核酸序列检测用器具、核酸序列检测方法以及核酸序列检测装置与流程

1.本发明涉及利用杂交来检测包含在样本中的具有特定核酸序列的靶标的核酸序列检测用器具、核酸序列检测方法以及核酸序列检测装置。


背景技术：

2.已知一种使用dna芯片来检测是否存在特定的核酸及其量的核酸序列检测用器具(专利文献1)。在该核酸序列检测用器具中，当经由结合部来保持彼此独立的荧光探针和消光探针的结合时，荧光分子的荧光被消光分子消光。另一方面，在供给了靶标的情况下，靶标与检测部结合而使经由结合部的结合被解除，消光分子远离荧光分子，从而荧光分子呈现荧光。
3.另外，在对通过光检测手段所获取的光的光量进行检测的光量检测装置中，已知一种光量检测装置，具备：基于所述光检测手段的输出信号来计算荧光信号光的光量的光量计算手段；照射激发光的激发光照射手段；通过照射该激发光，产生作为基准的荧光信号的基准荧光信号产生手段；以及根据作为所述基准的荧光信号，通过对所述光检测手段施加已知光量的光，对利用所述光量计算手段所算出的光量进行校准的校准手段(专利文献2)。
4.现有技术文献
5.专利文献
6.专利文献1：日本专利第5928906号公报
7.专利文献2：日本特开2011
‑
17721号公报


技术实现要素：

8.本发明要解决的课题
9.然而，在专利文献1的方法中，在通过荧光探针与消光探针的结合而导致的消光不完全的情况下，由于存在靶标不存在时的荧光(偏移光)，因此制约了由少量靶标产生的荧光分子的荧光光量变化的检测下限。另外，在该方法中，由于仅检测荧光探针的荧光光量变化，因此检测灵敏度不充分。
10.此外，所述偏移光是在没有与靶标发生杂交的情况下的、且荧光探针与消光探针处于结合的状态下的没有被消光分子消光的荧光分子的荧光。当通过与靶标杂交，荧光探针与消光探针的结合被解除，远离消光分子的荧光分子增加时，所述偏移光减少。然而，在专利文献1的方法中，无法测定该偏移光。
11.另一方面，在专利文献2的光量检测装置中，在比较dna芯片的杂交前后的光量时，需要获取使作为不包含靶标的阴性对照的样本进行杂交反应后的dna芯片的图像、和使包含靶标的样本进行杂交反应后的dna芯片的图像。因此，在比较dna芯片的图像的检测光量时，在芯片间、斑点间的光量具有偏差，并且该光量的偏差成为检测下限的制约。
12.另外，在该光量检测装置中，在比较同一芯片的杂交前后的光量时，需要进行以下操作：获取杂交前的dna芯片的图像，并将dna芯片暂且从生物芯片读取装置转移到恒温箱(incubator)以促进杂交反应，然后再次使用该装置获取dna芯片的图像，该操作复杂。
13.此外，当使用该光量检测装置来获取由双色激光的激发而得的荧光物质的荧光图像时，在获取每个荧光物质的荧光图像时，需要改变装置的构成，因此在获取双色荧光图像时产生时滞、无法正确地取得双色荧光图像的相关性。
14.本发明的目的在于提供不受芯片间和斑点间的光量的偏差的影响、检测灵敏度优异的核酸序列检测用器具、核酸序列检测方法以及核酸序列检测装置。
15.用于解决课题的手段
16.为了实现上述目的，本发明采用了以下构成。
17.[1]一种核酸序列检测用器具，其是利用杂交来检测包含在样本中的具有特定核酸序列的靶标的核酸序列检测用器具，特征在于，具备：
[0018]
供体荧光探针，其具有第1结合部和第1基端、且在预定位置处附带有供体荧光分子；
[0019]
消光探针，其具有第2结合部和第2基端、且在预定位置处附带有受体荧光分子；以及
[0020]
基板，其具有分别固定所述供体荧光探针的所述第1基端和所述消光探针的所述第2基端的固相面，
[0021]
所述供体荧光探针的所述第1结合部与所述消光探针的所述第2结合部具有彼此互补的序列，
[0022]
所述供体荧光探针或所述消光探针中的至少一者具有包含与所述靶标的核酸序列互补的序列的检测部，
[0023]
将所述供体荧光探针和所述消光探针的所述第1基端和所述第2基端固定在所述固相面上，以使得位置关系成为通过接近于所述供体荧光分子的所述受体荧光分子而使所述供体荧光分子的荧光被消光。
[0024]
[2]根据[1]所述的核酸序列检测用器具，其特征在于，
[0025]
在所述靶标与所述检测部没有发生杂交的情况下，通过保持所述供体荧光探针的所述第1结合部与所述消光探针的结合，使得通过接近于所述供体荧光分子的所述受体荧光分子而使所述供体荧光分子的荧光被消光，所述受体荧光分子呈现荧光；
[0026]
在所述靶标与所述检测部发生了杂交的情况下，通过解除所述供体荧光探针的所述第1结合部与所述消光探针的所述第2结合部的结合，使得远离所述受体荧光分子的所述供体荧光分子呈现荧光。
[0027]
[3]根据[1]或[2]所述的核酸序列检测用器具，其特征在于，所述供体荧光探针具有所述检测部。
[0028]
[4]根据[1]或[2]所述的核酸序列检测用器具，其特征在于，所述消光探针具有所述检测部。
[0029]
[5]根据[1]～[4]中任意1项所述的核酸序列检测用器具，其特征在于，所述基板为平板，所述固相面为该平板的一个平面。
[0030]
[6]根据[1]～[3]以及[5]中任意1项所述的核酸序列检测用器具，其特征在于，所
述供体荧光探针的所述第1结合部的至少一部分作为所述检测部而发挥功能。
[0031]
[7]根据[1]、[2]、[4]以及[5]中任意1项所述的核酸序列检测用器具，其特征在于，所述消光探针的所述第2结合部的至少一部分作为所述检测部而发挥功能。
[0032]
[8]根据[1]～[7]中任意1项所述的核酸序列检测用器具，其特征在于，附带所述供体荧光分子的所述预定位置为所述供体荧光探针的中间。
[0033]
[9]根据[1]～[7]中任意1项所述的核酸序列检测用器具，其特征在于，附带所述受体荧光分子的所述预定位置为所述消光探针的中间。
[0034]
[10]根据[1]～[9]中任意1项所述的核酸序列检测用器具，所述供体荧光探针和所述消光探针二者均具有所述检测部。
[0035]
[11]一种核酸序列检测方法，其是利用杂交来检测包含在样本中的具有特定核酸序列的靶标的核酸序列检测方法，特征在于，包括：
[0036]
(a)制备包含所述靶标的样本的步骤；
[0037]
(b)将所述样本供给至核酸序列检测用器具的步骤；
[0038]
(c)测定来自所述核酸序列检测用器具的供体荧光分子的荧光量和受体荧光分子的荧光量的步骤；
[0039]
(d)使所述样本中的所述靶标与所述核酸序列检测用器具中的供体荧光探针或消光探针中的至少一者进行杂交反应的步骤；以及
[0040]
(e)在所述反应后，测定来自所述核酸序列检测用器具的供体荧光分子的荧光量和受体荧光分子的荧光量的步骤，其中，
[0041]
所述核酸序列检测用器具具备：
[0042]
供体荧光探针，其具有第1结合部和第1基端、且在预定位置处附带有供体荧光分子；
[0043]
消光探针，其具有第2结合部和第2基端、且在预定位置处附带有受体荧光分子；以及
[0044]
基板，其具有分别固定所述供体荧光探针的所述第1基端和所述消光探针的所述第2基端的固相面，
[0045]
所述供体荧光探针的所述第1结合部与所述消光探针的所述第2结合部具有彼此互补的序列，
[0046]
所述供体荧光探针或所述消光探针中的至少一者具有包含与所述靶标的核酸序列互补的序列的检测部，
[0047]
将所述供体荧光探针和所述消光探针的所述第1基端和所述第2基端固定在所述固相面上，以使得位置关系成为通过接近于所述供体荧光分子的所述受体荧光分子而使所述供体荧光分子的荧光被消光。
[0048]
[12]根据[11]所述的核酸序列检测方法，其特征在于，根据所述杂交反应前后的供体荧光分子的荧光量的变化，计算进行了杂交的靶标的分子数。
[0049]
[13]根据[11]所述的核酸序列检测方法，其特征在于，根据所述杂交反应前后的受体荧光分子的荧光量的变化，计算没有进行杂交反应的靶标的分子数。
[0050]
[14]一种核酸序列检测装置，具有：
[0051]
根据[1]～[10]中任意1项所述的核酸序列检测用器具、以及
[0052]
测定来自所述核酸序列检测用器具的供体荧光分子的荧光量和受体荧光分子的荧光量的荧光读取装置。
[0053]
[15]根据[14]所述的核酸序列检测装置，在所述样本的存在下，测定来自所述核酸序列检测用器具的供体荧光分子的荧光量和受体荧光分子的荧光量。
[0054]
[16]根据[14]或[15]所述的核酸序列检测装置，具备用于使所述靶标与所述供体荧光探针或所述消光探针进行杂交的搅拌功能。
[0055]
[17]根据[14]～[16]中任意1项所述的核酸序列检测装置，具备将来自所述核酸序列检测用器具的荧光分离成双色，同时测定荧光的功能。
[0056]
本发明的效果
[0057]
根据本发明的核酸序列检测用器具，通过测定受体荧光分子的荧光，可以检测到保持结合的探针组合的量。另外，供体荧光分子的荧光的偏移光可以作为受体荧光分子的荧光来检测并定量。因此，根据受体荧光分子的荧光，通过运算可以减去供体荧光分子的偏移光，从而可以高精度地检测到供体荧光分子因与靶标杂交而引起的荧光的变化。
[0058]
另外，由于供体荧光分子与靶标的杂交反应的进行，可以捕捉到与供体荧光分子的荧光增加具有负相关的受体荧光分子的荧光减少，从而可以通过双重的相关性来提高检测灵敏度。
[0059]
此外，可以不受芯片间和斑点间的光量的偏差的影响而降低检测下限。
[0060]
根据本发明的核酸序列检测方法，通过测定受体荧光分子的荧光，可以检测到保持结合的探针组合的量。另外，供体荧光分子的荧光的偏移光可以作为受体荧光分子的荧光来检测并定量。因此，根据受体荧光分子的荧光，通过运算可以减去供体荧光分子的偏移光，从而可以高精度地检测到供体荧光分子因与靶标杂交而引起的荧光的变化。
[0061]
另外，由于供体荧光分子与靶标的杂交反应的进行，可以捕捉到与供体荧光分子的荧光增加具有负相关的受体荧光分子的荧光减少，从而可以通过双重的相关性来提高检测灵敏度。
[0062]
此外，可以不受芯片间和斑点间的光量的偏差的影响而降低检测下限。
[0063]
另外，根据本发明的核酸序列检测方法，由于不需要标记步骤，并且可以省略清洗步骤，因此可以进一步缩短杂交实验所需要的时间和精力，作业时间和成本都会被削减。此外，可以避免因清洗步骤不完备而导致的性能劣化、光量降低、背景光上升、或者发生偏差等。在传统的方法中，会因清洗的方法、清洗度、清洗不均匀等产生信号或背景光的上升和偏差的风险，但是根据本发明，可以避免这些风险。由此，可以在点阵面上得到更均匀的结果，提高检测的再现性。
[0064]
此外，根据本发明的核酸序列检测方法，可以实现杂交的实时观察。即，可以在dna点阵中添加有包含检测对象分子(靶标)的溶液的状态(湿状态)下直接进行点阵观察。因此，可以确认排除了清洗影响的状态下的光量和实现杂交的实时观察。由此，在样本浓度较高、杂交进行得较快的情况等状况下，能够在较短时间内结束杂交。
[0065]
根据本发明的核酸序列检测装置，在dna芯片的斑点中的同一位置坐标处，通过运算可以算出同一时刻的杂交反应前后的光量变化，从而可以详细地掌握斑点中的固定了的探针的偏差以及杂交反应的偏差。另外，在荧光图像中，可以通过选择供体荧光分子的荧光量(以下也称为供体荧光量)和受体荧光分子的荧光量(以下也称为受体荧光量)的变化的
相关性大的像素，并且通过运算算出光量变化，从而可以进行高精度的测定。
[0066]
在传统的核酸序列检测装置中，通过运算算出整个斑点的平均光量来确认光量变化，因此在存在斑点的面分布中的探针分子的固定量的不均匀和因杂交反应而引起的光量变化的不均匀的情况下，忽略了斑点中的可确认因杂交反应而引起光量变化的部位。根据本发明的核酸序列检测装置，可以获取斑点的图像，因此可以对检测器的各个像素确认光量变化，从而检测到详细的光量变化。另外，通过选择供体荧光量和受体荧光量的变化的相关性高的像素，可以正确地检测到是否因杂交反应而产生光量变化。因此，可以获得同一时刻的没有位置偏差的供体荧光分子的荧光图像(供体荧光图像)和受体分子的荧光图像(受体荧光图像)，从而可以进行更高精度的分析。
附图说明
[0067]
[图1]是表示探针的构成例的图。
[0068]
[图2]是示意性地表示检测靶标的原理的图。
[0069]
[图3]是表示变形例的图，其是表示供体荧光分子和受体荧光分子位于探针的中间的例子的图。
[0070]
[图4a]是表示变形例的图，其是表示多个位置处附带有供体荧光分子和受体荧光分子的例子的图。
[0071]
[图4b]是表示变形例的图，其是表示靶标与消光探针结合的例子的图。
[0072]
[图5]是表示核酸序列检测装置的构成图。
[0073]
[图6]是以波长分离的供体荧光图像和受体荧光图像的示意图。
[0074]
[图7]是表示使浓度不同的靶标发生杂交时的杂交反应的光量变化的图。
[0075]
[图8]是表示校准光量的图，该校准光量是通过设定与受体荧光分子的荧光量相乘的系数，使得在没有靶标时的受体荧光分子的荧光量与供体荧光分子的荧光量相等，并且从不同靶标浓度下的供体荧光分子的荧光量中减去受体荧光分子的荧光量与设定的系数相乘而得的数值算出的。
具体实施方式
[0076]
本发明的核酸序列检测用器具，其是利用杂交来检测包含在样本中的具有特定核酸序列的靶标的核酸序列检测用器具，特征在于，具备：
[0077]
供体荧光探针，其具有第1结合部和第1基端、且在预定位置处附带有供体荧光分子；
[0078]
消光探针，其具有第2结合部和第2基端、且在预定位置处附带有受体荧光分子；以及
[0079]
基板，其具有分别固定所述供体荧光探针的所述第1基端和所述消光探针的所述第2基端的固相面，
[0080]
所述供体荧光探针的所述第1结合部与所述消光探针的所述第2结合部具有彼此互补的序列，
[0081]
所述供体荧光探针或所述消光探针中的至少一者具有包含与所述靶标的核酸序列互补的序列的检测部，
[0082]
将所述供体荧光探针和所述消光探针的所述第1基端和所述第2基端固定在所述固相面上，以使得位置关系成为通过接近于所述供体荧光分子的所述受体荧光分子而使所述供体荧光分子的荧光被消光。
[0083]
以下，对本发明的核酸序列检测用器具的实施方式进行说明。
[0084]
图1是表示探针的构成例的图。
[0085]
如图1所示，本实施方式的核酸序列检测用器具构成为：在与作为检测对象的核酸即靶标30的互补序列上附带有供体荧光分子11的供体荧光探针10、和附带有受体荧光分子21的消光探针20分别固定在基板等的固相面100上。在本发明中，利用从供体荧光分子11向受体荧光分子21的荧光共振能量转移(fret)的原理，当受体荧光分子21接近供体荧光分子11时，由于供体荧光分子11的激发，能量从供体荧光分子11转移到受体荧光分子21，使得受体荧光分子呈现荧光。
[0086]
供体荧光分子和受体荧光分子的组合只要是可以产生荧光共振能量转移的组合即可，没有特别地限定，但是优选荧光共振能量转移效率高的供体荧光分子和受体荧光分子的组合。通过选择荧光共振能量转移效率高的供体荧光分子和受体荧光分子的组合，可以进一步提高灵敏度。产生能量转移的供体荧光分子和受体荧光分子的组合的例子、以及各个荧光分子的激发波长和荧光波长如表1所示。在下表1中，供体荧光分子和受体荧光分子的各列的左右两种荧光分子的组合表示供体荧光分子和受体荧光分子的组合的例子。
[0087]
[表1]
[0088]
表1
[0089][0090]
如图1所示，供体荧光探针10具备x部12、检测序列13以及接头14。x部12是从3’末端开始设置、且作为靶标30的互补序列的数个碱基的部分。检测序列13与x部12连接设置，是靶标30的互补序列。接头14与检测序列13连接并延续到5’末端。供体荧光分子11固定在供体荧光探针10的3’末端。
[0091]
消光探针20具备y部22、检测序列23以及接头24。y部22是从5’末端开始设置的数个碱基的部分。检测序列23与y部22连接设置，是靶标30的互补序列。接头24与检测序列23连接并延续到3’末端。受体荧光分子21固定在消光探针20的5’末端。
[0092]
供体荧光探针10和消光探针20分别经由接头14和接头24而固定在固相面100上。另外，供体荧光探针10的x部12的序列与消光探针20的y部22的序列彼此互补。另外，供体荧光探针10和消光探针20固定在供体荧光探针10的x部12与消光探针20的y部22可以彼此结合的位置，并且当供体荧光探针10的x部12与消光探针20的y部22结合时，受体荧光分子21接近于供体荧光分子11，当对供体荧光分子照射激发光时，能量从供体荧光分子11转移到受体荧光分子21，从而能够确保使受体荧光分子呈现荧光的位置关系。
[0093]
需要说明的是，本发明中的互补是指一个核酸序列具有可以与另一个核酸序列形成两条链状态的核酸序列，不一定需要完全地互补，也可以含有几个不匹配的碱基对。
[0094]
另外，期望设计为：供体荧光探针10与靶标30之间的亲和性高于通过x部12和y部22的供体荧光探针10与消光探针20之间的亲和性。
[0095]
接着，对利用本发明的核酸序列检测用器具来检测靶标30的原理进行说明。图2是示意性地表示检测靶标的原理的图。
[0096]
如图2所示，当不存在靶标30时，附带有供体荧光分子11的供体荧光探针10与附带有受体荧光分子21的消光探针20结合。由此，供体荧光分子11与受体荧光分子21处于接近的状态。在这种状态下，当对供体荧光分子照射激发光时，被激发后的供体荧光分子11的能量转移到受体荧光分子21，供体荧光分子11被消光，受体荧光分子21呈现荧光。
[0097]
当存在靶标30时，靶标30与供体荧光探针10结合。当靶标30与供体荧光探针10结合时，供体荧光探针10与消光探针20的结合脱离，受体荧光分子21与供体荧光分子11的距离变远。因此，不再产生从供体荧光分子向受体荧光分子的能量转移，受体荧光分子不呈现荧光，并且通过对供体荧光分子照射激发光，使得供体荧光分子11呈现荧光。因此，通过在荧光读取装置中观察固相面100，可以根据供体荧光探针10是否呈现荧光来确认样本中是否存在对象核酸(靶标30)。
[0098]
本发明的核酸序列检测方法不限于上述实施方式，也可以进行以下各种变形。
[0099]
通过改变附带有供体荧光分子的供体荧光探针与附带有受体荧光分子的消光探针的存在比并将它们分别固定，可以控制不存在对象分子时的荧光量。例如，当消光探针多于供体荧光探针时，被偶联的供体荧光分子的概率提高，供体荧光分子的荧光量减少。因此，可以将不存在对象分子时的供体荧光分子的荧光(偏移光)抑制得较低。另外，当供体荧光探针多于消光探针时，产生向受体荧光分子的能量转移的概率降低，对象物质检测后呈现的荧光(杂交光量)变得更强。
[0100]
在上述实施方式中，将供体荧光探针10的x部12的序列设为与靶标30互补的序列，但是也可以将供体荧光探针10的x部12和消光探针20的y部22的序列设为与靶标的种类无关的共通化的序列。在这种情况下，将x部12和y部22设为与靶标的种类无关的相同结构，根据靶标的种类只改变检测序列13和检测序列23即可，从而容易设计。另外，消光/发光的特性与检测对象无关，具有恒定的优点。
[0101]
另外，固定供体荧光探针和消光探针的固相面不限于基板上的平面。也可以将供体荧光探针和消光探针固定在微珠表面。通过将供体荧光探针和消光探针固定在微珠的表面，供体荧光探针和消光探针成为以微珠为中心呈放射状扩散的形状。在这种情况下，固定探针的固相面的表面积变大，可以增加每单位面积的探针量。另外，通过利用其大小或磁性等来回收捕获了检测对象分子后的微珠，可以实现检测对象分子的选择性回收。所回收的
分子可以用于后续步骤中的其他试验等。
[0102]
供体荧光分子或受体荧光分子也可以不位于探针的前端。图3示出了供体荧光分子和受体荧光分子位于探针的中间的例子。在图3的例子中，供体荧光分子11附加在供体荧光探针10a的中间，受体荧光分子21附加在消光探针20a的中间。但是，为了产生从供体荧光分子11向受体荧光分子21的能量转移，在供体荧光探针10a与消光探针20a结合的状态下，期望其位置被设计成受体荧光分子21以接近于供体荧光分子11的方式相互面对。在将供体荧光分子或受体荧光分子附加到探针的前端以外的位置的情况下，具有可以在探针的前端进一步进行其他修饰的优点。
[0103]
可以分别多种类、多位置地附加供体荧光分子和受体荧光分子。图4a是表示在多个位置处附带有供体荧光分子和受体荧光分子的例子的图。在图4a的例子中，供体荧光探针10b附带有供体荧光分子11、11、11，消光探针20b附带有受体荧光分子21、21、21。在将多个供体荧光分子和受体荧光分子附加到1个探针的情况下，每个供体荧光分子或受体荧光分子的种类可以不同。在1个探针附带有多个供体荧光分子和受体荧光分子的情况下，未结合靶标30时的受体荧光分子的荧光量和结合有靶标时的供体荧光分子的荧光量增加，从而可以进行更高灵敏度的检测。另外，不存在对象分子时的供体荧光分子的荧光量提高，在其成为受体荧光分子的荧光检测的偏移光的情况下，也可以在供体荧光探针上附加这样一种分子作为供体荧光分子，该分子用于吸收供体荧光分子的荧光波长光谱中的未与受体荧光分子的吸收波长光谱重叠的范围的波长即受体荧光分子的荧光的检测波长的光。该分子也可以作为受体荧光分子附加在消光探针上。由此，可以将不存在对象分子时的供体荧光分子的荧光(偏移光)抑制得较低。另外，存在对象分子时的受体荧光分子的荧光量提高，在其成为供体荧光分子的荧光检测的偏移光的情况下，可以在消光探针上附加这样一种分子作为受体荧光分子，该分子吸收激发光不直接激发受体荧光分子的激发光源的范围的波长的光。由此，可以将存在对象分子时的受体荧光分子的荧光(偏移光)抑制得较低。
[0104]
在上述实施方式中，不只是供体荧光探针10的检测序列13，在消光探针20中也可以设置检测序列23，但是也可以仅在供体荧光探针中设置与靶标互补的检测序列。然而，据认为，通过在二个探针中设置检测序列，可以提高靶标的结合频率。
[0105]
另外，在上述实施方式中，靶标30被设计为与供体荧光探针10结合，但是靶标也可以被设计为与消光探针结合。在这种情况下，可以避免供体荧光分子因接近靶标而引起的特性的变化。
[0106]
图4b是表示靶标30与消光探针20c结合的例子的图。如图4b的例子所示，对消光探针20c赋予对于靶标30具有更亲和性的序列，可以使靶标30与消光探针20c结合，而不是与供体荧光探针10c结合。在这种情况下，供体荧光探针10c可以设有也可以不设有与靶标互补的检测序列。
[0107]
接着，对本发明的核酸序列检测用器具的制造方法进行说明。
[0108]
(1)溶液制备
[0109]
首先，制备混合了供体荧光探针10和消光探针20而得的探针液，并调节探针浓度。
[0110]
(2)偶联
[0111]
接着，将探针液加热后急速冷却，使供体荧光探针10与消光探针20偶联。由此，经由x部12和y部22使供体荧光探针10与消光探针20结合。这里，例如，将探针液加热到95℃
后，保持温度5分钟，然后急速冷却到25℃，从而使供体荧光探针10与消光探针20偶联。
[0112]
(3)固定到固相面
[0113]
接着，将供体荧光探针10和消光探针20处于偶联状态的探针液滴加到固相面上，使供体荧光探针10和消光探针20固定在固相面100上。
[0114]
(4)清洗
[0115]
接着，清洗固相面100以除去未固定的剩余的探针。通过以上步骤，制造了dna芯片。
[0116]
这样，在经由x部12和y部22而相互结合的状态下，使供体荧光探针10和消光探针20结合在固相面100上。因此，可以适当地管理供体荧光探针10与消光探针20的位置关系，并且可以适当地发挥从供体荧光分子向受体荧光分子的能量转移。由此，检测灵敏度可以变得良好。
[0117]
接着，对使用本发明的核酸序列检测用器具的核酸序列检测方法进行说明。
[0118]
本发明的核酸序列检测方法是使用本发明的核酸序列检测用器具的核酸序列检测方法，是利用杂交来检测包含在样本中的具有特定核酸序列的靶标的核酸序列检测方法。
[0119]
本发明的核酸检测方法包括以下步骤(a)～(e)。
[0120]
(a)制备包含所述靶标的样本的步骤；
[0121]
(b)将所述样本供给至核酸序列检测用器具的步骤；
[0122]
(c)测定来自本发明的所述核酸序列检测用器具的供体荧光分子的荧光量和受体荧光分子的荧光量的步骤；
[0123]
(d)使所述样本中的所述靶标与所述核酸序列检测用器具中的供体荧光探针或消光探针中的至少一者进行杂交反应的步骤；以及
[0124]
(e)在所述反应后，测定来自所述核酸序列检测用器具的供体荧光分子的荧光量和受体荧光分子的荧光量的步骤。
[0125]
以下对上述各步骤进行说明。
[0126]
首先，进行样本50的制备，该样本50包含具有作为目标的特定核酸序列的靶标30(步骤(a))。在样本50的制备中，可以对具有特定核酸序列的基因(靶标30)进行扩增。
[0127]
在进行基因扩增的阶段中，也可以进行确认基因是否扩增的试验，从而只在基因扩增的情况下进行后述的杂交反应。
[0128]
需要说明的是，检查是否存在基因的时机不限于扩增结束后，也可以在扩增反应中。作为检查的方法，可以适当地利用电泳、抗原抗体反应、质量分析、或实时pcr法等。
[0129]
另外，核酸(靶标30)也可以与蛋白质或糖链等结合。在这种情况下，可以确认蛋白质或糖链等对核酸(靶标30)的相互作用。
[0130]
接着，将包含靶标30的样本50供给至所述核酸检测用器具的固相面100上(步骤(b))。然后，测定来自核酸序列检测用器具的供体荧光分子的荧光量和受体荧光分子的荧光量(步骤(c))。
[0131]
如上所述，当不存在靶标30时，通过使附带有供体荧光分子11的供体荧光探针10与附带有受体荧光分子21的消光探针20结合，供体荧光分子11与受体荧光分子21处于接近的状态。在这种状态下，当对供体荧光分子照射激发光时，被激发了的供体荧光分子11的能
量转移到受体荧光分子21，供体荧光分子11被消光，受体荧光分子21呈现荧光。
[0132]
但是，即使在供体荧光探针10与消光探针20结合的状态下，通过消光探针20的受体荧光分子21，也不能完全地使供体荧光探针10的供体荧光分子11的荧光被消光。该没有被完全消光的荧光成为供体荧光分子11的偏移光，但是当靶标30没有与供体荧光探针10或消光探针20中的至少一者发生杂交反应时，该偏移光可以作为受体荧光分子21的荧光量被捕捉。因此，测定杂交反应前后的供体荧光分子11的荧光量和受体荧光分子的荧光量，并且根据供体荧光分子11的荧光量和受体荧光分子21的荧光量进行运算，可以算出偏移光量。因此，可以更准确地算出杂交反应前后的进行了杂交的分子数。
[0133]
接着，使所述样本50中的靶标30与所述核酸序列检测用器具中的供体荧光探针或消光探针中的至少一者进行杂交反应(步骤(d))。
[0134]
当所述样本50中的靶标30与所述核酸序列检测用器具中的供体荧光探针或消光探针中的至少一者发生杂交反应时，靶标30与供体荧光探针10或消光探针20的至少一者结合，供体荧光探针10与消光探针20的结合脱离，受体荧光分子21与供体荧光分子11的距离变远。因此，不再产生从供体荧光分子11向受体荧光分子21的能量转移，受体荧光分子21不呈现荧光，并且通过对供体荧光分子11照射激发光，使得供体荧光分子11呈现荧光。
[0135]
接着，在杂交反应后，利用荧光读取装置60测定来自所述核酸序列检测用器具的供体荧光分子的荧光量(供体荧光量)和受体荧光分子的荧光量(受体荧光量)(步骤(e))。
[0136]
在荧光读取装置60中，可以通过供体荧光探针10是否呈现荧光来确认样本中是否存在对象核酸(靶标30)，并且可以对发生了杂交的对象核酸(靶标30)定量。另外，此时包含在溶液中的未被捕获的靶标30不呈现荧光，因此不需要清洗。由此，在靶标溶液存在下，可以透过溶液而观察核酸序列检测用器具的固相面100。因此，可以测定排除了清洗影响的状态下的光量，并且也可以进行杂交中的实时测定。
[0137]
另外，通过使用后述的本发明的核酸检测装置作为荧光读取装置，可以获取同一坐标处的杂交前后的图像，并且能够获取在同时刻的波长下分离后的供体荧光图像和受体荧光图像。另外，通过分析供体荧光图像和受体荧光图像，可以算出发生了杂交反应的靶标的分子数。
[0138]
另外，根据本发明的核酸序列检测方法，可以根据杂交反应前后的供体荧光分子11的荧光变化量来计算进行了杂交反应的靶标分子30的分子数。例如，通过使用具有已知分子数的靶标分子30的标准液进行杂交反应，测定反应前后的供体荧光分子11的荧光变化量，从而预先制作出表示分子数与荧光变化量之间的关系的校准线。根据该校准线、以及使用样本进行杂交反应前后的供体荧光分子11的荧光变化量，可以计算进行了杂交反应的靶标分子30的分子数。
[0139]
同样地，也可以根据杂交反应前后的受体荧光分子21的荧光变化量来计算没有进行杂交反应的靶标分子30的分子数。例如，通过使用具有已知分子数的靶标分子30的标准液进行杂交反应，测定反应前后的受体荧光分子21的荧光变化量，从而预先制作出表示分子数与荧光变化量之间的关系的校准线。根据该校准线、以及使用样本进行杂交反应前后的受体荧光分子21的荧光变化量，可以计算没有进行杂交反应的靶标分子30的分子数。
[0140]
另外，设定与受体荧光分子21的荧光量相乘的系数，使得在不存在靶标30时的受体荧光分子21的荧光量与供体荧光分子11的荧光量相等，并且从靶标分子30的供体荧光分
子11的荧光量中减去受体荧光分子21的荧光量与所设定的所述系数相乘而得的数值，算出校准光荧光量。通过使用具有已知分子数的靶标分子30的标准液来预先制作出表示分子数与校准荧光量之间的关系的校准线。根据该校准线、以及使用样本进行杂交反应的校准荧光量，可以计算进行了杂交反应的靶标分子30的分子数。
[0141]
接着，对本发明的核酸序列检测装置进行说明。
[0142]
本发明的核酸序列检测装置具有：本发明的核酸序列检测用器具、以及测定来自所述核酸序列检测用器具的供体荧光分子的荧光量和受体荧光分子的荧光量的荧光读取装置。
[0143]
图5是表示本发明的核酸序列检测装置60的构成图。在本发明的核酸序列检测装置中，为了获取dna芯片(核酸序列检测用器具)40的靶标30在供体荧光探针10上杂交前后的图像，在获取杂交前的图像之后，利用调温台82使dna芯片40的温度上升使其进行杂交反应，并且再次下降到常温的状态，以获取杂交后的图像。
[0144]
为了促进靶标30与探针的杂交，在靶标30与探针的反应中，调温台82优选具有振动或dna芯片40的旋转、利用涡流搅拌器等的搅拌功能。
[0145]
在核酸序列检测装置60的光学系统中，从激光光源61射出的激光经由镜子73而被分色镜74反射并照射到dna芯片40上。照射的光成为对dna芯片40上的供体荧光分子的激发光，并且在激光光源61的波长与供体荧光分子11的激发波长重叠的情况下，供体荧光分子11处于激发状态。
[0146]
如上所述，在供体荧光探针10与消光探针20结合的情况下，供体荧光分子11被消光，而受体荧光分子21呈现荧光。在存在靶标30、且供体荧光探针10与消光探针20的结合被解除的情况下，供体荧光分子11呈现荧光，受体荧光分子21不呈现荧光。
[0147]
从dna芯片40释放出的荧光透过分色镜74并经由作为摄像光学系统的图像分离光学系统81被分离成双色，并且分别在ccd摄像机63的检测元件上成像检测为以波长分离的两张同坐标的图像。由此，可以获取同一坐标的杂交前后的图像，另外，能够获取以同一时刻的波长分离的2张图像。另外，可以用一台ccd摄像机63进行检测。
[0148]
图6是以波长分离后的两张ccd摄像机图像的示意图。如图6所示，通过本发明的核酸序列检测用器具所得到的图像可以获取同一斑点处的杂交前后的图像。因此，不受芯片间、斑点间的光量的偏差的影响。
[0149]
另外，可以同时获取以波长分离后的供体荧光图像101和来自受体荧光分子的荧光图像(受体荧光图像)102，因此没有时滞，并且可以正确地得到图像的相关性。
[0150]
另外，根据杂交反应前后的供体荧光图像101来运算荧光变化量，可以算出发生了杂交反应的分子数，并且根据杂交反应前后的受体荧光图像102来运算荧光变化量，可以算出没有进行杂交反应的分子数。荧光变化量的运算可以使用整个斑点的平均光量，也可以使用斑点图像的各个像素的荧光变化量。
[0151]
本发明的核酸序列检测用器具也可以具备控制ccd照相机63的计算机、计算图像的光量的运算装置、以及保存图像和光量等的记录装置。
[0152]
本发明的适用范围不限于上述实施方式。本发明可以广泛地应用于利用杂交来检测包含在样本中的具有特定核酸序列的靶标的核酸序列检测用器具、使用所述核酸序列检测用器具的核酸序列检测方法以及核酸序列检测装置。
[0153]
实施例
[0154]
以下，基于实施例对本发明进行更详细地说明，但是本发明不限于以下实施例。
[0155]
将多个供体荧光探针10和消光探针20配置在基板上，以制作dna芯片40，将靶标30供给至所述dna芯片40，并在60℃反应30分钟，测定来自所述dna芯片的供体荧光分子的荧光量和来自消光探针的受体荧光分子的荧光量。其结果如图7所示。需要说明的是，在本实施例中，使用cy3作为供体荧光分子11，使用cy5作为受体荧光分子25。
[0156]
图7是表示没有靶标30时和使靶标30的浓度增加时的供体荧光量和受体荧光量的变化的图，其中供体荧光量是供体荧光探针10的供体荧光分子11的荧光，受体荧光量是消光探针20的受体荧光分子21的荧光。
[0157]
如图7所示，供体荧光分子的荧光量随着靶标30的浓度增加而增加。另外，受体荧光分子的荧光量随着靶标30的浓度增加而减小。
[0158]
接着，在图7中，设定了与受体荧光分子的荧光量相乘的系数，使得在没有靶标30时(在图7中，在靶标浓度为0nm时)的受体荧光分子的荧光量与供体荧光分子的荧光量相等。然后，通过从各靶标30的各浓度下的供体荧光分子的荧光量中减去受体荧光分子的荧光量与设定的系数相乘而得的数值，算出校准光量。其结果如图8所示。如图8所示，可以确认：相对于靶标30的浓度，所述校准光量的增加斜率相对于供体荧光分子的荧光量的增加斜率提高了1.4倍左右，灵敏度提高。
[0159]
在图8中，在校准后的没有靶标30的情况下的校准光量为0，但是实际上，根据供体荧光分子的荧光量与受体荧光分子的荧光量的相关性的偏差，可以确定检测下限的置信区间。据认为，供体荧光分子的荧光量与受体荧光分子的荧光量的相关性是依照芯片间差异、斑点间差异、斑点内的探针的固定量的不均匀的顺序而偏差增大的。本发明的核酸序列检测装置排除了斑点间差异和斑点置内的探针的固定量的影响，即使与斑点内的探针的固定量的不均匀相关，也可以检测荧光图像的各个像素处的光量变化量，并且通过选择相关性大的像素来运算荧光光量。由此，本发明的核酸序列检测装置可以将偏差抑制得较小。
[0160]
以上，说明了本发明的优选实施例，但是本发明不限于这些实施例。在不脱离本发明主旨的范围内，可以进行构成的添加、省略、置换以及其他变化。本发明不限于上述说明，而是仅限于随附的权利要求书的范围。
[0161]
符号的说明
[0162]
10供体荧光探针
[0163]
11供体荧光分子
[0164]
12x部(第1结合部)
[0165]
13检测序列(检测部)
[0166]
14接头(第1基端)
[0167]
20消光探针
[0168]
21受体荧光分子
[0169]
22y部(第2结合部)
[0170]
23检测序列(检测部)
[0171]
24接头(第2基端)
[0172]
40dna芯片(核酸序列检测用器具)
[0173]
50样本
[0174]
60荧光读取装置(核酸序列检测装置)
[0175]
61激光光源
[0176]
63ccd摄像机
[0177]
73镜子
[0178]
74分色镜
[0179]
81图像分离光学系统
[0180]
82调温台
[0181]
100固相面
[0182]
101供体荧光图像
[0183]
102受体荧光图像
[0184]
111供体荧光图像的探针斑点
[0185]
112受体荧光图像的探针斑点