一种联合A群链球菌制剂和TLR8激动剂共刺激扩增CIK细胞的方法及其应用与流程

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种联合a群链球菌制剂和tlr8激动剂共刺激扩增cik细胞的方法及其应用。

背景技术：

细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokineinducedkillercell，cik)，是将单个核细胞经多种细胞因子共同培养刺激后所获得的一群异质细胞，其同时表达cd3和cd56两种膜蛋白分子，兼具t淋巴细胞强大的抗瘤活性和非主要组织相容性复合物(mhc)限制性杀瘤的优点。制备cik使用的种子细胞来源包括外周血、脐带血等，cik细胞具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、对多重耐药肿瘤细胞同样敏感、对正常骨髓造血前体细胞细胞毒性小等特点，是目前发现的杀伤肿瘤细胞活性强，适合于临床应用的一种理想的效应细胞。

a群链球菌制剂为白色粉末，加生理氯化钠溶液溶解后呈白色混浊液体，经试验证明具有直接杀伤肿瘤细胞，激活宿主细胞免疫的功能，并可提高t细胞和nk细胞活性；与化疗合用可提高疗效并可能有减轻化疗药对骨髓抑制的作用，可调节t细胞亚群使t3、t4、及t4/t8比值全面上升。

曾刚等人报道了a群链球菌制剂抗肿瘤效应与细胞因子的关系，结果表明，a群链球菌制剂与肿瘤患者外周血淋巴细胞(pbl)共同孵育后，可增强pbl杀伤肿瘤细胞的能力，其上清液中亦均能检测到较高水平的il-12、il-2、ifn-γ和tnf-α。

陈艳媛等人报道了tlr7激动剂增强人cik细胞杀伤功能的研究，结果表明，tlr7激动剂(tlr7a)具有增强cik效应细胞的扩增能力，其刺激后获得的cik细胞对k562肿瘤细胞的杀伤效果更好。

李旺等人报道了tlr7激动剂替代ifn－γ诱导cik细胞杀伤肿瘤的研究，结果表明，tlr7α通过刺激免疫细胞分泌多种免疫细胞因子及趋化因子，如il-1、il-6、il-8、il-12、il-18、tnf-γ等，引发抗原呈递细胞上的mnc分子和共刺激信号上调以及激活cik，扩大免疫效应。

专利cn104928241b公开了添加人cd3抗体和tlr7/8激动剂体外活化扩增的nk细胞的生物制剂，可在不与k562等肿瘤细胞混合的情况下安全且简单有效地使nk细胞活化并增殖。

目前常用的技术主要是在体外培养体系中加入il-2、il-15、ifn-γ等多种细胞因子组合来促进cik细胞的扩增，但经过一段时间后扩增倍数和纯度亦不够理想，且杀伤活性亦不理想，导致不能完全满足实际应用的需求；而且这些已知方法由于对细胞因子的需求量较大、成本较高，培养效果不稳定，不适合大规模的应用。因此，亟需一种能够显著提高cik细胞的免疫细胞活性和增殖能力的方法。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种联合a群链球菌制剂和tlr8激动剂共刺激扩增cik细胞的方法。

本发明的第二个目的在于提供联合a群链球菌制剂和tlr8激动剂共刺激扩增cik细胞的方法的应用。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种联合a群链球菌制剂和tlr8激动剂共刺激扩增cik细胞的方法，通过a群链球菌制剂和tlr8激动剂的组合来刺激扩增cik细胞。

上述联合a群链球菌制剂和tlr8激动剂共刺激扩增cik细胞的方法，包括如下步骤：

(1)采集血液，分离获得单个核细胞；

(2)向混悬后的单个核细胞悬液中加入350～500u/mlifn-γ，0.02～2ke/mla群链球菌制剂和10～30μmtlr8激动剂培养；

(3)培养2天后加入cd3、il-1α和il-2激活细胞，进行cik细胞的诱导培养，即可收获大量、高细胞活性的cik细胞。

步骤(1)中所述的血液优选为脐血和外周血中的至少一种。

步骤(1)中所述的分离优选为聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心法分离。

步骤(1)中所述的分离获得单个核细胞的方法，具体为：采集新鲜抗凝血50ml，采用聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心法，600g离心30min，吸取中间乳白色单个核细胞层，并用生理盐水洗涤2次，600g低速离心10min后获得单个核细胞。

步骤(2)中所述的单个核细胞悬液的浓度优选为1.8×10⁶～2×10⁶个/ml。

步骤(2)中所述的培养优选用培养箱培养。

步骤(2)中所述的培养的条件优选为37℃，5％co2和饱和湿度的培养箱。

步骤(3)中所述的cd3的加入量优选为100～300ng/ml。

步骤(3)中所述的il-1α的加入量优选为100～300u/ml。

步骤(3)中所述的il-2的加入量优选为40～80u/ml。

步骤(3)中所述的诱导培养的条件优选为：于37℃，5％co2和饱和湿度的培养箱内培养13～15天。

上述联合a群链球菌制剂和tlr8激动剂共刺激扩增cik细胞的方法在扩增cik细胞中的应用。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

(1)toll样受体(tolllikereceptor,tlr)作为固有免疫和获得性免疫的桥梁，被相应配体激活后，可诱导多种免疫细胞因子及趋化因子的分泌，激活固有免疫，扩大t细胞的效应。tlr8激动剂具有很强的诱导体内抗原递呈细胞dc细胞因子分泌的能力，尤其是促进i型干扰素和il-12分泌的作用更为明显，这些细胞因子又可以进一步促进t细胞的增殖。也就是说，tlr8激活后可作用于多种免疫细胞，激活机体的天然免疫和获得性免疫应答，从而放大了局部炎症性反应，诱导整个机体的thl类反应，从而加速病原体的清除和肿瘤细胞的凋亡。cik细胞的肿瘤杀伤作用主要依赖于表达表面活化性受体传递的活化性信号和抑制性受体传递的抑制性信号的平衡。因此，我们选用tlr8激动剂，通过改变cik细胞表面活化性受体和抑制性受体的平衡状态而增强cik细胞的肿瘤杀伤作用。

(2)本发明所述方法培养的cik细胞与常规方法培养制备的cik细胞相比，利用a群链球菌制剂和tlr8激动剂作为刺激剂，直接激活cik细胞，使获得的cik细胞具有数量大、纯度高、细胞毒性强等特点，从而能够满足临床的需要。同时本发明人意外发现：a群链球菌制剂和tlr8激动剂的联合可减少外源细胞因子il-2、ifn-γ的添加量，降低生产成本。该方法具有制备成本低廉、工序简单、条件易控、对设备的要求较低、易于规模化生产等优势，为提高临床疗效并减轻患者经济负担奠定基础。

附图说明

图1为对照组和实验组培养15天后，细胞扩增倍数结果图。

图2为对照组和实验组培养15天后，细胞阳性表达率结果图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

一种联合a群链球菌制剂和tlr8激动剂共刺激扩增cik细胞的方法，步骤如下：

(1)采集新鲜抗凝血(来源于广东省脐带血造血干细胞库)50ml，采用聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心法，600g离心30min，吸取中间乳白色单个核细胞层，并用生理盐水洗涤2次，600g低速离心10min后获得单个核细胞；

(2)将获取的浓度为2×10⁶个/ml的单个核细胞重悬于cik专用培养基(lonzax-vivo15无血清培养基，购于北京毕特博生物技术有限责任公司)中，向混悬后的单个核细胞悬液中加入ifn-γ、a群链球菌制剂和tlr8激动剂，用量分别为：ifn-γ350u/ml，a群链球菌制剂0.02ke/ml和tlr8激动剂10μm于37℃，5％co2和饱和湿度的培养箱中培养；

(3)培养2天后加入cd3、il-1α和il-2激活细胞，加入量分别为：cd3100ng/ml、il-1α100u/ml和il-240u/ml，然后于37℃，5％co2和饱和湿度的培养箱内进行cik细胞的诱导培养15天，即可收获大量、高细胞活性的cik细胞。

对比例1

常规方法培养cik组：本组与实施例1的方法基本相同，不同之处在于，步骤(2)中，不加a群链球菌制剂和tlr8激动剂。

a群链球菌制剂-cik组：本组与实施例1的方法基本相同，不同之处在于，步骤(2)中，仅向混悬后的单个核细胞悬液中加入a群链球菌制剂0.02ke/ml。

tlr8激动剂-cik组：本组与实施例1的方法基本相同，不同之处在于，步骤(2)中，仅向混悬后的单个核细胞悬液中加入tlr8激动剂10μm。

a群链球菌制剂联合tlr8激动剂-cik组：即实施例1。

阳性表达率(cd3⁺cd56⁺表型)的检测方法：取培养第15天的细胞培养液，pbs缓冲液(0.01mol/l，ph7.4)洗涤两次后，洗涤后调整细胞浓度为1×10⁶个/ml，加入cd3⁺cd56⁺流式抗体，4℃避光孵育30min，洗掉多余抗体后，用pbs缓冲液(0.01mol/l，ph7.4)重悬后用流式细胞仪进行细胞表型检测。

上述不同培养方式对培养的脐血来源cik细胞扩增倍数和cd3⁺cd56⁺表型影响结果分别如下表1和2所示：

表1：不同培养方式培养的脐血来源cik细胞扩增倍数(n＝3)

从表1可以看出：随着培养时间的延长，各组细胞均有95％以上活率，各组细胞均有增长，但从第9天后，a群链球菌制剂-cik组、tlr8激动剂-cik组、a群链球菌制剂联合tlr8激动剂-cik组较常规培养方法的cik组的扩增速度均有所提高，其中a群链球菌制剂联合tlr8激动剂-cik组扩增效果最为显著，二者具有协同增效作用。

表2：不同培养方式对cik细胞的表型影响结果(n＝3)

由上表可知，相较于常规培养的cik组，本发明提供的cik细胞培养方法能够提高cik的扩增率，尤其是cd3⁺cd56⁺效应细胞的获得数量，从而能提高cik细胞的杀伤活性。

对比例2

实验组即实施例1。

对照组与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤(2)中ifn-γ的加入量为1000u/ml，步骤(3)中il-2的加入量为100u/ml(即本领域现有技术ifn-γ和il-2的一般用量)。

实验组和对照组的cik细胞扩增倍数和阳性表达率(cd3⁺cd56⁺)结果分别如图1和图2所示。

从图1和图2可以看出，对照组和实验组培养15天后，细胞扩增倍数和cd3⁺cd56⁺效应细胞(即阳性表达率)比例均无明显差异，说明a群链球菌制剂和tlr8激动剂的联合使用可促使淋巴细胞分泌il-2，ifn-γ等相关细胞因子，大大减少外源细胞因子的添加量。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。