一种具有自絮凝能力的菌株及其制备方法与应用

1.本发明涉及生物技术领域中，一种具有自絮凝能力的菌株及其制备方法与应用。


背景技术：

2.聚羟基脂肪酸酯(pha)是微生物合成的一类结构和性能多样的高分子聚酯。作为环境友好型材料，将在解决由石油化工经济带来的能源和环境危机中作出贡献，在人类生活中有着广阔的应用前景，但是高昂的生产成本限制了pha的大规模应用。从新疆盐湖中筛选出的盐单胞菌halomonas bluephagenesis能够在胞内大量积累以3hb为单体的一类pha颗粒phb，并且具有生长快，鲁棒性高等特性，是pha低成本生产的一大突破，以此开发的无灭菌连续发酵生产pha的新技术已用于工厂中试，能将pha生产成本降低30％。但halomonas bluephagenesis在pha工业生产链中仍有很多问题亟需解决。
3.此前，在另一株盐单胞菌halomonas ls21中，通过敲除电子传递蛋白etf-α和etf-β基因后，获得具有自絮凝和自沉降特性的菌株halomonas lsko(ling,c.,et al.(2019)."engineering self-flocculating halomonas campaniensis for wastewaterless open and continuous fermentation"biotechnol bioeng 116(4):805-815.)(另见中国专利申请《一种循环利用废水连续发酵培养微生物的方法及其所用具有自絮凝和自沉降特性的细菌》，申请号cn201811468572.7)。


技术实现要素：

4.本发明从遗传改造的角度寻求制备具有自絮凝能力的菌株的解决方案，制备了具有自絮凝能力的菌株。
5.为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种重组菌的制备方法，所述方法包括：敲除出发菌株中的多糖合成基因，或抑制出发菌株中所述多糖合成基因的表达量，或降低出发菌株中的所述多糖合成基因编码蛋白质的含量或活性，得到目的重组菌。
6.本发明还提供了一种提高菌株絮凝能力的方法，所述方法包括：敲除出发菌株中的多糖合成基因，或抑制出发菌株中所述多糖合成基因的表达量，或降低出发菌株中的所述多糖合成基因编码蛋白质的含量或活性，得到与所述出发菌株相比絮凝能力提高的目的重组菌。
7.上文中，所述出发菌株含有所述多糖合成基因。
8.上文中，所述出发菌株可为盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)。在本发明的一个实施例中，所述盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)为盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0。
9.所述多糖合成基因可为多糖合成基因簇ps1、ps2和/或ps4中的多糖合成基因。所述盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0含有多糖合成基因簇ps1、ps2和/或ps4。在本发明的一个实施例中，所述多糖合成基因簇ps1的序列如序列表中序列1所示，所述多糖合成基因簇ps2的序列如序列表中序列2所示，所述多糖合成基因簇ps4的序列如序列表中
序列3所示。
10.进一步，所述多糖合成基因可为所述多糖合成基因簇ps1中能编码ncbi中id分别为wp_039868450.1、wp_009721844.1、wp_009721843.1、wp_039868553.1、wp_009721841.1、wp_009721840.1、wp_009721839.1、wp_009721838.1和wp_009721837.1的蛋白质(更新日期为2020年6月6日)的基因；
11.和/或，所述多糖合成基因簇ps2中能编码ncbi中id分别为wp_009721819.1、wp_009721818.1、wp_009721817.1、wp_009721816.1、wp_009721815.1、wp_009721814.1、wp_186004631.1、wp_143759701.1、wp_009721811.1、wp_009721810.1、wp_009721809.1、wp_009721808.1和wp_009721807.1的蛋白质(更新日期为2020年6月6日)的基因；
12.和/或，所述多糖合成基因簇ps4中能编码ncbi中id分别为wp_009721803.1、wp_009721802.1、wp_009721800.1、wp_009721799.1、wp_009721798.1、wp_009721797.1、wp_009721796.1、wp_009721795.1、wp_009721794.1、wp_009721793.1、wp_009721792.1、wp_009721791.1、wp_009721790.1、wp_009721789.1和wp_143759699.1的蛋白质(更新日期为2020年6月6日)的基因。
13.所述多糖合成基因编码蛋白质可为所述多糖合成基因簇ps1、ps2和/或ps4中的多糖合成基因编码的蛋白质。
14.进一步，所述多糖合成蛋白质可为所述多糖合成基因簇ps1编码的ncbi中id分别为wp_039868450.1、wp_009721844.1、wp_009721843.1、wp_039868553.1、wp_009721841.1、wp_009721840.1、wp_009721839.1、wp_009721838.1和wp_009721837.1的蛋白质(更新日期为2020年6月6日)；
15.和/或，所述多糖合成基因簇ps2编码的ncbi中id分别为wp_009721819.1、wp_009721818.1、wp_009721817.1、wp_009721816.1、wp_009721815.1、wp_009721814.1、wp_186004631.1、wp_143759701.1、wp_009721811.1、wp_009721810.1、wp_009721809.1、wp_009721808.1和wp_009721807.1的蛋白质(更新日期为2020年6月6日)；
16.和/或，所述多糖合成基因簇ps4编码的ncbi中id分别为wp_009721803.1、wp_009721802.1、wp_009721800.1、wp_009721799.1、wp_009721798.1、wp_009721797.1、wp_009721796.1、wp_009721795.1、wp_009721794.1、wp_009721793.1、wp_009721792.1、wp_009721791.1、wp_009721790.1、wp_009721789.1和wp_143759699.1的蛋白质(更新日期为2020年6月6日)。
17.上文中，所述多糖合成基因的敲除通过将多糖合成基因簇ps1、ps2和/或ps4敲除实现。
18.上文中，所述多糖合成基因的敲除可通过crispr/cas9的方法实现。
19.进一步，所述多糖合成基因的敲除可通过向所述出发菌株中导入能表达cas9以及靶向所述多糖合成基因簇ps1、ps2和/或ps4的sgrna的重组载体实现。
20.其中，能表达cas9以及靶向所述多糖合成基因簇ps1、ps2和/或ps4的sgrna的重组载体可为能分别表达cas9以及靶向所述多糖合成基因簇ps1、ps2和/或ps4的sgrna的一个或多个载体。
21.更进一步，能表达cas9以及靶向所述多糖合成基因簇ps1、ps2和/或ps4的sgrna的重组载体为由能表达cas9的载体与如下p1、p2和/或p3组成的成套载体：
22.p1、表达能靶向所述多糖合成基因簇ps1的sgrna的重组载体；
23.p2、表达能靶向所述多糖合成基因簇ps2的sgrna的重组载体。
24.p3、表达能靶向所述多糖合成基因簇ps4的sgrna的重组载体。
25.具体的，p1所述重组载体能表达分别靶向所述多糖合成基因簇ps1的两端的两个sgrna。靶向所述多糖合成基因簇ps1的两端的两个sgrna的靶序列分别为序列1的第77-96位和第16769-16788位。p1所述重组载体还可含有多糖合成基因簇ps1的上下游同源臂。p1所述重组载体可由能转录靶向所述多糖合成基因簇ps1的两端的两个sgrna的dna片段(2gps1)、多糖合成基因簇ps1的上游同源臂、多糖合成基因簇ps1的下游同源臂与载体骨架连接得到。
26.所述2gps1的序列可如序列表中序列4所示。所述多糖合成基因簇ps1的上游同源臂的序列可如序列表中序列7所示。所述多糖合成基因簇ps1的下游同源臂的序列可如序列表中序列8所示。
27.p2所述重组载体能表达分别靶向所述多糖合成基因簇ps2的两端的两个sgrna。靶向所述多糖合成基因簇ps2的两端的两个sgrna的靶序列分别为序列2的第37-56位和第22815-2283434位。p2所述重组载体还可含有多糖合成基因簇ps2的上下游同源臂。p2所述重组载体可由能转录靶向所述多糖合成基因簇ps2的两端的两个sgrna的dna片段(2gps2)、多糖合成基因簇ps2的上游同源臂、多糖合成基因簇ps2的下游同源臂与载体骨架连接得到。
28.所述2gps2的序列可如序列表中序列5所示。所述多糖合成基因簇ps2的上游同源臂的序列可如序列表中序列9所示。所述多糖合成基因簇ps2的下游同源臂的序列可如序列表中序列10所示。
29.p3所述重组载体能表达分别靶向所述多糖合成基因簇ps4的两端的两个sgrna。靶向所述多糖合成基因簇ps4的两端的两个sgrna的靶序列分别为序列3的第135-154位和第14764-14783位。p3所述重组载体还可含有多糖合成基因簇ps4的上下游同源臂。p3所述重组载体可由能转录靶向所述多糖合成基因簇ps4的两端的两个sgrna的dna片段(2gps4)、多糖合成基因簇ps4的上游同源臂、多糖合成基因簇ps4的下游同源臂与载体骨架连接得到。
30.所述2gps4的序列可如序列表中序列6所示。所述多糖合成基因簇ps4的上游同源臂的序列可如序列表中序列11所示。所述多糖合成基因簇ps4的下游同源臂的序列可如序列表中序列12所示。
31.所述载体骨架只要能实现上述各片段的连接并将所得重组载体导入所述出发菌株中即可。在本发明的一个实施例中，所述载体骨架为pseva241的骨架。所述pseva241的骨架为pseva241载体中agccgtcgtgactgggaaaa与taccgagctcgaattcgcgc间的大片段(含有agccgtcgtgactgggaaaa与taccgagctcgaattcgcgc所示片段)。
32.所述能表达cas9的载体可为pq08。
33.在本发明的一个实施例中，得到的所述目的重组菌为将所述出发菌株中序列表中序列1所示的多糖合成基因簇ps1、序列2所示的多糖合成基因簇ps2与序列3所示的多糖合成基因簇ps4敲除得到的重组菌。所述重组菌中，序列表中序列1所示的多糖合成基因簇ps1的上下游同源臂直接相连，序列表中序列2所示的多糖合成基因簇ps2的上下游同源臂直接相连，序列表中序列3所示的多糖合成基因簇ps4的上下游同源臂直接相连。
34.利用所述重组菌的制备方法得到的重组菌，也属于本发明的保护范围。
35.本发明还提供了一种产品，所述产品为所述能表达cas9以及靶向所述多糖合成基因簇ps1、ps2和/或ps4的sgrna的重组载体和/或所述出发菌株。
36.具体的，所述产品可为所述能表达cas9以及靶向所述多糖合成基因簇ps1、ps2和/或ps4的sgrna的重组载体，也可为所述出发菌株，还可为由所述能表达cas9以及靶向所述多糖合成基因簇ps1、ps2和/或ps4的sgrna的重组载体与所述出发菌株组成的成套产品。
37.本发明还提供了一种菌体收集方法，所述方法包括：在用于培养出发菌株的液体培养基中培养所述重组菌，得到培养液，静置所述培养液或向所述培养液中添加nacl，使菌体沉淀，弃上层液体，即得到所述重组菌菌体。
38.所述用于培养出发菌株的液体培养基可含有nacl。nacl在所述用于培养出发菌株的液体培养基中的浓度可大于等于0.4m。nacl在所述用于培养出发菌株的液体培养基中的浓度可为如下任一种：0.4m-60g/l、0.4m-1m、0.6m-1m、0.8m-1m、0.4m-0.8m、0.6m-0.8m、0.4m-0.6m。
39.所述用于培养出发菌株的液体培养基可为60mmg发酵培养基。
40.向所述培养液中添加nacl时，nacl的添加量可满足使其在培养体系中的浓度大于等于0.4m。nacl的添加量可满足使其在培养体系中的浓度为如下任一种：0.4m-60g/l、0.4m-1m、0.6m-1m、0.8m-1m、0.4m-0.8m、0.6m-0.8m、0.4m-0.6m。
41.本发明还提供了一种生产phb的方法，所述方法包括：在含有葡萄糖的培养基中培养所述重组菌，得到phb。
42.所述含有葡萄糖的培养基可为60mmg发酵培养基。所述培养的温度为能使盐单胞菌生长的温度，如37℃。所述培养时间可根据具体需要或phb的产量确定。
43.本发明还提供了下述i或ii的应用：
44.i、所述重组菌的制备方法，或所述重组菌，或所述产品，或所述菌体收集方法在生产phb中的应用；
45.ii、所述重组菌，或所述产品在制备生产phb产品中的应用。
46.本发明中，所述絮凝能力为自絮凝能力。
47.本发明通过在盐单胞菌中敲除三个多糖合成基因簇ps1、ps2、ps4，获得了基因敲除菌株δps124，该菌株具有胞外多糖缺失表型和在液体培养基中自絮凝现象，该菌株具有以下优点：
48.1.在发酵后的液体培养基中，δps124能够通过静置在30min内快速自絮凝并沉降到底部，方便菌体的收集；
49.2.δps124可以通过控制培养基中的盐浓度操控其自絮凝特性；
50.3.δps124胞外多糖缺失，节约了合成胞外多糖所需的碳源；
51.4.δps124胞外多糖缺失使细胞表面氧气透过率提高，促进了菌体生长，进而缩短了发酵周期。
52.本发明可以解决现有工业大规模生物发酵中下游工艺中产生的能耗高、产率低、菌体收集过程复杂以及发酵周期长等诸多问题，具有广泛的应用前景。
extremophile halomonas spp.metabolic engineering,47(2018)219
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229，s1096717618300053.)中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
65.用于盐单胞菌发酵实验的60mmg发酵培养基：酵母粉1g/l，nacl 60g/l，葡萄糖30g/l，溶液ⅰ(十二水合磷酸氢二钠482.5g/l，磷酸二氢钾75g/l，)2％，溶液ⅱ(七水合硫酸镁20g/l,氯化铵50g/l)2％，溶液ⅲ(柠檬酸铁铵5g/l,二水合氯化钙2g/l)1％，溶液ⅳ(二水合钼酸纳0.03g/l,六水合氯化镍0.02g/l,五水合硫酸铜0.01g/l,硼酸0.3g/l,四水合氯化锰0.03g/l,七水合硫酸锌0.1g/l,六水合氯化钴0.2g/l)0.1％，用naoh调节培养基的ph至8.5，余量为水，％均表示体积百分比。四种溶液单独配置成母液，其溶剂均为水，各溶液使用时单独加入。
66.下述实施例中抗生素使用浓度：氯霉素(25μg/ml)，壮观霉素(100μg/ml)，卡那霉素(25μg/ml)。
67.实施例1、δps124的构建及其在发酵中的应用
68.一、δps124的构建
69.发明人基于crispr-cas9的双质粒敲除系统，通过基因大片段敲除方法先后对盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0中三段相邻的多糖合成基因簇ps1(16861bp)、ps2(22861bp)、ps4(14851bp)进行基因敲除(图5中a)，得到了δps124突变株。所用crispr-cas9的双质粒敲除系统中，一个质粒为pq08，另一个为携带转录靶向待敲除基因序列的sgrna的dna和同源臂的敲除质粒pgvector。
70.基因簇ps1(16861bp)，其序列为序列表中序列1，能编码ncbi中id分别为wp_039868450.1、wp_009721844.1、wp_009721843.1、wp_039868553.1、wp_009721841.1、wp_009721840.1、wp_009721839.1、wp_009721838.1、wp_009721837.1的蛋白质，更新日期为2020年6月6日。
71.基因簇ps2(22861bp)，其序列为序列表中序列2，能编码ncbi中id分别为wp_009721819.1、wp_009721818.1、wp_009721817.1、wp_009721816.1、wp_009721815.1、wp_009721814.1、wp_186004631.1、wp_143759701.1、wp_009721811.1、wp_009721810.1、wp_009721809.1、wp_009721808.1、wp_009721807.1的蛋白质，更新日期为2020年6月6日。
72.基因簇ps4(14851bp)，其序列为序列表中序列3，能编码ncbi中id分别为wp_009721803.1、wp_009721802.1、wp_009721800.1、wp_009721799.1、wp_009721798.1、wp_009721797.1、wp_009721796.1、wp_009721795.1、wp_009721794.1、wp_009721793.1、wp_009721792.1、wp_009721791.1、wp_009721790.1、wp_009721789.1、wp_143759699.1的蛋白质，更新日期为2020年6月6日。
73.1、携带sgrna和同源臂的敲除质粒pgvector的构建
74.所构建的携带转录靶向基因簇ps1的sgrna的dna和同源臂的质粒pgvector，其名称为p2gps1；携带转录靶向基因簇ps2的sgrna的dna和同源臂的质粒pgvector，其名称为p2gps2；携带转录靶向基因簇ps4的sgrna的dna和同源臂的质粒pgvector，其名称为p2gps4。
75.各敲除质粒均由转录待敲除目的片段的两个sgrna的dna(分别记为2gps1、2gps2和2gps4)、上游同源臂、下游同源臂以及pseva241的质粒骨架四部分连接得到。
76.p2gps1的构建方法如下：
77.合成序列表中序列4所示的2gps1，以其为模板利用sgrna f和sgrna r组成的引物对进行pcr扩增，将得到的pcr产物记为pcr产物1；以盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0的基因组dna为模板，利用ps1 h1f和ps1 h1r组成的引物对进行pcr扩增，得到含有ps1上游同源臂的pcr产物；以盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0的基因组dna为模板，利用ps1 h2f和ps1 h2r组成的引物对进行pcr扩增，得到含有ps1下游同源臂的pcr产物；以pseva241为模板，利用pgvector f和pgvector r组成的引物对进行pcr扩增，将得到的pcr产物利用dpni消化2h去除模板质粒得到pgvector质粒骨架。
78.所得pcr产物1与含有ps1上游同源臂的pcr产物、含有ps1上游同源臂的pcr产物与含有ps1下游同源臂的pcr产物、含有ps1下游同源臂的pcr产物与pgvector质粒骨架、pgvector质粒骨架与pcr产物1均有一端序列相同。
79.将pcr产物1、含有ps1上游同源臂的pcr产物、含有ps1下游同源臂的pcr产物以及pgvector质粒骨架通过gibson组装克隆试剂盒重组，将得到的产物转化到大肠杆菌中，并挑取单克隆提取质粒测序验证，得到的序列正确的重组质粒即为p2gps1。
80.序列4中，第21-55位和第171-205位均为启动子序列；第56-136位和第206-286位分别为转录靶向基因簇ps1的两个sgrna的dna序列，这两个sgrna的靶序列分别为序列4的第56-75位和第206-225位；第137-161位和第287-311位均为终止子序列。
81.p2gps2的构建方法如下：
82.合成序列表中序列5所示的2gps2，以其为模板利用sgrna f和sgrna r组成的引物对进行pcr扩增，将得到的pcr产物记为pcr产物2；以盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0的基因组dna为模板，利用ps2 h1f和ps2 h1r组成的引物对进行pcr扩增，得到含有ps2上游同源臂的pcr产物；以盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0的基因组dna为模板，利用ps2 h2f和ps2 h2r组成的引物对进行pcr扩增，得到含有ps2下游同源臂的pcr产物。
83.所得pcr产物2与含有ps2上游同源臂的pcr产物、含有ps2上游同源臂的pcr产物与含有ps2下游同源臂的pcr产物、含有ps2下游同源臂的pcr产物与上文所得pgvector质粒骨架、上文所得pgvector质粒骨架与pcr产物2均有一端序列相同。
84.将pcr产物2、含有ps2上游同源臂的pcr产物、含有ps2下游同源臂的pcr产物以及上文所得pgvector质粒骨架通过gibson组装克隆试剂盒重组，将得到的产物转化到大肠杆菌中，并挑取单克隆提取质粒测序验证，得到的序列正确的重组质粒即为p2gps2。
85.序列5中，第21-55位和第171-205位均为启动子序列；第56-136位和第206-286位分别为转录靶向基因簇ps2的两个sgrna的dna序列，这两个sgrna的靶序列分别为序列5的第56-75位和第206-225位；第137-161位和第287-311位均为终止子序列。
86.p2gps4的构建方法如下：
87.合成序列表中序列6所示的2gps4，以其为模板利用sgrna f和sgrna r组成的引物对进行pcr扩增，将得到的pcr产物记为pcr产物3；以盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0的基因组dna为模板，利用ps4 h1f和ps4 h1r组成的引物对进行pcr扩增，得到含有ps4上游同源臂的pcr产物；以盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0的基因组dna为模板，利用ps4 h2f和ps4 h2r组成的引物对进行pcr扩增，得到ps4含有下游
同源臂的pcr产物。
88.所得pcr产物3与含有ps4上游同源臂的pcr产物、含有ps4上游同源臂的pcr产物与含有ps4下游同源臂的pcr产物、含有ps4下游同源臂的pcr产物与上文所得pgvector质粒骨架、上文所得pgvector质粒骨架与pcr产物3均有一端序列相同。
89.将pcr产物3、含有ps4上游同源臂的pcr产物、含有ps4下游同源臂的pcr产物以及上文所得pgvector质粒骨架通过gibson组装克隆试剂盒重组，将得到的产物转化到大肠杆菌中，并挑取单克隆提取质粒测序验证，得到的序列正确的重组质粒即为p2gps4。
90.序列6中，第21-55位和第171-205位均为启动子序列；第56-136位和第206-286位分别为转录靶向基因簇ps4的两个sgrna的dna序列，这两个sgrna的靶序列分别为序列6的第56-75位和第206-225位；第137-161位和第287-311位均为终止子序列。
91.ps1上游同源臂与ps1下游同源臂的序列分别为序列7和序列8，上文含有ps1上游同源臂的pcr产物的序列由在序列7的两端分别添加相应的用于dna拼接的序列得到，上文含有ps1下游同源臂的pcr产物的序列由在序列8的两端分别添加相应的用于dna拼接的序列得到；ps2上游同源臂与ps2下游同源臂的序列分别为序列9和序列10，上文含有ps2上游同源臂的pcr产物的序列由在序列9的两端分别添加相应的用于dna拼接的序列得到，上文含有ps2下游同源臂的pcr产物的序列由在序列10的两端分别添加相应的用于dna拼接的序列得到；ps4上游同源臂与ps4下游同源臂的序列分别为序列11和序列12，上文含有ps4上游同源臂的pcr产物的序列由在序列11的两端分别添加相应的用于dna拼接的序列得到，上文含有ps4下游同源臂的pcr产物的序列由在序列12的两端分别添加相应的用于dna拼接的序列得到。
92.所用各引物如表1所示。
93.表1、用于构建敲除载体的引物和合成的sgrna序列
[0094][0095][0096]
表2、dna序列
[0097][0098]
表1与2中相同标记的序列反向互补或相同，用于dna片段的拼接；表2中下划线处序列为相应sgrna的靶序列。
[0099]
2gps1转录的两个sgrna的靶序列分别为序列1的第77-96位和第16769-16788位，2gps2转录的两个sgrna的靶序列分别为序列2的第37-56位和第22815-2283434位，2gps4转录的两个sgrna的靶序列分别为序列3的第135-154位和第14764-14783位。
[0100]
各质粒信息如表3所示。
[0101]
表3、用于基因敲除的质粒列表
[0102][0103][0104]
2、δps124的构建
[0105]
2.1培养基配制
[0106]
用于大肠杆菌培养的lb培养基：胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl 10g/l，余量为
水。
[0107]
用于盐单胞菌培养的lb60培养基：胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl 60g/l，余量为水。
[0108]
用于接合转化的lb20培养基：胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl 20g/l，余量为水。
[0109]
2.2盐单胞菌的接合转化
[0110]
使用e.coli s17-1作为接合转化的工具菌株，其过程如下：
[0111]
将待转化质粒导入e.coli s17-1中，得到携带待转化质粒的e.coli s17-1；
[0112]
将目的盐单胞菌和携带待转化质粒的e.coli s17-1菌种分别在添加相应抗生素的lb60和lb培养基中过夜培养活化。之后6000rpm离心2分钟，收集菌体，各加入50μl相应培养基重悬，将目的盐单胞菌和携带待转化质粒的e.coli s17-1重悬菌液混匀，取混合的菌液滴于lb20固体培养基上。在恒温培养箱37℃正置培养12小时后，刮取菌苔重悬于100μl的含相应抗生素的lb60培养基中并涂布于相应抗性的lb60平板，恒温培养箱37℃培养24-48h，即得到携带转化质粒的盐单胞菌。
[0113]
2.3敲除过程
[0114]
以pq08质粒为待转化质粒，将目的盐单胞菌按照步骤2.2的方法通过接合转化导入pq08质粒，通过lb60平板(添加氯霉素)筛选获得转化株，得到携带pq08质粒的盐单胞菌。之后，再通过接合转化，在携带pq08质粒的盐单胞菌中导入pgvector质粒(p2gps1、p2gps2或p2gps4)，通过lb60平板(添加氯霉素和壮观霉素)筛选获得转化株，而后挑取单菌落划线于lb60平板(添加氯霉素和壮观霉素)，并通过菌落pcr验证敲除结果。当pq08和pgvector同时转入到盐单胞菌中时，敲除过程既已经发生，pgvector表达的sgrna与pq08表达的cas9蛋白结合，靶向目的基因进行切割，而后细菌利用内源的同源重组系统以pgvector质粒上携带的同源臂为模板进行重组修复，修复后既完成编辑。
[0115]
2.4 pcr验证敲除结果
[0116]
分别使用待敲除目的dna同源臂外侧设计的一对引物vps(n)f和vps(n)r进行菌落pcr来验证是否存在敲除突变体，如果成功敲除将得到一条约2500bp的pcr条带，如果没有敲除将无条带。然后用目的基因内设计的引物vps(n)in和vps(n)f进行菌落pcr以验证目的基因是否残留，如果目的基因无残留pcr将无条带产生，如果目的基因有残留，将pcr得到一条约1500bp大小的条带，原理如图1所示。所用引物如下表所示。
[0117][0118][0119]
2.5质粒消除
[0120]
经过筛选验证得到的敲除株纯合子在下一步敲除另一dna片段前需要先将携带sgrna的pgvector质粒进行消除。质粒消除通过传代培养进行。挑取验证正确的敲除株菌落在lb60(添加氯霉素)的试管中过夜培养，之后稀释涂布在lb60(添加氯霉素)固体平板上，培养24-48h，待其长出单克隆。从固体平板上挑取单克隆先后划线于lb60(添加氯霉素和壮观霉素)固体平板和lb60(添加氯霉素)固体平板上，培养24h。在lb60(添加氯霉素和壮观霉素)固体平板不能生长，但在lb60(添加氯霉素)固体平板能生长的克隆则为pgvector质粒消除菌株。
[0121]
2.6δps1敲除株构建
[0122]
将敲除质粒p2gps1、p2gps2和p2gps4分别导入大肠杆菌e.coli s17-1中，将得到的重组菌分别记为e.coli s17-1/p2gps1、e.coli s17-1/p2gps2和e.coli s17-1/p2gps4。
[0123]
以pq08质粒为待转化质粒，以盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0为目的盐单胞菌，按照步骤2.2的结合转化方法得到携带pq08质粒的盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0，记为盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0/pq08。
[0124]
将盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0/pq08和e.coli s17-1/p2gps1菌种分别在添加相应抗生素的lb60和lb培养基中过夜培养活化。之后6000rpm离心2分钟，收集菌体，各加入50μl相应培养基重悬，将盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0/pq08和e.coli s17-1/p2gps1重悬菌液混匀，取混合的菌液滴于lb20固体培养基上。在恒温培养箱37℃正置培养12小时后，刮取菌苔涂布于含氯霉素和壮观霉素的lb60平板，恒温培养箱37℃培养24-48h进行转化筛选，培养结束挑取3个单克隆划线在lb60(添加氯霉素和壮观霉素)平板上。通过菌落pcr鉴定，3个单克隆的ps1基因簇均敲除成功(图2)，得到基因簇ps1全部敲除的敲除菌株，记为δps1，经测序验证δps1中不含ps1上下游同源臂间的片段。
[0125]
2.7δps12敲除株构建
[0126]
将步骤2.6得到的δps1按照2.5的方法进行质粒消除，得到携带pq08质粒的菌株，记为δps1/pq08。
[0127]
将δps1/pq08和e.coli s17-1/p2gps2菌种分别在添加相应抗生素的lb60和lb培养基中过夜培养活化。之后6000rpm离心2分钟，收集菌体，各加入50μl相应培养基重悬，将δps1/pq08和e.coli s17-1/p2gps2重悬菌液混匀，取混合的菌液滴于lb20固体培养基上。在恒温培养箱37℃正置培养12小时后，刮取菌苔涂布于含氯霉素和壮观霉素的lb60平板，恒温培养箱37℃培养24-48h进行转化筛选，培养结束挑取12个单克隆划线在lb60(添加氯霉素和壮观霉素)平板上。通过菌落pcr鉴定，其中10个单克隆ps2基因簇敲除成功(图3)，得到基因簇ps1和ps2全部敲除的敲除菌株，记为δps12，经测序验证δps12中不含ps1上下游同源臂间的片段，也不含ps2上下游同源臂间的片段。
[0128]
2.8δps12敲除株构建
[0129]
将步骤2.7得到的δps12按照2.5的方法进行质粒消除，得到携带pq08质粒的菌株，记为δps12/pq08。
[0130]
将δps12/pq08和e.coli s17-1/p2gps4菌种分别在添加相应抗生素的lb60和lb培养基中过夜培养活化。之后6000rpm离心2分钟，收集菌体，各加入50μl相应培养基重悬，将δps12/pq08和e.coli s17-1/p2gps4重悬菌液混匀，取混合的菌液滴于lb20固体培养基上。在恒温培养箱37℃正置培养12小时后，刮取菌苔涂布于含氯霉素和壮观霉素的lb60平
板，恒温培养箱37℃培养24-48h进行转化筛选，培养结束挑取4个单克隆划线在lb60(添加氯霉素和壮观霉素)平板上。通过菌落pcr鉴定，其中1个单克隆ps4基因簇敲除成功(图4)，得到基因簇ps1、ps2、ps4全部敲除的敲除菌株，记为δps124，经测序验证δps124中不含ps1上下游同源臂间的片段，也不含ps2上下游同源臂间的片段，也不含ps4上下游同源臂间的片段，该菌株中，序列表中序列1所示的多糖合成基因簇ps1的上下游片段直接相连(即序列7与序列8所示的两个dna片段直接相连)，序列表中序列2所示的多糖合成基因簇ps2的上下游片段直接相连(即序列9与序列10所示的两个dna片段直接相连)，序列表中序列3所示的多糖合成基因簇ps4的上下游片段直接相连(即序列11与序列12所示的两个dna片段直接相连)。
[0131]
二、基因敲除株δps124的特征
[0132]
以步骤一所得δps124与盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0(野生型菌株，wt)作为待测菌株，检测其生长状况，步骤如下：
[0133]
将δps124与野生型td1.0菌株分别在lb60液体培养基中过夜活化，按1％接种量接种在含有lb60液体培养基的试管中，37℃、200rpm摇床中培养24h后观察。并在lb60固体培养基上划线，于37℃恒温培养箱中培养48h后观察。
[0134]
结果显示，盐单胞菌td1.0在lb60固体培养基上生长会出现湿润凸起的黏液化菌苔形状(图5中b)，而敲除了其基因组上的多糖合成基因簇ps1、ps2和ps4的菌株δps124在lb60固体培养基上表现出干扁粗糙的菌苔形状(图5中b)，说明δps124的主要胞外多糖已经无法合成分泌。并且δps124在lb60液体培养基中产生了明显的自絮凝现象(图5中c)，有助于工业生产中菌体的回收。
[0135]
三、δps124的自絮凝和沉降效率测定
[0136]
δps124会产生明显的自絮凝和沉降的现象，为评价δps124的自絮凝效果，发明人进一步以沉降效率作为衡量指标进行测定。将δps124和野生型菌株盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0作为待测菌株，在60mmg发酵培养基中培养48h后分别测定在培养基中的沉降效率和在不同盐浓度的盐水中20min时的沉降效率。具体步骤如下：
[0137]
菌株的培养：将待测菌株在lb60液体培养基中过夜培养活化，后以1％(体积百分比)接种在lb60液体培养基中于摇床中37℃、200rpm下培养8h作为种子液。然后将种子液按5％(体积百分比)的接种量接种在60mmg发酵培养基中，分装在500ml摇瓶中，每瓶50ml，而后于37℃、200rpm下分别培养48h，得到发酵液。
[0138]
60mmg沉降效率：两种菌株的发酵液各取15ml，分别于15ml离心管中静置，每隔5min吸取距液面0.5cm处的液体(上清液)测定其od600。od值使用96孔板于酶标仪测定，每孔加入200μl待测样品，样品浓度过高需用60mmg发酵培养基稀释至od600＝0.2-0.8之间。n分钟时样品沉降率＝(样品静置前的od值-样品静置n分钟后上清液的od值)/样品静置前的od值
×
100％。设置三次重复实验。
[0139]
不同盐浓度沉降效率：将δps124的发酵液分装在15ml离心管中，每个15ml，4000rpm离心10min后弃上清，收集菌体沉淀。用0.02m nacl水溶液重悬洗涤一次。再用不同浓度的nacl水溶液重悬至15ml总体积，得到菌体重悬液。按照上述60mmg沉降效率的测定方法，将发酵液替换为菌体重悬液测定不同盐浓度沉降效率。
[0140]
结果如图6所示，在60mmg发酵培养基中，δps124在15min左右就能达到最大的沉
降效率，为95.66％。并且，δps124的自絮凝受到盐浓度的影响，在0.4m以上的nacl水溶液才能表现出明显的自絮凝现象，且在0.6m以上的nacl水溶液能达到最好的沉降效率，在0.2m以下的nacl水溶液则不具有自絮凝现象。因此，该菌的自絮凝现象可以通过盐浓度进行控制。
[0141]
在60mmg发酵培养基中，野生型菌株在0、5、10、15和30分钟时的沉降效率分别为0、7.38
±
2.13、7.37
±
1.59、9.08
±
1.90、8.14
±
4.97％，δps124在0、5、10、15和30分钟时的沉降效率分别为0、86.53
±
0.64、92.54
±
1.20、95.66
±
0.46、96.10
±
0.55％(mean
±
sd，每组3个重复)，如图6所示。
[0142]
在nacl水溶液的浓度为0、0.02、0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8和1.0m时，δps124的沉降效率分别为6.34、11.42、6.76、9.09、59.09、78.79、85.20、86.95、88.00％，如图6所示。
[0143]
四、δps124进行phb酵的测定
[0144]
以盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0和δps124作为待测菌株，进行phb发酵的测定，设置三次重复实验。步骤如下：
[0145]
将待测菌株在lb60液体培养基中过夜培养活化，后以1％(体积百分比)接种在lb60液体培养基中于摇床中37℃、200rpm下培养8h作为种子液。然后将种子液按5％(体积百分比)的接种量接种在60mmg发酵培养基中，分装在500ml摇瓶中，每瓶50ml，而后于37℃、200rpm下分别培养24h、36h和48h，收集培养液，离心，收集菌体，测定其细胞干重和phb产量。
[0146]
将菌体于先于-80℃预冷，而后在真空冷冻干燥器中冻干48h，称重即得到细胞干重。
[0147]
phb产量检测步骤如下：
[0148]
(1)配制酯化液：在甲醇和98％(质量百分比)浓硫酸的混合液(甲醇与浓硫酸的体积比97:3)中溶解苯甲酸(苯甲酸作为内参，国药集团化学试剂有限公司产品，货号为30018617)，即得到酯化液，酯化液中苯甲酸的浓度为1g/l；
[0149]
(2)称取40mg左右冻干菌体于酯化管中；
[0150]
(3)向酯化管中加入2ml酯化液和2ml三氯甲烷，100℃酯化4h；
[0151]
(4)自然冷却，加入1ml蒸馏水振荡混匀，静置分层，取下层氯仿相即为待测液；
[0152]
(5)称取10mg左右的phb标准品(sigma，no.p-8150)于酯化管中，而后向酯化管中加入2ml酯化液和2ml三氯甲烷，100℃酯化4h，自然冷却，加入1ml蒸馏水振荡混匀，静置分层，取下层氯仿相得到标样。
[0153]
(6)将步骤(4)所得待测液与步骤(5)所得标样分别进行气相色谱分析，以苯甲酸(国药集团化学试剂有限公司产品，货号为30018617)为内参。使用agilent gc6820气相色谱仪，色谱柱db-ffap，氮气为载气，设定柱温为200℃，进样器温度为200℃，检测器温度为220℃，柱长30m，柱头压力为0.25mpa。程序升温条件为：80℃维持1.5min后，以30℃/min的速度升温至140℃，再以40℃/min的速度升温至220℃并在此温度保持0.5min。样品进样量为1μl。根据苯甲酸与phb峰面积比值计算phb含量。
[0154]
结果如图7所示，δps124由于胞外多糖合成的减少，在培养相同时间时的菌体干重相比td1.0明显较低。δps124在培养36h时phb产量达到最高，在36h前δps124的phb含量和产量都略优于野生型的td1.0。说明，δps124有效缩短了发酵周期。
[0155]
盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0在培养24h、36h和48h时的细胞干重分别为10.15
±
0.32、12.68
±
0.01、12.55
±
0.07g/l；δps124在培养24h、36h和48h时的细胞干重分别为9.69
±
0.19、11.85
±
0.44、11.75
±
0.07g/l(平均值
±
标准差，每组3个重复)。
[0156]
盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0在培养24h、36h和48h时的phb产量分别为6.54
±
0.35、9.01
±
0.19、9.52
±
0.68g/l；δps124在培养24h、36h和48h时的phb产量分别为6.73
±
0.43、9.40
±
0.22、8.98
±
0.62g/l(平均值
±
标准差，每组3个重复)。phb产量(g/l)＝(s样品峰
×
s标准品苯甲酸峰)/(s标准品峰
×
s样品苯甲酸峰)
×
(m标准品/m样品)
×
细胞干重(s代表峰面积，m代表质量)。
[0157]
盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0在培养24h、36h和48h时的phb含量分别为64.36
±
1.40、71.10
±
1.47、75.85
±
5.07(wt％)；δps124在培养24h、36h和48h时的phb含量分别为69.42
±
3.83、79.37
±
1.51、76.45
±
4.89(wt％)(平均值
±
标准差，每组3个重复)。phb含量(wt％)＝(s样品峰
×
s标准品苯甲酸峰)/(s标准品峰
×
s样品苯甲酸峰)
×
(m标准品/m样品)(s代表峰面积，m代表质量)。
[0158]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。