓶培养20d，获得羽束梗孢菌球，再将活化后的菌球转接至微循环产孢培养基中(接种量15％)，100r/min，25℃摇瓶培养8d获得孢子悬液，紧接着将孢子悬液转接至孢子萌发培养基中(接种量15％)，100r/min，25℃培养5d获得萌发状态的孢子液，然
后将萌发态孢子液转接至发酵培养基中(接种量20％)，100r/min，25℃进行液体深层发酵8d。
54.实施例3
55.以去离子水为溶剂配制各培养基
56.普通基础培养基的配方为：葡萄糖15g/l、蛋白胨10g/l、mgso4·
7h2o 0.4g/l、kh2po
4 1.5g/l，培养基于121℃蒸汽灭菌20min；
57.微循环产孢培养基的配方为：葡萄糖15g/l、蛋白胨10g/l、znso4·
7h2o 0.01g/l、mgso4·
7h2o 0.4g/l、kh2po
4 1.5g/l，培养基于121℃蒸汽灭菌20min；
58.孢子萌发培养基的配方为：葡萄糖15g/l、玉米水溶蛋白10g/l、酵母粉3g/l、mgso4·
7h2o 0.4g/l、kh2po
4 1.5g/l，培养基于121℃蒸汽灭菌20min；
59.优质发酵培养基的配方为：葡萄糖15g/l、玉米水溶蛋白10g/l、酵母粉3g/l、znso4·
7h2o 0.001g/l、mgso4·
7h2o 0.4g/l、kh2po
4 1.5g/l、cacl
2 1g/l，培养基于121℃蒸汽灭菌20min。
60.具体培养方法如下：将pda斜面保存的羽束梗孢菌种转接至普通基础培养基中进行活化，120r/min，20℃摇瓶培养20d，获得羽束梗孢菌球，再将活化后的菌球转接至微循环产孢培养基中(接种量5％)，160r/min，18℃摇瓶培养7d获得孢子悬液，紧接着将孢子悬液转接至孢子萌发培养基中(接种量5％)，160r/min，18℃培养4d获得萌发状态的孢子液，然后将萌发态孢子液转接至发酵培养基中(接种量5％)，160r/min，18℃进行液体深层发酵7d。
61.实施例4
62.以去离子水为溶剂配制各培养基
63.普通基础培养基的配方为：葡萄糖20g/l、蛋白胨10g/l、mgso4·
7h2o 0.8g/l、kh2po
4 2g/l，培养基于121℃蒸汽灭菌20min；微循环产孢培养基的配方为：葡萄糖20g/l、蛋白胨10g/l、znso4·
7h2o 0.3g/l、mgso4·
7h2o 0.8g/l、kh2po
4 2g/l，培养基于121℃蒸汽灭菌20min；
64.孢子萌发培养基的配方为：葡萄糖20g/l、玉米水溶蛋白10g/l、酵母粉5g/l、mgso4·
7h2o 0.7g/l、kh2po
4 2g/l，培养基于121℃蒸汽灭菌20min；
65.优质发酵培养基的配方为：葡萄糖20g/l、玉米水溶蛋白10g/l、酵母粉5g/l、znso4·
7h2o 0.01g/l、mgso4·
7h2o 0.8g/l、kh2po
4 2g/l、cacl
2 1.5g/l，培养基于121℃蒸汽灭菌20min。
66.具体培养方法如下：将pda斜面保存的羽束梗孢菌种转接至普通基础培养基中进行活化，120r/min，20℃摇瓶培养20d，获得羽束梗孢菌球，再将活化后的菌球转接至微循环产孢培养基中(接种量10％)，130r/min，25℃摇瓶培养7d获得孢子悬液，紧接着将孢子悬液转接至孢子萌发培养基中(接种量5％)，130r/min，25℃培养4d获得萌发状态的孢子液，然后将萌发态孢子液转接至发酵培养基中(接种量15％)，130r/min，25℃进行液体深层发酵7d。
67.对比例1：
68.以去离子水为溶剂配制各培养基
69.普通基础培养基的配方为：葡萄糖20g/l、蛋白胨10g/l、mgso4·
7h2o 0.8g/l、
kh2po
4 2g/l，培养基于121℃蒸汽灭菌20min；
70.具体培养方法如下：将pda斜面保存的羽束梗孢菌种转接至普通基础培养基中进行活化(120r/min，20℃摇瓶培养20d)获得羽束梗孢菌球，再将活化后的菌球转接至普通基础培养基中(即不含zn的微循环产孢培养基)(接种量10％)，120r/min，20℃培养7d，为1代培养；以1代培养获得的菌液为种子液(接种量10％)转接至孢子萌发培养基(同实施例1)中进行培养，为2代培养，转速120r/min，培养温度20℃，培养4d；以2代培养获得的菌液(接种量15％)为种子液转接至优质发酵培养基(同实施例1)中培养，为3代培养，转速120r/min，培养温度20℃，培养7d。
71.对比例2
72.对比例2与对比例1的培养方法相同，不同之处在于，对比例2中优质发酵培养基中不含znso4·
7h2o。
73.如图2a为对比例1中采用普通基础培养基培养获得的1代菌液显微图中，其菌丝周围中几乎无孢子，菌丝生物量为6g/l；图2b为对比例1中以含有zn的优质发酵培养基培养获得的3代菌液显微图，其菌丝周围有少量的孢子，菌丝生物量为10
‑
15g/l，对比例1中1代培养的菌丝生物量最低，且菌液中几乎无孢子(图2a)，而3代培养的菌丝生物量有所提高，其菌液中有少量孢子和萌发状态的孢子，说明优质发酵培养基中zn和玉米水溶蛋白相互作用，诱导了孢子的产生和孢子的萌发，提高了菌丝产量。但是对比例2中以不含zn的优质发酵培养基培养获得的3代菌液显微图中(图2c)，菌丝周围几乎无孢子，菌丝生物量为6
‑
10g/l，低于对比例1中的3代培养产量，说明优质发酵培养基中微量的zn具有诱导产孢增加接种点的作用，zn在优质发酵培养基中必不可少，在不影响菌丝生长的同时又能产生所需的孢子。图2d为本发明实施例1微循环产孢培养基培养获得的菌液显微图，可见菌丝周围有大量孢子，图2e为实施例1中以优质发酵培养基培养获得的菌液显微图，可见其菌丝周围有不少孢子和萌发状态的孢子存在，菌丝生物量为24g/l，对比例1中图2b和实施例1中图2e中均存在孢子，而对比例2中图2c几乎无孢子，表明优质发酵培养基中含有的微量zn离子可促进孢子的产生。但是对比例1中的3代菌液中孢子量(图2b)少于实施例1优质发酵培养的菌液(图2e)，是因为实施例1优质发酵的接种物是由经过微循环(含zn)产孢获得的孢子悬液经萌发培养后成为萌发态孢子液进行接种的原因，其显著增加了优质发酵培养的初始接种点，多说明实施例1中zn作为诱导物产生大量孢子液是高效发酵的关键。另外，将实施例1中微循环产孢培养基的硫酸锌替换成等量的硫酸铁、硫酸锰、硫酸铜等原料菌丝周围视野中也几乎无孢子，说明是zn离子起到了作用。