与疟原虫环子孢子蛋白结合的抗体及其用途的制作方法

与疟原虫环子孢子蛋白结合的抗体及其用途
1.本发明涉及疟疾药物领域，特别是疟疾疫苗接种，以及与疟原虫子孢子、特别是疟原虫环子孢子蛋白结合的抗体。
2.疟疾是全球最严重的公共卫生问题之一。疟疾是由疟原虫属的寄生原生动物引起的。疟原虫属包括约200个种，其中恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫一起占几乎所有人类感染疟原虫种的原因。在这些疟原虫种中，恶性疟原虫占疟疾死亡的绝大多数。疟疾症状通常包括发烧、感觉疲倦、呕吐和头痛。在严重情况下，它会导致皮肤变黄、癫痫发作、昏迷或死亡。
3.疟疾是一种蚊媒病，其最常见的是由受感染的雌性按蚊传播。例如，在恶性疟原虫感染期间，雌性按蚊将少量子孢子(约10个至100个)注射到脊椎动物宿主的皮肤中，然后它们前往肝脏侵袭肝细胞(crompton等人，(2014)annu rev immunol 32，157-187)。在肝细胞中，子孢子无性繁殖(组织裂殖生殖)并且成熟为裂殖体，裂殖体破裂释放裂殖子。裂殖子感染红细胞，环状期滋养体成熟为裂殖体，裂殖体破裂释放裂殖子。其他裂殖子发育为有性红细胞阶段(配子体)。当蚊子叮咬受感染的脊椎动物宿主时，配子体被血液吸收并且在蚊子肠道中成熟。雄性和雌性配子体融合并且形成动合子，一个受精的、能动的受精卵。动合子发育为新的子孢子，它们迁移至昆虫的唾液腺以感染新的脊椎动物宿主。
4.疟疾症状是由血液阶段寄生虫引起的。相比之下，子孢子与临床症状无关，然而，在生命周期的子孢子和肝脏阶段，宿主体内的疟原虫寄生虫数量很低，根除它们可完全消除感染。因此，恶性疟原虫的子孢子和肝脏阶段代表了当前候选疟疾药物的关键目标，因为成功预防这些阶段的药物将能够预防疟疾感染和传播。因此，基于环子孢子蛋白(csp)的亚单位疫苗，如rts，s是疟疾疫苗工作的核心。
5.疟原虫环子孢子蛋白(csp)是疟原虫子孢子阶段的分泌蛋白。csp在寄生虫表面形成一层致密外壳，并且假设为介导子孢子与其两个宿主之间的许多初始相互作用(m
é
nard r.，2000，microbes infect.2：633-642；sinnis p.and nardin e.，2002，sporozoite antigens：biology and immunology of the circumsporozoite protein and thrombospondin related anonymous protein.in malaria immunology.p.perlmann and m.troye-blomberg，editors.s.karger ag，basel，switzerland.70-96)。csp的结构和功能在感染人类、非人类灵长类动物和啮齿动物的各种疟原虫菌株中高度保守。csp的氨基酸序列包含免疫显性中心重复区域，所述区域在不同疟原虫种中是不同的(在恶性疟原虫的情况下为nanp重复区域)。重复序列的侧翼是n-末端和c-末端的两个保守基序，即区域i、重复序列n-末端的5-aa序列和重复序列c-末端的已知细胞黏附基序，其称为i型血小板反应蛋白重复序列(tsr)。当寄生虫从蚊子传播至哺乳动物载体时，这些保守基序与蛋白质加工有关。
6.已知csp在子孢子从受感染蚊子的中肠壁迁移至蚊子唾液腺中起着至关重要的作用。此外，csp参与哺乳动物宿主的肝细胞结合，csp的n-末端和中心重复区域最初促进寄生虫结合。在肝细胞表面上，n-末端区域1的蛋白质水解切割暴露c-末端的黏附域，从而引发寄生虫入侵肝脏(coppi等人，(2005)j exp med 201，27-33)。
7.目前最先进的疟疾候选疫苗是rts，s(rts，s/as01；商品名mosquirix)，其为基于重组蛋白的疟疾疫苗。rts，s是混合蛋白颗粒，其配制在名称为as01的多组分佐剂中。rts，s疫苗抗原包含19个nanp氨基酸重复单元，随后是完整的c-末端结构域，减去cs抗原的gpi锚，与乙型肝炎病毒s蛋白融合。在撒哈拉以南非洲进行的多地点临床试验表明，rts，s对临床疟疾具有适度和短暂的保护作用。
8.使疟疾药物开发复杂化的另一因素是难以确定稳健的保护相关性。在体外功能测定中，抗体已证明可抑制子孢子侵袭肝细胞，但它们在保护接种疟疾疫苗的个体中的作用仍不清楚。
9.然而，最近描述了非常有效的抗疟疾抗体，其对恶性疟原虫环子孢子蛋白(csp)具有特异性(tan j，sack bk，oyen d等人，a public antibody lineage that potently inhibits malaria infection through dual binding to the circumsporozoite protein.nat med.2018；24(4)：401-407.doi：10.1038/nm.4513)。这项研究的作者表明，最有效的抗体，包括抗体“mgu10”和“mgh2”同时靶向(i)csp的nanp重复区域和(ii)csp的n-末端区域中的表位，从而覆盖n-末端结构域和nanp重复区域之间的连接。此外，这项研究表明，这些抗体的极端效力是由于它们的双重特异性，而仅靶向一个csp表位的抗体通常效力较低。
10.鉴于上述，本发明的目的是克服上述现有技术的缺点。特别地，本发明的目的是提供抗疟疾抗体，其结合(i)csp的nanp-重复区域和(ii)csp的n-末端区域两者，从而覆盖n-末端结构域和nanp-重复区域之间的连接，具有高亲和力。
11.该目的通过下文和所附权利要求中陈述的主题来实现。
12.尽管下面详细描述本发明，但应理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为它们可以变化。还应理解，本文中使用的术语并非旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求限定。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。
13.下面将描述本发明的要素。这些要素与特定实施方案一起列出，然而，应理解，它们可以任何方式和以任何数量组合以产生另外的实施方案。不同描述的实施例和实施方案不应解释为将本发明仅限于明确描述的实施方案。该描述应理解为支持并且包含将明确描述的实施方案与任何数量的公开要素组合的实施方案。此外，除非上下文另有说明，否则本技术中所有描述的要素的任何排列和组合都应认为由本技术的描述所公开。
14.在整个本说明书和随附权利要求中，除非上下文另有要求，否则术语“包含将理解为隐含包括所陈述的成员、整数或步骤，但不排除任何其他未说明的成员、整数或步骤。术语“由......组成”是术语“包含”的特定实施方案，其中排除任何其他未说明的成员、整数或步骤。在本发明的上下文中，术语“包含”涵盖术语“由......组成”。因此，术语“包含”涵盖“包括”以及“由......组成”，例如，“包含”x的组合物可排他地由x组成或可包括另外的东西，例如x+y。
15.除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用的术语“一个”和“一种”和“所述或该”及类似的参考将解释为涵盖单数和复数两者。本文引用的数值范围仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的速记方法。除非本文中另有说明，否则每个单独值都并入说明书中，就如它在本文中单
独引用那样。说明书中的任何语言都不应解释为表示对本发明的实践必不可少的任何未要求保护的要素。
16.措辞“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”y的组合物可完全不含y。必要时，本发明的定义中可省略措辞“基本上”。
17.与数值x相关的术语“约”表示x
±
10％，例如x
±
5％、或x
±
7％、或x
±
10％、或x
±
12％、或x
±
15％、或x
±
20％。
18.如本文所用，术语“疾病”旨在与术语“病症”和“病况”(如在医学病况中)通常是同义的，并且可互换使用，因为它们都反映人体或动物体或其损害正常功能的部分之一的异常病况，通常表现为明显的体征和症状，并且导致人类或动物缩短生命的持续时间或质量。
19.如本文所用，提及“治疗”对象或患者旨在包括防止、预防、减弱、改善和治疗。术语“对象”或“患者”在本文中可互换使用以表示包括人类在内的所有哺乳动物。对象的实例包括人、牛、狗、猫、马、山羊、绵羊、猪和兔。在一些实施方案中，患者是人。
20.剂量的表示通常与体重有关。因此，表示为[g、mg或其他单位]/kg(或g、mg等)的剂量通常是指[g、mg或其他单位]“每公斤(或g、mg等)体重”，即使没有明确提到术语“体重”。
[0021]
术语“结合”和类似引用通常是指“特异性结合”，其不包括非特异性黏附。
[0022]
如本文所用，术语“抗体”包括各种形式的抗体，包括但不限于完整抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)、人抗体、嵌合抗体、人源化抗体、重组抗体和基因工程抗体(变体或突变抗体)，只要根据本发明的特征特性被保留即可。在一些实施方案中，抗体是人抗体。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。例如，抗体是人单克隆抗体。
[0023]
如上所述，术语“抗体”通常还包括抗体片段。抗体的片段可保留抗体的抗原结合活性。这种片段称为“抗原结合片段”。抗原结合片段包括但不限于单链抗体、fab、fab’、f(ab’)2、fv或scfv。抗体的片段可通过包括用酶例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化和/或通过化学还原切割二硫键的方法从抗体获得。或者，抗体的片段可通过重组方式获得，例如通过克隆和表达重链和/或轻链序列的一部分(片段)。本发明还包括源自本发明抗体的重链和轻链的单链fv片段(scfv)。例如，本发明包括包含来自本发明抗体的cdr的scfv。还包括重链或轻链单体和二聚体、单域重链抗体、单域轻链抗体以及单链抗体，例如其中重链和轻链可变域通过肽接头连接的单链fv。本发明的抗体片段可包含在本领域技术人员已知的多种结构中。此外，本发明的序列可以是多特异性分子的组成部分，其中本发明的序列靶向本发明的表位并且分子的其他区域结合其他靶标。尽管说明书(包括权利要求在内)的在某些地方可明确提及抗体的抗原结合片段、抗体片段、变体和/或衍生物，但应理解术语“抗体”包括所有类别的抗体，即抗体的抗原结合片段、抗体片段、变体和衍生物。
[0024]
人抗体在现有技术中是众所周知的(van dijk，m.a.，and van de winkel，j.g.，curr.opin.chem.biol.5(2001)368-374)。人抗体也可在转基因动物(例如，小鼠)中产生，这些动物在免疫后能够在不产生内源性免疫球蛋白的情况下产生完整的所有成分或选择的人抗体。在这种种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击时产生人抗体(参见例如，jakobovits，a等人，proc.natl.acad.sci.usa 90(1993)2551-2555；jakobovits，a等人，nature 362(1993)255-258；bruggemann，m等人，year immunol.7(1993)3340)。人抗体也可在噬菌体展示文库中产生(hoogenboom，h.r.，and winter，g.，j.mol.biol.227(1992)381-388；marks，j.d等人，j.mol.biol.222(1991)581-597)。cole等
人和boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体(cole等人，monoclonal antibodies and cancer therapy，alan r.liss，p.77(1985)；and boerner，p等人，j.immunol.147(1991)86-95)。在一些实施方案中，人单克隆抗体通过使用如下所述的改善的ebv-b细胞永生化来制备：traggiai e，becker s，subbarao k，kolesnikova l，uematsu y，gismondo mr，murphy br，rappuoli r，lanzavecchia a.(2004)：an efficient method to make human monoclonal antibodies from memory b cells：potent neutralization of sars coronavirus.nat med.10(8)：871-5。如本文所用，术语“可变区”(轻链可变区(v
l
)、重链可变区(vh))表示直接参与抗体结合抗原的轻链和重链对中的每一个。
[0025]
本发明的抗体可以是任何同种型(例如，iga、igg、igm，即α、γ或μ重链)。例如，抗体为igg型。在igg同种型内，抗体可以是igg1、igg2、igg3或igg4亚类，例如igg1。本发明的抗体可具有κ或λ轻链。在一些实施方案中，抗体是igg1型并且具有κ轻链。
[0026]
本发明的抗体可以纯化形式提供。通常，抗体将存在于基本上不含其他多肽的组合物中，例如其中小于90％(按重量计)、通常小于60％和更通常小于50％的组合物由其他多肽组成。
[0027]
根据本发明的抗体在人和/或非人(或异源)宿主例如小鼠中可以是免疫原性的。例如，抗体可具有在非人类宿主中具有免疫原性但在人类宿主中不具有免疫原性的独特位。本发明的人用抗体包括那些不能容易地从宿主如小鼠、山羊、兔、大鼠、非灵长类哺乳动物等中分离并且通常不能通过人源化或从异种小鼠获得的抗体。
[0028]
如本文所用，“中和抗体”是可中和，即预防、抑制、降低、阻碍或干扰病原体在宿主中引发和/或延续感染的能力的抗体。术语“中和抗体(neutralizing antibody)”和“中和抗体(an antibody that neutralizes)”或“中和抗体(antibodies that neutralize)”在本文中可互换使用。这些抗体可单独或组合使用，在适当配制时作为预防或治疗剂，与主动疫苗接种相结合，作为诊断工具，或作为本文所述的生产工具。
[0029]
如本文所用，术语“突变”涉及核酸序列和/或氨基酸序列与参考序列(例如相应的基因组序列)相比的变化。突变，例如与基因组序列相比，可以是例如(自然发生的)体细胞突变、自发突变、诱导突变(例如由酶、化学品或辐射诱导)，或通过定点诱变(在核酸序列和/或氨基酸序列中进行特异和有意改变的分子生物学方法)获得的突变。因此，术语“突变”或“变异”应理解为还包括物理上进行突变，例如在核酸序列或氨基酸序列中。突变包括一个或多个核苷酸或氨基酸的取代、缺失和插入以及几个连续核苷酸或氨基酸的倒位。为了在氨基酸序列中实现突变，可在编码所述氨基酸序列的核苷酸序列中引入突变以便表达(重组)突变多肽。突变可例如通过如下来实现：改变例如通过定点诱变编码一个氨基酸的核酸分子的密码子以产生编码不同氨基酸的密码子，或通过合成序列变体，例如通过知道编码多肽的核酸分子的核苷酸序列，并且通过设计包含编码多肽变体的核苷酸序列的核酸分子的合成，而不需要突变核酸分子的一个或多个核苷酸。
[0030]
在本说明书的全文中引用几篇文献。本文引用的每个文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明等)，无论是上文还是下文，均通过整体引用并入本文。本文中的任何内容均不应解释为承认本发明无权因在先发明而提前公开。
[0031]
应理解，本发明不限于本文所述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范
围，本发明的范围仅由所附权利要求限定。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。
[0032]
抗体及其抗原结合片段
[0033]
最近，描述了非常有效的抗疟疾抗体，其对恶性疟原虫环子孢子蛋白(csp)具有特异性(tan j，sack bk，oyen d等人，a public antibody lineage that potently inhibits malaria infection through dual binding to the circumsporozoite protein.nat med.2018；24(4)：401-407.doi：10.1038/nm.4513)。这项研究的作者表明，最有效的抗体同时靶向(i)csp的nanp重复区域和(ii)csp的n-末端区域中的表位，从而覆盖n-末端区域和nanp-重复区域之间的连接。此外，这项研究表明，抗体的极端效力是由于它们的双重特异性，而仅靶向一个csp表位的抗体通常效力较低。本研究中描述的最有效的双特异性抗体包括抗体“mgu10”和“mgh2”。
[0034]
基于此，本发明人通过在cdr或框架区中人工引入突变来设计抗体mgu10和mgh2的序列变体。因此，抗体mgu10和mgh2在本文中可称为“亲本”抗体，而本发明的抗体代表所述“亲本”抗体的序列变体或“变体”抗体。然后根据tan等人的描述测试变异抗体的双重特异性(tan j，sack bk，oyen d等人，a public antibody lineage that potently inhibits malaria infection through dual binding to the circumsporozoite protein.nat med.2018；24(4)：401-407.doi：10.1038/nm.4513)。本发明的变体抗体对csp中的靶表位(csp的nanp-重复区域和csp的n-末端区域，从而覆盖n-末端结构域和nanp-重复区域之间的连接)显示出出人意料的高亲和力。
[0035]
在第一方面，本发明提供(分离的)抗体或其抗原结合片段，包含(i)分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6中所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列；或(ii)分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：14所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列；或(iii)分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：14所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列；或(iv)分别如seq id no：17、seq id no：18和seq id no：19中所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别如seq id no：20、seq id no：21和seq id no：28所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列：或(v)分别如seq id no：17、seq id no：18和seq id no：19所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别如seq id no：20、seq id no：22和seq id no：28所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列。
[0036]
通常，根据本发明的抗体或其抗原结合片段通常在重链上包含(至少)三个互补决定区(cdr)和在轻链上包含(至少)三个cdr。通常，互补决定区(cdr)是存在于重链可变域和轻链可变域中的高可变区。通常，抗体的重链的cdr和连接的轻链一起形成抗原受体。通常，三个cdr(cdr1、cdr2和cdr3)在可变域中不连续排列。由于抗原受体通常由两个可变域组成(在两条不同的多肽链，即重链和轻链：重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)上)，每个抗原受体通常有6个cdr(重链：cdrh1、cdrh2和cdrh3；轻链：cdrl1、cdrl2和cdrl3)。经典的单抗体分子通常具有两个抗原受体，并且因此包含十二个cdr。重链和/或轻链上的cdr可被框架区隔开，由此框架区(fr)是可变域中比cdr“可变性”小的区域。例如，一条链(或分别每条链)
可由四个框架区组成，由三个cdr分隔。
[0037]
确定本发明的示例性抗体的重链和轻链的序列，包括重链上的三个不同cdr和轻链上的三个不同cdr。cdr氨基酸的位置根据imgt编号系统定义(imgt：http：//www.imgt.org/；cf.lefranc，m.-p等人，(2009)nucleic acids res.37，d1006-d1012)。
[0038]
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含含有与seq id no：13具有如下同一性的氨基酸序列：70％或大于70％(即71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：8具有如下同一性的氨基酸序列：70％或大于70％(即71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。
[0039]
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：7具有如下同一性的氨基酸序列：70％或大于70％(即71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：15具有如下同一性的氨基酸序列：70％或大于70％(即71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：14所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。
[0040]
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：16具有如下同一性的氨基酸序列：70％或大于70％(即71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：8具有如下同一性的氨基酸序列：70％或大于70％(即71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。
[0041]
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：11具有如下同一性的氨基酸序列：70％或大于70％(即71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：15具有如下同一性的氨基酸序列：70％或大
于70％(即71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：14所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。
[0042]
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：13具有如下同一性的氨基酸序列：70％或大于70％(即71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：15具有如下同一性的氨基酸序列：70％或大于70％(即71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：14所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。
[0043]
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：16具有如下同一性的氨基酸序列：70％或大于70％(即71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区具有与seq id no：15包含如下同一性的氨基酸序列：70％或大于70％(即71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：14所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。
[0044]
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：104具有如下同一性的氨基酸序列：70％或大于70％(即71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：8具有如下同一性的氨基酸序列：70％或大于70％(即71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。
[0045]
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：104具有如下同一性的氨基酸序列：70％或大于70％(即71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或
大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：15具有如下同一性的氨基酸序列：70％或大于70％(即71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。
[0046]
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：24具有如下同一性的氨基酸序列：70％或大于70％(即71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：29具有如下同一性的氨基酸序列：70％或大于70％(即71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：17、seq id no：18和seq id no：19所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：20、seq id no：21或22和seq id no：28所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。
[0047]
序列同一性通常根据参考序列的全长(即申请中引用的序列)计算。如本文所指的百分比同一性可以例如使用blast使用ncbi(国家生物技术信息中心；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)指定的默认参数来确定[blosum 62矩阵；空位开放罚分＝11，空位延伸罚分＝1]。
[0048]“序列变体”具有改变的序列，其中将参考序列中的一个或多于一个氨基酸删除或置换，和/或将一个或多于一个氨基酸插入到参考氨基酸序列中的序列。作为改变的结果，氨基酸序列变体与参考序列具有至少70％同一性的氨基酸序列。具有至少70％同一性的变体序列在参考序列的每100个氨基酸中具有不超过30个改变，即缺失、插入或置换的任何组合。
[0049]
通常，虽然可能有非保守氨基酸置换，但置换通常是保守氨基酸置换，其中置换的氨基酸与参考序列中的相应氨基酸具有相似的结构或化学性质。举例来说，保守氨基酸置换涉及一种脂肪族或疏水性氨基酸例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸用另一种置换；一种含羟基的氨基酸例如丝氨酸和苏氨酸用另一种置换；一种酸性残基例如谷氨酸或天冬氨酸用另一种置换；替换一种含酰胺的残基例如天冬酰胺和谷氨酰胺用另一种置换；一种芳香族残基例如苯丙氨酸和酪氨酸用另一种置换；一种碱性残基例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸用另一种置换；和一种小氨基酸例如丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和甘氨酸用另一种置换。
[0050]
氨基酸序列插入包括长度从一个残基至含有一百个或多于一百个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括将氨基酸序列的n-或c-末端与报告分子或酶融合。
[0051]
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：13具有如下同一性的氨基酸序列：75％或大于75％(即76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
no：2和seq id no：12所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：14所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：16具有如下同一性的氨基酸序列：75％或大于75％(即76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：15具有如下同一性的氨基酸序列：75％或大于75％(即76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：14所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：24具有如下同一性的氨基酸序列：75％或大于75％(即76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：29具有如下同一性的氨基酸序列：75％或大于75％(即76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：17、seq id no：18和seq id no：19所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：20、seq id no：21或22和seq id no：28所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：104具有如下同一性的氨基酸序列：75％或大于75％(即76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：8具有如下同一性的氨基酸序列：75％或大于75％(即76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：104具有如下同一性的氨基酸序列：75％或大于75％(即76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：15具有如下同一性的氨基酸序列：75％或大于75％(即76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。
[0052]
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：13具有如下同一性的氨基酸序列：80％或大于80％
(即81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：8具有如下同一性的氨基酸序列：80％或大于80％(即81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：7具有如下同一性的氨基酸序列：80％或大于80％(即81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：15具有如下同一性的氨基酸序列：80％或大于80％(即81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：14所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：16具有如下同一性的氨基酸序列：80％或大于80％(即81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：8具有如下同一性的氨基酸序列：80％或大于80％(即81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：11具有如下同一性的氨基酸序列：80％或大于80％(即81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：15具有如下同一性的氨基酸序列：80％或大于80％(即81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：14所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：13具有如下同一性的氨基酸序列：80％或大于80％(即81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：15具有如下同一性的氨基酸序列：80％或大于80％(即81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：14所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可
no：6所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：7具有如下同一性的氨基酸序列：85％或大于85％(即86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：15具有如下同一性的氨基酸序列：85％或大于85％(即86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：14所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：16具有如下同一性的氨基酸序列：85％或大于85％(即86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：8具有如下同一性的氨基酸序列：85％或大于85％(即86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于85％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：11具有如下同一性的氨基酸序列：85％或大于85％(即86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于85％)，所述轻链可变区包含与seq id no：15具有如下同一性的氨基酸序列：85％或大于85％(即86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：14所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：13具有如下同一性的氨基酸序列：85％或大于85％(即86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：15具有如下同一性的氨基酸序列：85％或大于85％(即86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：14所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：16具有如下同一性的氨基酸序列：85％或大于85％(即86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：15具有如下同一性的氨基酸序列：85％或大于85％(即86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：14所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：24具有如下同一性的氨基酸
序列：85％或大于85％(即86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：29具有如下同一性的氨基酸序列：85％或大于85％(即86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：17、seq id no：18和seq id no：19所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：20、seq id no：21或22和seq id no：28所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：104具有如下同一性的氨基酸序列：85％或大于85％(即86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：8具有如下同一性的氨基酸序列：85％或大于85％(即86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：104具有如下同一性的氨基酸序列：85％或大于85％(即86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：15具有如下同一性的氨基酸序列：85％或大于85％(即86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。
[0054]
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：13具有如下同一性的氨基酸序列：90％或大于90％(即91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：8具有如下同一性的氨基酸序列：90％或大于90％(即91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：7具有如下同一性的氨基酸序列：90％或大于90％(即91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：15具有如下同一性的氨基酸序列：90％或大于90％(即91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：14所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：16具有如下同一性的氨基酸序列：90％或大于90％(即91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：8具有如下同一性的氨基酸序列：90％或大于90％(即91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上
定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：11具有如下同一性的氨基酸序列：90％或大于90％(即91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：15具有如下同一性的氨基酸序列：90％或大于90％(即91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：14所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：13具有如下同一性的氨基酸序列：90％或大于90％(即91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：15具有如下同一性的氨基酸序列：90％或大于90％(即91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：14所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：16具有如下同一性的氨基酸序列：90％或大于90％(即91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：15具有如下同一性的氨基酸序列：90％或大于90％(即91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：14所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：24具有如下同一性的氨基酸序列：90％或大于90％(即91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：29具有如下同一性的氨基酸序列：90％或大于90％(即91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：17、seq id no：18和seq id no：19所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：20、seq id no：21或22和seq id no：28所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：104具有如下同一性的氨基酸序列：90％或大于90％(即91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：8具有如下同一性的氨基酸序列：90％或大于90％(即91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：104具有如下同一性的氨基酸序列：90％或大于90％(即91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：15具有如下
同一性的氨基酸序列：90％或大于90％(即91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。
[0055]
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：13具有如下同一性的氨基酸序列：95％或大于95％(即96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：8具有如下同一性的氨基酸序列：95％或大于95％(即96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：7具有如下同一性的氨基酸序列：95％或大于95％(即96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：15具有如下同一性的氨基酸序列：95％或大于95％(即96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：14所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：16具有如下同一性的氨基酸序列：95％或大于95％(即96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：8具有如下同一性的氨基酸序列：95％或大于95％(即96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：11具有如下同一性的氨基酸序列：95％或大于95％(即96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：15具有如下同一性的氨基酸序列：95％或大于95％(即96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：14所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：13具有如下同一性的氨基酸序列：95％或大于95％(即96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：15具有如下同一性的氨基酸序列：95％或大于95％(即96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：14所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：16具有如下同一性的氨基酸序列：95％或大于95％(即96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：15具有如下同一性的氨基酸序列：95％或大于95％(即96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所
示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：14所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：24具有如下同一性的氨基酸序列：95％或大于95％(即96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：29具有如下同一性的氨基酸序列：95％或大于95％(即96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：17、seq id no：18和seq id no：19所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：20、seq id no：21或22和seq id no：28所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：104具有如下同一性的氨基酸序列：95％或大于95％(即96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：8具有如下同一性的氨基酸序列：95％或大于95％(即96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与seq id no：104具有如下同一性的氨基酸序列：95％或大于95％(即96％、97％、98％、99％或大于99％)，所述轻链可变区包含与seq id no：15具有如下同一性的氨基酸序列：95％或大于95％(即96％、97％、98％、99％或大于99％)，其中保持如上定义的cdr序列(分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；和分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6所示的轻链cdr1、cdr2和cdr3序列)。
[0056]
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含(i)包含如seq id no：13所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如seq id no：8所示的氨基酸序列的轻链可变区；或(ii)包含如seq id no：7所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如seq id no：15所示的氨基酸序列的轻链可变区；或(iii)包含如seq id no：16所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如seq id no：8所示的氨基酸序列的轻链可变区；或(iv)包含如seq id no：11所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如seq id no：15所示的氨基酸序列的轻链可变区；或(v)包含如seq id no：13所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如seq id no：15所示的氨基酸序列的轻链可变区；或(vi)包含如seq id no：16所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如seq id no：15所示的氨基酸序列的轻链可变区；或(vii)包含如seq id no：24所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如seq id no：29所示的氨基酸序列的轻链可变区；或(viii)包含如seq id no：104所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如seq id no：8所示的氨基酸序列的轻链可变区；或(ix)包含如seq id no：104所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如seq id no：15所示的氨基酸序列的轻链可变区。
[0057]
本发明还提供抗体或其抗原结合片段，其包括(i)包含如seq id no：11所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如seq id no：8所示的氨基酸序列的轻链可变区；或(ii)包含如seq id no：13所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如seq id no：8所示的氨基酸序列的轻链可变区；或(iii)包含如seq id no：7所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如seq id no：15所示的氨基酸序列的轻链可变区；或(iv)包含如seq id no：16所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如seq id no：8所示的氨基酸序列的轻链可变区；或(v)包含如
seq id no：11所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如seq id no：15所示的氨基酸序列的轻链可变区；或(vi)包含如seq id no：13所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如seq id no：15所示的氨基酸序列的轻链可变区；或(vii)包含如seq id no：16所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如seq id no：15所示的氨基酸序列的轻链可变区；或(viii)包含如seq id no：24所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如seq id no：29所示的氨基酸序列的轻链可变区；或(ix)包含如seq id no：104所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如seq id no：8所示的氨基酸序列的轻链可变区；或(x)包含如seq id no：104所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如seq id no：15所示的氨基酸序列的轻链可变区。
[0058]
本发明的示例性抗体的cdr和vh/vl序列，即抗体mgu10变体1(mgu10v1)、mgu10变体2(mgu10v2)、mgu10变体3(mgu10v3)、mgu10变体4(mgu10v4)、mgu10变体5(mgu10v5)、ggu10变体6(mgu60v6)、mgu10变体7(mgu10v7)、mgu10变体8(mgu10v8)、mgu10变体9(mgu10v9)和mgh2变体1(mgh2v1)，以及它们各自的野生型参考抗体mgu10和mgh2显示在下表1中。
[0059]
表1：本发明的示例性抗体及其各自的参考抗体mgu10和mgh2的cdr和vh/vl序列。
[0060][0061][0062]
特别地，本发明的抗体或其抗原结合片段(特异性地)结合恶性疟原虫子孢子。抗
体或其抗原结合片段可提供针对疟原虫(恶性疟原虫)的保护，特别是抗体或其抗原结合片段可抑制或减轻疟原虫(恶性疟原虫)感染(的症状)。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段可预防、减少、抑制和/或中和恶性疟原虫的感染。更具体地，根据本发明的抗体或其抗原结合片段可(特异性地)结合疟原虫环子孢子蛋白(csp)，例如根据seq id no：33的恶性疟原虫环子孢子蛋白(pfcsp)。
[0063]
换言之，根据本发明的抗体或其抗原结合片段能够识别表位、特别是csp表位。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段(特异性)结合恶性疟原虫环子孢子蛋白(pfcsp)的nanp重复区域。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段(特异性)结合恶性疟原虫环子孢子蛋白的n-末端区域，所述区域覆盖环子孢子蛋白的n-末端结构域和nanp-重复区域。通常，本发明的抗体或其抗原结合片段就其互补位而言可以是单特异性的(即，抗体或抗原结合片段可以仅包含一种单一种类/类型的抗原结合位点)；抗体或抗原结合片段的所有抗原结合位点可具有相同的cdr或vh/vl序列)，但同时，抗体或抗原结合片段可在以下方面具有“双重特异性”：csp上的靶表位(即，抗体或抗原结合片段可识别csp上的两个(或多于两个)表位，特别是本文所述的两个表位)。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段的单个互补位能够结合pfcsp的nanp重复区域和pfcsp的n-末端区域，从而覆盖环子孢子蛋白的n-末端结构域和nanp重复区域。csp的nanp重复区域是本领域技术人员众所周知的。例如，csp的nanp重复区域可具有如seq id no：34所示的氨基酸序列。例如，csp的n-末端区域，其覆盖环子孢子蛋白的n-末端结构域和nanp重复区域之间的连接，可具有如seq id no：35或seq id no：105所示的氨基酸序列。因此，根据本发明的抗体或其抗原结合片段可(特异性地)结合至根据seq id no：34的肽和/或根据seq id no：35或seq id no：105的肽。
[0064]
评估根据本发明的抗体或其抗原结合片段的结合的标准方法是本领域技术人员已知的，并且包括例如elisa(酶联免疫吸附测定)。示例性的标准elisa可如下进行：elisa板可用足量(例如1μg/ml)的待测试抗体结合的蛋白质/复合物/颗粒包被。例如，为了测试与上述csp或其表位的结合，可使用csp蛋白(例如，seq id no：33)和/或其片段/表位(例如，seq id no：34或35/105的肽)。elisa板可直接或间接包被(例如，首先用抗生物素蛋白包被板，然后将它们与待测试抗体结合的生物素化蛋白质/复合物/颗粒一起孵育)。在第一包被步骤(抗生物素蛋白或直接用待测试抗体结合的蛋白质/复合物/颗粒)后，可封闭板，例如用1％w/v的牛血清白蛋白(bsa)的pbs溶液。在包被的板与待测抗体一起孵育之前，可洗涤它们。例如，为了确定ec
50
值，通常将板与不同浓度的待测抗体一起孵育(“滴定”)。例如，可使用山羊抗人igg，例如与碱性磷酸酶偶联，来揭示抗体结合。然后可洗涤板，可添加所需的底物(例如，p-npp)并且可例如在405nm波长下读取板以测定光密度值。抗体结合的相对亲和力可通过测量在饱和时达到50％最大结合所需的抗体浓度(ec
50
)来确定。ec
50
值可通过用具有可变斜率的四参数非线性回归拟合的结合曲线的插值来计算。实施例2中描述这种elisa的具体实例，其也可以(以基本上相同的方式)用其他抗体或抗原结合片段进行。
[0065]
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段具有低于103ng/ml、例如低于200ng/ml或100ng/ml的ec
50
值，用于将csp(例如，seq id no：33)例如结合至其片段/表位(例如，seq id no：34和/或seq id no：35/seq id no：105)。例如，本发明的抗体或其抗原
结合片段可具有低于103ng/ml、例如低于200或100ng/ml的ec
50
值，用于结合至seq id no：34的肽和用于结合至seq id no：35或seq id no：105的肽。更具体地，本发明的抗体或其抗原结合片段可具有低于30ng/ml的ec
50
值用于结合至seq id no：34的肽和用于结合至seq id no：35或seq id no：105的肽。例如，本发明的抗体或其抗原结合片段可具有低于29ng/ml(例如低于28ng/ml或27ng/ml)的ec
50
值用于结合至seq id no：34的肽和低于26ng/ml(例如低于23或21ng/ml)的ec
50
值用于结合至seq id no：35或seq id no：105的肽。
[0066]
在一些实施方案中，根据本发明的抗体或其抗原结合片段包含抗体或其抗原结合片段(vh)的重链的可变区，其由核酸编码，所述核酸包含vh3基因家族的基因(区段)、例如基因(区段)vh3-30。
[0067]
为了在实验室中研究和定量病毒感染性(或“中和”)，本领域技术人员知道各种标准的“中和试验”。对于中和试验，动物病毒通常在细胞和/或细胞系中繁殖。例如，在中和试验中，培养的细胞可以在存在(或不存在)待测抗体下与固定量的恶性疟原虫子孢子一起孵育。例如，可使用流式细胞术作为读数。或者，也可预想到其他读数。
[0068]
在一些情况下，本发明的抗体或其抗原结合片段可降低疟原虫子孢子的滑行运动。疟原虫子孢子通过蚊虫叮咬传播到脊椎动物宿主的皮肤中。在子孢子进入血流之前，它们在肌动球蛋白系统的驱动下，使用称为“滑行运动”的运动形式快速穿过真皮。因此，子孢子运动是寄生虫传播和脊椎动物宿主成功感染的关键先决条件。
[0069]
子孢子的滑行运动可通过体外试验来评估，其中子孢子允许在平面表面上、例如在玻璃表面上在平面上滑行。子孢子的滑行轨迹可通过用抗csp抗体覆盖表面来可视化，所述抗体检测滑行过程中子孢子脱落的csp。抗csp抗体本身可标记(例如生物素)，或者可使用针对抗csp抗体的标记二抗来可视化轨迹。为了测试化合物对子孢子滑行的作用，子孢子可在它们允许滑行之前与测试化合物一起预孵育。滑行测定的详细方案是本领域已知的，并且描述于例如实施例4或prinz，h.l.，sattler，j.m.&frischknecht，f.(2017)plasmodium sporozoite motility on flat substrates.bio-protocol 7，e2395中。此外，利用人体组织的离体成像技术可用于确定子孢子的滑行运动，例如winkel，b.m.f.，de korne，c.m.，van oosterom，m.n等人，(2019)quantification of wild-type and radiation attenuated plasmodium falciparum sporozoite motility in human skin.sci rep 9，13436中所述。在一些方案实施中，本发明的抗体或其抗原结合片段分别比其亲本抗体mgu10或mgh2更大程度地降低疟原虫子孢子的滑行运动。这可通过直接比较根据本发明的亲本抗体(mgu10或mgh2)及其变体抗体(或其抗原结合片段)在例如如实施例4所述的相同滑行运动测定中的作用来容易地评估。
[0070]
在一些情况下，本发明的抗体或其抗原结合片段可减少疟原虫子孢子的细胞穿越。当子孢子向肝脏移动时，它们可以进入和离开瞬时液泡内的宿主细胞，这一过程称为细胞穿越。穿越允许子孢子穿过细胞屏障并且逃避宿主免疫反应，从而代表成功感染脊椎动物宿主的关键先决条件。
[0071]
子孢子的细胞穿越可以通过体外测定来评估，其中子孢子与宿主细胞在共培养物中一起孵育。为了可视化，可在例如共培养物中使用各种(例如荧光)标记，或者子孢子可与标记一起预孵育(例如，如实施例5所述)。或者，可以使用基因修饰的疟原虫菌株，其表达例如荧光标记。为了测试化合物对穿越的作用，子孢子可在它们与宿主细胞共培养之前与测
试化合物一起预孵育。子孢子穿越试验的详细方案是本领域已知的，并且例如在如下中描述：实施例5；和schleicher，t.r.，yang，j.，freudzon，m等人，(2018)a mosquito salivary gland protein partially inhibits plasmodium sporozoite cell traversal and transmission.nat commun 9，2908；或sinnis，p.，de la vega，p.，coppi，a.，krzych，u.，&mota，m.m.(2013).quantification of sporozoite invasion，migration，and development by microscopy and flow cytometry.methods in molecular biology(clifton，n.j.)，923，385-400。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段分别比其亲本抗体mgu10或mgh2在更大程度上减少疟原虫子孢子细胞穿越。这可通过直接比较根据本发明的亲本抗体(mgu10或mgh2)及其变体抗体(或其抗原结合片段)在相同的穿越试验中的作用来容易地评估，例如如实施例5所述。
[0072]
在一些情况下，本发明的抗体或其抗原结合片段可减少疟原虫子孢子的侵袭和/或成熟。子孢子侵袭肝细胞并且随后成熟为红细胞外型是建立疟疾感染的必要步骤。
[0073]
子孢子的侵袭和/或成熟可通过体外测定来评估，其中子孢子与宿主细胞(例如，肝细胞)一起孵育。为了可视化，可使用各种(例如荧光)标记(例如如实施例3中所述)。或者，可使用基因修饰的疟原虫菌株，其表达例如荧光标记。为了测试化合物对侵袭和/或成熟的影响，子孢子可在它们与宿主细胞共孵育之前与测试化合物一起预孵育。子孢子侵袭/成熟测定的详细方案是本领域已知的，并且例如在如下中描述：实施例3；kaushansky，a.，rezakhani，n.，mann，h.&kappe，s.h.(2012)development of a quantitative flow cytometry based assay to assess infection by plasmodium falciparum sporozoites.molecular and biochemical parasitology 183，100-103；rodriguez-gal
á
n a，salman am，bowyer g，collins ka，longley rj，brod f，ulaszewska m，ewer kj，janse cj，khan sm，hafalla jc，hill avs，spencer aj.(2017)an in vitro assay to measure antibody-mediated inhibition of p.berghei sporozoite invasion against p.falciparum antigens.sci rep 5；7(1)：17011；或sinnis，p.，de la vega，p.，coppi，a.，krzych，u.，&mota，m.m.(2013).quantification of sporozoite invasion，migration，and development by microscopy and flow cytometry.methods in molecular biology(clifton，n.j.)，923，385-400。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段分别比其亲本抗体mgu10或mgh2在更大程度上降低疟原虫子孢子的侵袭/成熟。这可通过直接比较根据本发明的亲本抗体(mgu10或mgh2)及其变体抗体(或其抗原结合片段)在相同的侵袭/成熟试验中的作用来容易地评估，例如如实施例3所述。
[0074]
在一些实施方案中，与其亲本抗体mgu10或mgh2相比，本发明的抗体或其抗原结合片段可分别表现出增加的稳定性。应理解，为了比较，本发明的变体抗体及其亲本抗体在相同条件下(即，并行)进行测试。例如，与其亲本抗体mgu10或mgh2相比，本发明的抗体或其抗原结合片段在低于6的ph、例如ph为5.5或5.6下，可分别表现出增加的稳定性。这可如通过将抗体储存在包含50mm乙酸钠和50mm nacl的ph为5.5的缓冲液中来实现。此外，抗体可暴露于热应激，例如约40℃，以测试其稳定性。稳定性试验通常持续至少几天，例如，2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或大于20天。在一些情况下，稳定性测试14或15天。
[0075]
在一些实施方案中，本发明的抗体是人抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体是
单克隆抗体。例如，本发明的抗体是人单克隆抗体。
[0076]
本发明的抗体可以是任何同种型(例如，iga、igg、igm，即α、γ或μ重链)。例如，抗体是igg型。在igg同种型内，抗体可以是igg1、igg2、igg3或igg4亚类，例如igg1。本发明的抗体可具有κ或λ轻链。在一些实施方案中，抗体具有λ或κ轻链。在一些实施方案中，抗体是igg1型并且具有λ或κ轻链。
[0077]
在一些实施方案中，抗体属于人igg1型。抗体可以是任何同种异型。术语“同种异型”是指在igg亚类中发现的等位基因变异。例如，抗体可以是g1m1(或g1m(a))同种异型、g1m2(或g1m(x))同种异型、g1m3(或g1m(f))同种异型和/或g1m17(或gm(z))同种异型。g1m3和g1m17同种异型位于ch1结构域中的相同位置(根据eu编号，位置214)。g1m3对应于r214(eu)，而g1m17对应于k214(eu)。g1m1同种异型位于ch3结构域(在位置356和358(eu))并且是指替换e356d和m358l。g1m2同种异型是指用甘氨酸替换位置431(eu)中的丙氨酸。g1m1同种异型可以与例如g1m3或g1m17同种异型组合。在一些实施方案中，抗体属于同种异型g1m3，不含g1m1(g1m3，-1)。在一些实施方案中，抗体是g1m17，1同种异型。在一些实施方案中，抗体是g1m3，1同种异型。在一些实施方案中，抗体属于同种异型g1m17，不含g1m1(g1m17，-1)。任选地，这些同种异型可以与g1m2、g1m27或g1m28同种异型组合(或不组合)。例如，抗体可以是g1m17，1，2同种异型。
[0078]
在一些实施方案中，根据本发明的抗体或其抗原结合片段包含fc部分。fc部分可源自人源，例如来自人igg1、igg2、igg3和/或igg4，例如人igg1。
[0079]
如本文所用，术语“fc部分”是指源自木瓜蛋白酶切割位点正上游铰链区的免疫球蛋白重链部分的序列(例如，天然igg中的残基216，将重链恒定区的第一残基看作114)，终止于免疫球蛋白的c-末端。因此，fc部分可以是完整的fc部分或其一部分(例如，结构域)。完整的fc部分包含至少一个铰链结构域、一个ch2结构域和一个ch3结构域(例如，eu氨基酸位置216-446)。额外的赖氨酸残基(k)有时存在于fc部分的极端c端，但其通常从成熟抗体中被切割下来。
[0080]
fc部分内的每个氨基酸位置在本文中根据kabat的本领域公认的eu编号系统进行编号，参见例如kabat等人，“sequences of proteins of immunological interest”，u.s.dept.health and human services，1983and 1987。kabat或eu编号中的eu索引或eu索引是指eu抗体的编号(edelman gm，cunningham ba，gall we，gottlieb pd，rutishauser u，waxdal mj.the covalent structure of an entire gammag immunoglobulin molecule.proc natl acad sci u s a.1969；63(1)：78-85；kabat e.a.，national institutes of health(u.s.)office of the director，“sequences of proteins of immunological interest”，5th edition，bethesda，md：u.s.dept.of health and human services，public health service，national institutes of health，1991，在此通过引用全部并入)。
[0081]
在一些实施方案中，在本发明的上下文中，fc部分包含以下中的至少之一：铰链(例如，上部、中部和/或下部铰链区)结构域、ch2结构域、ch3结构域或其变体、部分或片段。fc部分可包含至少一个铰链结构域、一个ch2结构域或一个ch3结构域。fc部分可以是完整的fc部分。fc部分还可包含相对于天然存在的fc部分的一个或多个氨基酸插入、缺失或置换。例如，铰链结构域、ch2结构域或ch3结构域(或其部分)中的至少一个可删除。例如，fc部
4988)。fcγriib在称为lsec的肝窦内皮上大量表达，并且在肝脏的库普弗细胞中，lsec是小免疫复合物清除的主要部位(ganesan，l.p等人，2012：fcγriib on liver sinusoidal endothelium clears small immune complexes.journal of immunology 189：4981-4988)。
[0086]
因此，本发明的抗体及其抗原结合片段可以能够结合fcγriib，例如包含用于结合fcγriib的fc部分的抗体，特别是fc区，例如igg型抗体。此外，有可能通过引入突变s267e和l328f来设计fc部分以增强fcγriib结合，如下所述：chu，s.y等人，2008：inhibition of b cell receptor-mediated activation of primary human b cells by coengagement of cd19 and fcγriib with fc-engineered antibodies.molecular immunology 45，3926-3933。因此，可增强免疫复合物的清除(chu，s等人，2014：accelerated clearance of ige in chimpanzees is mediated by xmab7195，an fc-engineered antibody with enhanced affinity for inhibitory receptor fcγriib.am j respir crit，american thoracic society international conference abstracts)。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段可包含具有突变s267e和l328f的工程化的fc部分，特别是如下所述：chu，s.y等人，2008：inhibition of b cell receptor-mediated activation of primary human b cells by coengagement of cd19 and fcγriib with fc-engineered antibodies.molecular immunology 45，3926-3933。
[0087]
在b细胞上，它看来可抑制进一步的免疫球蛋白产生和同种型转换，例如ige类。在巨噬细胞上，fcγriib用作抑制通过fcγriia介导的吞噬作用。在嗜酸性粒细胞和肥大细胞上，b形式可有助于通过ige与其单独受体结合来抑制这些细胞的活化。
[0088]
关于fcγri结合，e233-g236、p238、d265、n297、a327和p329中至少一个的天然igg中的修饰降低与fcγri的结合。233-236位的igg2残基置换为igg1和igg4，将与fcγri的结合降低103倍，并且消除人类单核细胞对抗体致敏红细胞的反应(armour，k.l等人，eur.j.immunol.29(1999)2613-2624)。关于fcγrii结合，发现对fcγriia的结合降低，例如对于e233-g236、p238、d265、n297、a327、p329、d270、q295、a327、r292和k414中至少一个的igg突变。关于fcγriii结合，发现与fcγriiia的结合降低，例如对于e233-g236、p238、d265、n297、a327、p329、d270、q295、a327、s239、e269、e293、y296、v303、a327、k338和d376中至少一个的突变。人igg1上fc受体结合位点的作图、上述突变位点以及测量与fcγri和fcγriia结合的方法描述于shields，r.l等人，j.biol.chem.276(2001)6591-6604中。例如，单突变(s239d或i332e)、双突变(s239d/i332e)和三突变(s239d/i332e/a330l)提高针对人fcγriiia的亲和力。此外，将突变g236a增加到s239d/i332e不仅提高fcγriia：fcγriib的比例，还增强与fcγriiia的结合。因此，描述突变g236a/s239d/a330l/i332e以增强fcγriia和fcγriiia的结合。
[0089]
关于与关键fcγrii的结合，天然igg fc的两个区域看来对fcγrii和igg的相互作用至关重要，即(i)igg fc的下部铰链位点，特别是氨基酸残基l、l、g、g(234-237，eu编号)，和(ii)igg fc的ch2结构域的相邻区域，特别是上部ch2结构域中与下部铰链区相邻的环和链，例如在p331区域(wines，b.d等人，j.immunol.2000；164：5313-5318)。此外，fcγri看与igg fc上的相同位点结合，然而fcrn和蛋白a与igg fc上的不同位点结合，所述位点看来位于ch2-ch3界面处(wines，b.d等人，j.immunol.2000；164：5313-5318)。
[0090]
例如，fc部分可包含本领域已知的fcrn结合或延长的半衰期所需的fc部分的至少一部分或由其组成。替代地或另外，本发明的抗体的fc部分包含本领域已知的蛋白a结合所需的至少部分和/或本发明的抗体的fc部分包含本领域已知的蛋白g结合所需的fc分子的至少部分。fc部分可包含本领域已知的fcγr结合所需的至少部分。如上所述，fc部分因此可至少包含(i)天然igg fc的下部铰链位点，特别是氨基酸残基l、l、g、g(234-237，eu编号)，和(ii)天然igg fc的ch2结构域的相邻区域，特别是上部ch2结构域中与下部铰链区相邻的环和链，例如在p331的区域中，例如在p331周围的天然igg fc的上部ch2结构域中至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的区域，例如在天然igg fc的氨基酸320和340(eu编号)之间。
[0091]
在一些实施方案中，根据本发明的抗体或其抗原结合片段包含fc区。如本文所用，术语“fc区”是指由抗体重链的两个或更多个fc部分形成的免疫球蛋白部分。例如，fc区可以是单体或“单链”fc区(即，scfc区)。单链fc区由在单个多肽链内连接(例如，在单个连续核酸序列中编码)的fc部分组成。示例性scfc区公开于wo 2008/143954 a2中。fc区可以是二聚体。“二聚fc区”或“dcfc”是指由两个独立免疫球蛋白重链的fc部分形成的二聚体。二聚fc区可以是两个相同fc部分的同源二聚体(例如，天然存在的免疫球蛋白的fc区)或两个不同fc部分的异源二聚体。
[0092]
fc区的fc部分可以是相同或不同的类和/或亚类。例如，fc部分可源自igg1、igg2、igg3或igg4亚类的免疫球蛋白(例如，人免疫球蛋白)。fc区的fc部分可以是同一类和亚类。然而，fc区(或fc区的一个或多个fc部分)也可以是嵌合的，由此嵌合fc区可包含源自不同免疫球蛋白类别和/或亚类的fc部分。例如，二聚体或单链fc区的至少两个fc部分可来自不同的免疫球蛋白类和/或亚类。另外或替代地，嵌合fc区可包含一个或多个嵌合fc部分。例如，嵌合fc区或部分可包含源自第一亚类(例如，igg1、igg2或igg3亚类)的免疫球蛋白的一个或多个部分，而fc区或部分的其余部分属于不同亚类。例如，fc多肽的fc区或部分可包含源自第一亚类(例如，igg1、igg2或igg4亚类)的免疫球蛋白的ch2和/或ch3结构域和来自第二亚类(例如，igg3亚类)的免疫球蛋白的铰链区。例如，fc区或部分可包含源自第一亚类(例如，igg4亚类)的免疫球蛋白的铰链和/或ch2结构域和来自第二亚类(例如，igg1、igg2或igg3亚类)的免疫球蛋白的ch3结构域。例如，嵌合fc区可包含来自第一亚类(例如igg4亚类)的免疫球蛋白的fc部分(例如，完整的fc部分)和来自第二亚类(例如，igg1、igg2或igg3亚类)的免疫球蛋白的fc部分。例如，fc区或部分可包含来自igg4免疫球蛋白的ch2结构域和来自igg1免疫球蛋白的ch3结构域。例如，fc区或部分可包含来自igg4分子的ch1结构域和ch2结构域以及来自igg1分子的ch3结构域。例如，fc区或部分可包含来自特定抗体亚类的ch2结构域的一部分，例如ch2结构域的eu位置292-340。例如，fc区或部分可包含氨基酸，ch2的292-340位源自igg4部分和ch2的其余部分源自igg1部分(或者，ch2的292-340可源自igg1部分和ch2的其余部分源自igg4部分)。
[0093]
此外，fc区或部分可(另外或替代地)例如包含嵌合铰链区。例如，嵌合铰链可例如部分源自igg1、igg2或igg4分子(例如，上部和下部中间铰链序列)，并且部分源自igg3分子(例如，中间铰链序列)。在另一实例中，fc区或部分可包含部分源自igg1分子并且部分源自igg4分子的嵌合铰链。在另一个实例中，嵌合铰链可包含来自igg4分子的上部和下部铰链结构域以及来自igg1分子的中间铰链结构域。这种嵌合铰链可例如通过在igg4铰链区的中
间铰链域中的eu位置228处引入脯氨酸置换(ser228pro)来制备。在其他实施方案中，嵌合铰链可包含位于eu位置233-236的氨基酸，其来自igg2抗体和/或ser228pro突变，其中铰链的其余氨基酸来自igg4抗体(例如，序列eskygppcppcpappvagp的嵌合铰链)。us 2005/0163783 a1中描述可用于根据本发明抗体的fc部分中的其他嵌合铰链。
[0094]
在一些实施方案中，fc部分或fc区包含源自人免疫球蛋白序列(例如，源自人igg分子的fc区或fc部分)的氨基酸序列或由其组成。然而，多肽可包含来自另一哺乳动物物种的一种或多种氨基酸。例如，灵长类动物fc部分或灵长类动物结合位点可包括在主题多肽中。或者，一个或多个小鼠氨基酸可存在于fc部分或fc区中。
[0095]
在一些实施方案中，根据本发明的抗体特别是除了如上所述fc部分之外，还包含来自恒定区、特别是来自igg的恒定区、例如(人)igg1的恒定区的其他部分。根据本发明的抗体特别是除了如上所述fc部分之外，还可包含恒定区的所有其他部分，特别是igg(例如(人)igg1)的恒定区的所有其他部分。
[0096]
恒定区的实例序列是根据seq id no：30至seq id no：32的氨基酸序列。例如，igg1 ch1-ch2-ch3的氨基酸序列是根据seq id no：30或其序列变体(包括例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或大于10个突变)，其具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，igg1ch1-ch2-ch3的氨基酸序列可根据seq id no：103或其序列变体(包括例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或大于10个突变)，其具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的序列同一性，其中可保持突变m428l和/或n434s。
[0097]
如上所述，根据本发明的抗体可包含源自人igg1的(完整)fc区。在一些实施方案中，根据本发明的抗体特别地除了源自人igg1的(完整)fc区之外，还包含igg恒定区的所有其他部分，例如(人)igg1的恒定区的所有其他部分。
[0098]
在一些实施方案中，根据本发明的抗体包含(完整的)fc部分/fc区，其中与fcr的相互作用/结合未受到损害。通常，抗体与fc受体的结合可通过本领域技术人员已知的各种方法评估，例如elisa(hessell aj，hangartner l，hunter m，havenith ceg，beurskens fj，bakker jm，lanigan cms，landucci g，forthal dn，parren pwhi等人：fc receptor but not complement binding is important in antibody protection against hiv.nature 2007，449：101-104；grevys a，bern m，foss s，bratlie db，moen a，gunnarsen ks，aase a，michaelsen te，sandlie i，andersen jt：fc engineering of human igg1 for altered binding to the neonatal fc receptor affects fc effector functions.2015，194：5497-5508)或流式细胞术(perez lg，costa mr，todd ca，haynes bf，montefiori dc：utilization of immunoglobulin g fc receptors by human immunodeficiency virus type 1：a specific role for antibodies against the membrane-proximal external region of gp41.j virol 2009，83：7397-7410；piccoli l，campo i，fregni cs，rodriguez bmf，minola a，sallusto f，luisetti m，corti d，lanzavecchia a：neutralization and clearance of gm-csf by autoantibodies in pulmonary alveolar proteinosis.nat commun 2015，6：1-9)。
[0099]
通常，根据本发明的抗体可以是糖基化的。例如，连接到重链ch2结构域的n-连接
聚糖可影响c1q和fcr结合，其中糖基化抗体对这些受体的亲和力较低。因此，根据本发明的抗体的fc部分的ch2结构域可包含一个或多个突变，其中糖基化残基被非糖基化残基置换。例如，抗体的聚糖在给药后不引起人类免疫原性反应。
[0100]
此外，可通过将(随机)氨基酸突变引入重链的ch2或ch3结构域的特定区域来修饰根据本发明的抗体，以便与未修饰的抗体相比，改变它们对fcr的结合亲和力和/或其血清半衰期。这种修饰的实例包括但不限于来自重链恒定区的至少一个氨基酸的置换，所述氨基酸选自氨基酸残基250、314和428。这种fc修饰的进一步实例描述于saxena a，wu d.advances in therapeutic fc engineering-modulation of igg-associated effector functions and serum half-life.front immunol.2016；7：580中，通过引用并入本文。在一些实施方案中，抗体可包含“yte”突变(m252y/s254t/t256e；eu编号)。在一些实施方案中，抗体可包含重链恒定区中的突变m428l和/或n434s(eu编号)。例如，抗体可包含重链恒定区，所述重链恒定区包含如seq id no：103所示的氨基酸序列；或与seq id no：103具有如下同一性的氨基酸序列：至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％，其中保持突变m428l和n434s。
[0101]
在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含如seq id no：100所示的氨基酸序列；或与seq id no：100具有如下同一性的氨基酸序列：至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％，其中重链cdr1、cdr2和cdr3序列分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示，并且保持突变m428l和n434s。
[0102]
在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含如seq id no：102所示的氨基酸序列；或与seq id no：102具有如下同一性的氨基酸序列：至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％，其中重链cdr1、cdr2和cdr3序列分别如seq id no：17、seq id no：18和seq id no：19所示，并且保持突变m428l和n434s。
[0103]
本发明的抗体还包括杂合抗体分子，其包含来自如上定义的本发明抗体的六个cdr和来自针对抗原的另一抗体的一个或多个cdr。例如，抗体可以是双特异性的。
[0104]
变体抗体也包括在本发明的范围内。因此，本技术中所述序列的变体也包括在本发明的范围内。这种变体包括体内在免疫应答过程中或体外培养永生化b细胞克隆时通过体细胞突变产生的天然变体。或者，变异可由于遗传密码的简并性而产生，或可由于转录或翻译错误而产生。
[0105]
本发明的抗体可以纯化形式提供。通常，抗体将存在于基本上不含其他多肽的组合物中，例如其中小于90％(按重量计)、通常小于60％和更通常小于50％的组合物由其他多肽组成。
[0106]
本发明的抗体在非人(或异源)宿主例如小鼠中可以是免疫原性的。特别地，抗体可具有在非人类宿主中具有免疫原性但在人类宿主中不具有免疫原性的独特位。特别地，用于人类的本发明的抗体包括那些不能容易地从宿主如小鼠、山羊、兔、大鼠、非灵长类哺
76至seq id no 78中任一项所述的核苷酸序列和根据seq id no 79至seq id no 81中任一项所述的核苷酸序列。
[0139]
本发明还提供一种第一核酸分子和第二核酸分子的组合，其中
[0140]-第一核酸分子包含编码抗体或其抗原结合片段的重链的多核苷酸，所述多核苷酸包含：(a)根据seq id no 52至seq id no 57中任一项所述的核苷酸序列；或(b)根据seq id no 82至seq id no 84中任一项所述的核苷酸序列、根据seq id no 85至seq id no 87中任一项所述的核苷酸序列和根据seq id no 88至seq id no 90中任一项所述的核苷酸序列；和
[0141]-第二核酸分子包含编码抗体或其抗原结合片段的轻链的多核苷酸，所述多核苷酸包含：(c)根据seq id no 58至seq id no 63中任一项所述的核苷酸序列；或(d)根据seq id no 91至seq id no 93中任一项所述的核苷酸序列、根据seq id no 94至seq id no 96中任一项所述的核苷酸序列和根据seq id no 97至seq id no 99中任一项所述的核苷酸序列。
[0142]
本发明还提供第一核酸分子和第二核酸分子的组合，其中
[0143]-第一核酸分子包含编码抗体或其抗原结合片段的重链的多核苷酸，所述多核苷酸包含：(a)根据seq id no 52至seq id no 57中任一项所述的核苷酸序列；或(b)根据seq id no 82至seq id no 84中任一项所述的核苷酸序列、根据seq id no 85至seq id no 87中任一项所述的核苷酸序列和根据seq id no 88至seq id no 90中任一项所述的核苷酸序列；和
[0144]-第二核酸分子包含编码抗体或其抗原结合片段的轻链的多核苷酸，所述多核苷酸包含：(c)根据seq id no 39、seq id no 58至seq id no 63中任一项所述的核苷酸序列；或(d)根据seq id no 91至seq id no 93中任一项所述的核苷酸序列、根据seq id no 94至seq id no 96中任一项所述的核苷酸序列和根据seq id no 97至seq id no 99中任一项所述的核苷酸序列。
[0145]
特别地，可选择第一核酸分子和第二核酸分子使得它们一起编码(i)六个cdr，(ii)可变区vh和vl；或如下示例性抗体中任一种的轻链和重链：mgu10v1、mgu10v2、mgu10v3、mgu10v4、mgu10v5、mgu10v6、mgu10v7、mgu10v8、mgu10v9或mgh2v1。
[0146]
再有，以上关于本发明核酸分子的(一般)特征的描述相应地适用于组合的第一核酸分子和第二核酸分子。
[0147]
seq id no 40至seq id no 99和seq id no 106的核酸序列针对抗体表达进行密码子优化。
[0148]
载体
[0149]
进一步包括在本发明范围内的是包含根据本发明的核酸分子的载体，例如表达载体。通常，载体包含如上所述的核酸分子。
[0150]
本发明还提供第一载体和第二载体的组合，其中第一载体包含如上所述的第一核酸分子(对于核酸分子的组合)，并且第二载体包含如上所述的第二核酸分子(对于核酸分子的组合)，特别是其中第一核酸分子和第二核酸分子选自与上述核酸分子相同(的实施方案)的组合。更具体地，可选择第一核酸分子和第二核酸分子使得它们一起编码(i)六个cdr，(ii)可变区vh和vl；或如下示例性抗体中任一种的轻链和重链：mgu10v1、mgu10v2、
mgu10v3、mgu10v4、mgu10v5、mgu10v6、mgu10v7、mgu10v8、mgu10v9或mgh2v1。
[0151]
载体通常是重组核酸分子，即自然界中不存在的核酸分子。因此，载体可包含异源元件(即，自然界中不同来源的序列元件)。例如，载体可包含多克隆位点、异源启动子、异源增强子、异源选择标记(以与不包含所述载体的细胞相比，识别包含所述载体的细胞)等。本发明上下文中的载体适用于并入或携带所需核酸序列。这样的载体可以是储存载体、表达载体、克隆载体、转移载体等。储存载体是允许方便地储存核酸分子的载体。因此，载体可包含对应于例如根据本发明(的重链和/或轻链)所需抗体的序列。表达载体可用于产生表达产物，例如rna，例如mrna或肽、多肽或蛋白质。例如，表达载体可以包含载体的一段序列的转录所需的序列，例如(异源)启动子序列。克隆载体通常是包含克隆位点的载体，其可用于将核酸序列并入载体中。克隆载体可以是例如质粒载体或噬菌体载体。转移载体可以是适合将核酸分子转移到细胞或生物体中的载体，例如病毒载体。本发明上下文中的载体可以是例如rna载体或dna载体。例如，本技术意义上的载体包含克隆位点、选择标记，例如抗生素抗性因子，和适合载体增殖的序列，例如复制起点。本技术上下文中的载体可以是质粒载体。
[0152]
细胞
[0153]
再一方面，本发明还提供表达根据本发明的抗体；和/或包含根据本发明的载体(或载体的组合)的细胞。
[0154]
这种细胞的实例包括但不限于真核细胞，例如酵母细胞、动物细胞或植物细胞。这种细胞的其他实例包括但不限于原核细胞，例如大肠杆菌。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，例如哺乳动物细胞系。实例包括人细胞、cho细胞、hek293t细胞、per.c6细胞、ns0细胞、人肝细胞、骨髓瘤细胞或杂交瘤细胞。
[0155]
可用根据本发明的载体，例如用表达载体转染细胞。术语“转染”是指将核酸分子例如dna或rna(例如mrna)分子引入细胞，例如引入真核细胞或原核细胞。在本发明的上下文中，术语“转染”包括技术人员已知的用于将核酸分子引入细胞例如哺乳动物细胞的任何方法。这种方法包括例如电穿孔，脂质转染(例如基于阳离子脂质和/或脂质体)、磷酸钙沉淀、基于纳米颗粒的转染、基于病毒的转染或基于阳离子聚合物的转染，如deae-葡聚糖或聚乙烯亚胺等。在一些实施方案中，引入是非病毒的。
[0156]
此外，本发明的细胞可用根据本发明的载体稳定或瞬时转染，例如用于表达根据本发明的抗体。在一些实施方案中，用编码根据本发明的抗体的根据本发明的载体稳定转染细胞。在其他实施方案中，用编码根据本发明的抗体的根据本发明的载体瞬时转染细胞。
[0157]
相应地，本发明还提供异源表达本发明抗体或其抗原结合片段的重组宿主细胞。例如，细胞可以是与抗体不同的物种(例如，表达人抗体的cho细胞)。在一些实施方案中，细胞的细胞类型在自然界中不表达(这种)抗体。此外，宿主细胞可以对不以其天然状态存在的抗体赋予翻译后修饰(ptm；例如，糖基化)。这种ptm可导致功能差异(例如，降低的免疫原性)。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段可具有翻译后修饰，其不同于天然产生的抗体(例如人类免疫应答的抗体)。
[0158]
产生抗体
[0159]
根据本发明的抗体可通过本领域已知的任何方法制备。例如，使用杂交瘤技术制备单克隆抗体的一般方法是众所周知的(kohler，g.and milstein，c，.1975；kozbar等人，
1983)。在一些实施方案中，使用wo2004/076677中描述的替代ebv永生化方法。
[0160]
在一些实施方案中，使用wo 2004/076677中描述的方法，该文献通过引用并入本文。该方法中，用ebv和多克隆b细胞激活剂转化产生本发明抗体的b细胞。在转化步骤期间可任选地添加另外的细胞生长和分化刺激剂以进一步提高效率。这些兴奋剂可以是细胞因子，例如il 2和il-15。一方面，在永生化步骤中添加il-2以进一步提高永生化效率，但其使用不是必需的。然后可使用本领域已知的方法培养使用这些方法产生的永生化b细胞并且从中分离抗体。
[0161]
wo 2010/046775中描述另一种示例性方法。在这种方法中，浆细胞的培养数量有限，或作为单个浆细胞在微孔培养板中培养。可从浆细胞培养物中分离抗体。此外，可从浆细胞培养物中提取rna并且可使用本领域已知的方法进行pcr。抗体的vh和vl区可通过rt-pcr(逆转录酶pcr)扩增，测序并且克隆到表达载体中，然后转染到hek293t细胞或其他宿主细胞中。核酸在表达载体中的克隆、宿主细胞的转染、转染的宿主细胞的培养和产生的抗体的分离可使用本领域技术人员已知的任何方法完成。
[0162]
如果需要，可使用过滤、离心和各种色谱方法例如hplc或亲和色谱进一步纯化抗体。用于纯化抗体例如单克隆抗体的技术、包括用于产生药物级抗体的技术，是本领域众所周知的。
[0163]
分子生物学的标准技术可用于制备编码本发明抗体的dna序列。可使用寡核苷酸合成技术完全或部分合成所需的dna序列。可根据需要使用定点诱变和聚合酶链反应(pcr)技术。
[0164]
任何合适的宿主细胞/载体系统均可用于表达编码本发明抗体分子的dna序列。真核例如哺乳动物、宿主细胞表达系统可用于产生抗体分子，例如完整的抗体分子。合适的哺乳动物宿主细胞包括但不限于cho、hek293t、per.c6、ns0、骨髓瘤或杂交瘤细胞。此外，原核生物例如细菌宿主细胞表达系统可用于产生抗体分子，例如完整的抗体分子。合适的细菌宿主细胞包括但不限于大肠杆菌细胞。
[0165]
本发明还提供用于产生根据本发明的抗体分子的方法，其包括在适合从编码本发明抗体分子的dna表达蛋白质的条件下，培养包含编码本发明核酸的载体的(异源)宿主细胞，并且分离抗体分子。
[0166]
为了产生包含重链和轻链两者的抗体，可用两种载体转染细胞系，第一载体编码轻链多肽，第二载体编码重链多肽。或者，可使用单个载体，所述载体包括编码轻链和重链多肽的序列。
[0167]
根据本发明的抗体可通过如下而产生：(i)在宿主细胞中例如通过使用根据本发明的载体表达根据本发明的核酸序列，和(ii)分离表达的抗体产物。此外，方法可包括(iii)纯化分离的抗体。可筛选转化的b细胞和培养的浆细胞以获得产生所需特异性或功能抗体的细胞。
[0168]
筛选步骤可通过任何免疫测定法例如elisa，通过组织或细胞(包括转染细胞)染色，通过中和测定法或通过本领域已知用于鉴定所需特异性或功能的许多其他方法之一进行。测定可基于对一种或多种抗原的简单识别进行选择，或者可基于所需功能进行选择，例如以选择中和抗体而不仅仅是抗原结合抗体，选择可改变靶细胞的如下特征的抗体：例如它们的信号级联、它们的形状、它们的生长速率、它们影响其他细胞的能力、它们对其他细
胞或其他试剂或条件变化的影响的反应、它们的分化状态等。
[0169]
然后可从阳性转化的b细胞培养物中产生单个转化的b细胞克隆。用于从阳性细胞混合物中分离单个克隆的克隆步骤可使用有限稀释、显微操纵、通过细胞分选的单细胞沉积或本领域已知的另一种方法进行。
[0170]
可使用本领域已知的方法在hek293t细胞或其他已知宿主细胞中分离、克隆和表达来自培养的浆细胞的核酸。
[0171]
本发明的永生化b细胞克隆或转染的宿主细胞可以多种方式使用，例如，作为单克隆抗体的来源，作为编码感兴趣的单克隆抗体的核酸(dna或mrna)的来源，用于研究等。
[0172]
本发明还提供包含产生根据本发明的抗体的永生化b记忆细胞或转染宿主细胞的组合物。
[0173]
本发明的永生化b细胞克隆或培养的浆细胞也可用作用于克隆抗体基因以用于随后重组表达的核酸来源。出于药学目的，重组来源的表达可比b细胞或杂交瘤的表达更常见，例如由于稳定性、可重复性、培养容易性等原因。
[0174]
因此，本发明还提供制备重组细胞的方法，其包括以下步骤：(i)从编码感兴趣抗体的b细胞克隆或培养的浆细胞中获得一种或多种核酸(例如，重链和/或轻链mrna)；(ii)将核酸插入表达载体和(iii)将载体转染到(异源)宿主细胞中以便允许感兴趣的抗体在此宿主细胞中表达。
[0175]
类似地，本发明还提供重组细胞的制备方法，其包括以下步骤：(i)对来自编码感兴趣抗体的b细胞克隆或培养的浆细胞的核酸进行测序；和(ii)使用来自步骤(i)的序列信息来制备用于插入宿主细胞的核酸，以便允许感兴趣的抗体在此宿主细胞中表达。核酸可但不必需在步骤(i)和(ii)之间进行操纵以引入限制性位点、改变密码子使用和/或优化转录和/或翻译调控序列。
[0176]
此外，本发明还提供转染的宿主细胞的制备方法，其包括以下步骤：用一种或多种编码感兴趣抗体的核酸转染宿主细胞，其中核酸是源自本发明的永生化抗体b细胞克隆或培养的浆细胞的核酸。因此，首先制备核酸然后使用其转染宿主细胞的步骤可由不同地方(例如，不同国家)的不同人在不同时间进行。
[0177]
然后可将本发明的这些重组细胞用于表达和培养目的。它们特别适用于大规模药物生产的抗体表达。它们也可用作药物组合物的活性成分。可使用任何合适的培养技术，包括但不限于静态培养、滚瓶培养、腹水液、中空纤维型生物反应器柱、模块化微型发酵罐、搅拌罐、微载体培养、陶瓷型芯灌注等。
[0178]
从b细胞或浆细胞获得和测序免疫球蛋白基因的方法是本领域众所周知的(例如，参见kuby immunology，第4版，2000的第4章)。
[0179]
转染的宿主细胞可以是真核细胞，包括酵母和动物细胞，特别是哺乳动物细胞(例如cho细胞、ns0细胞、人细胞如per.c6或hkb 11细胞、骨髓瘤细胞或人肝细胞)，以及植物细胞。在一些实施方案中，转染的宿主细胞是哺乳动物细胞，例如人类细胞。在一些实施方案中，表达宿主可对本发明的抗体进行糖基化，特别是对自身不具有人类免疫原性的碳水化合物结构。在一些实施方案中，转染的宿主细胞可以能够在无血清培养基中生长。在进一步的实施方案中，转染的宿主细胞可以能够在不存在动物衍生产物下在培养物中生长。也可以培养转染的宿主细胞以产生细胞系。
[0180]
本发明还提供制备一个或多个编码感兴趣抗体的核酸分子(例如重链和轻链基因)的方法，其包括以下步骤：(i)根据本发明制备永生化b细胞克隆或培养浆细胞；(ii)从b细胞克隆或培养的浆细胞获得编码目标抗体的核酸。此外，本发明提供获得编码感兴趣抗体的核酸序列的方法，其包括以下步骤：(i)根据本发明制备永生化b细胞克隆或培养浆细胞；(ii)对来自编码感兴趣抗体的b细胞克隆或培养的浆细胞的核酸进行测序。
[0181]
本发明进一步提供制备编码感兴趣抗体的核酸分子的方法，包括获得从本发明的转化的b细胞克隆或培养的浆细胞获得的核酸的步骤。因此，首先获得b细胞克隆或培养的浆细胞，然后从b细胞克隆或培养的浆细胞中获得核酸的步骤可由不同地方(例如，不同国家)的不同人进行。
[0182]
本发明还包括制备根据本发明的抗体(例如，用于药物用途)的方法，其包括以下步骤：(i)获得和/或测序来自选择的b细胞克隆或表达感兴趣抗体的培养的浆细胞的一个或多个核酸(例如重链和轻链基因)；(ii)将核酸插入表达载体或使用核酸序列制备表达载体；(iii)转染能够表达感兴趣抗体的宿主细胞；(iv)在表达感兴趣抗体的条件下培养或传代培养转染的宿主细胞；并且，任选地，(v)纯化感兴趣的抗体。
[0183]
本发明还提供制备感兴趣抗体的方法，其包括以下步骤：在表达感兴趣抗体的条件下，培养或传代培养转染的宿主细胞群，例如稳定转染的宿主细胞群，并且任选地纯化感兴趣的抗体，其中所述转染的宿主细胞群已通过如下制备：(i)提供编码选定感兴趣的抗体的核酸，其由如上所述制备的b细胞克隆或培养的浆细胞产生，(ii)将核酸插入表达载体，(iii)在可表达感兴趣抗体的宿主细胞中转染载体，和(iv)培养或传代培养包含插入的核酸的转染宿主细胞以产生感兴趣的抗体。因此，首先制备重组宿主细胞然后培养它以表达抗体的步骤可由不同地方(例如不同国家)的不同人在明显不同的时间进行。
[0184]
药物组合物
[0185]
本发明还提供药物组合物，其包含以下中的一种或多种：
[0186]
(i)本发明的抗体或其抗原结合片段；
[0187]
(ii)根据本发明的核酸或核酸的组合；
[0188]
(iii)根据本发明的载体或载体的组合；和/或
[0189]
(iv)表达根据本发明的抗体或包含根据本发明的载体的细胞，
[0190]
和任选的药学上可接受的稀释剂或载体。
[0191]
换言之，本发明还提供包含根据本发明的抗体、根据本发明的核酸、根据本发明的载体和/或根据本发明的细胞的药物组合物。
[0192]
药物组合物还可任选地包含药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。尽管载体或赋形剂可促进给药，但其本身不应诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体。也不应该有毒。合适的载体可以是大的缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和无活性病毒颗粒。在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物中的药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂不是关于恶性疟原虫感染和/或疟疾的活性成分。
[0193]
可使用药学上可接受的盐，例如无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐，或有机酸盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。
[0194]
药物组合物中的药学上可接受的载体可另外包含液体，例如水、盐水、甘油和乙
醇。此外，这种组合物中可存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂或ph缓冲物质。这种载体能够将药物组合物配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、浆液和悬浮剂，供对象摄取。
[0195]
本发明的药物组合物可以各种形式制备。例如，组合物可制成注射剂，作为液体溶液或悬浮液。也可制备适合在注射前溶解或悬浮在液体载体中的固体形式(例如，类似于synagis
tm
和的冻干组合物，用于用含有防腐剂的无菌水重构)。组合物可制备用于局部给药，例如作为软膏、乳膏或粉末。组合物可制备用于口服给药，例如作为片剂或胶囊、作为喷雾剂或作为糖浆剂(任选地调味)。组合物可制备用于肺部给药，例如作为吸入器，使用粉剂或喷雾剂。组合物可制成栓剂或子宫托。组合物可制备用于鼻、耳或眼给药，例如作为滴剂。组合物可以是试剂盒形式，设计成使得组合的组合物在向对象给药之前重构。例如，冻干抗体可与无菌水或无菌缓冲液一起以试剂盒形式提供。
[0196]
在一些实施方案中，组合物中的(唯一)活性成分是根据本发明的抗体。因此，它可容易在胃肠道中降解。因此，如果组合物将通过使用胃肠道的途径给药，则组合物可包含保护抗体免于降解但一旦其从胃肠道吸收就释放抗体的试剂。
[0197]
药学上可接受的载体的详细讨论可得自：gennaro(2000)remington：the science and practice of pharmacy，20th edition，isbn：0683306472。
[0198]
本发明的药物组合物通常具有5.5至8.5的ph，在一些实施方案中，其可为6至8、例如约7。可通过使用缓冲液来维持ph。组合物可以是无菌的和/或无热原的。组合物对于人类可以是等渗的。在一些实施方案中，本发明的药物组合物在密封容器中提供。
[0199]
在本发明的范围内是以几种给药形式存在的组合物；这些形式包括但不限于那些适合肠胃外给药的形式，例如通过注射或输注，例如通过推注或连续输注。当产品用于注射或输注时，它可采用油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且它可包含配制剂，例如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。或者，抗体可以是干燥形式，用于在使用前用合适的无菌液体重构。
[0200]
载体通常理解为适合于储存、运输和/或给药化合物例如药物活性化合物，特别是根据本发明的抗体的材料。例如，载体可以是生理学上可接受的液体，其适合于储存、运输和/或给药药物活性化合物，特别是根据本发明的抗体。一旦配制，本发明的组合物可直接向对象给药。在一些实施方案中，组合物适用于向哺乳动物、例如人类对象给药。
[0201]
本发明的药物组合物可通过任意数量的途径给药，包括但不限于口服、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、腹膜内、鞘内、心室内、经皮、经皮肤、局部、皮下、鼻内、肠内、舌下、阴道内或直肠途径。无针注射器也可用于给药本发明的药物组合物。任选地，药物组合物可制备用于口服给药，例如口服给药。作为片剂、胶囊等，用于局部给药，或作为注射剂，例如作为液体溶液或悬浮液。在一些实施方案中，药物组合物为注射剂。还包括适合在注射前溶解或悬浮在液体载体中的固体形式，例如药物组合物可以是冻干形式。
[0202]
用于注射，例如在静脉内、皮肤或皮下注射，或在患病部位注射时，活性成分可以是无热原并且具有合适的ph、等渗性和稳定性的肠胃外可接受的水溶液形式。本领域相关技术人员能够良好地使用例如等渗载体如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格注射液制备合适的溶液。根据需要，可包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。无论是待给予个体的抗体、肽、核酸分子还是根据本发明的另一种药学上有用的化合物，通常以“预防有效量”或“治疗有效量”给药(视情况而定)，这足以表明有益于个体。实际给药量、给药速率和时间过程将取决于所治疗的性质和严重程度。对于注射，根据本发明的药物组合物可以例如在预填充注射器中提供。
[0203]
如上定义的本发明药物组合物也可以任何口服可接受的剂型口服给药，包括但不限于胶囊、片剂、水性悬浮液或水溶液。在口服片剂的情况下，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还添加润滑剂，例如硬脂酸镁。对于以胶囊形式口服给药，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当口服使用需要水性悬浮液时，活性成分，即如上定义的本发明转运蛋白货物结合分子，与乳化剂和悬浮剂组合。如果需要，还可添加某些甜味剂、调味剂或着色剂。
[0204]
本发明的药物组合物也可局部给药，特别是当治疗目标包括通过局部应用容易接近的区域或器官时，例如，包括可及的上皮组织。为这些区域或器官中的每一个容易地制备合适的局部制剂。对于局部应用，本发明的药物组合物可配制成合适的软膏剂，其含有悬浮或溶解在一种或多种载体中的本发明药物组合物，特别是其如上定义的组分。用于局部给药的载体包括但不限于矿物油、液体矿脂、白矿脂、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，本发明的药物组合物可配制成合适的洗剂或霜剂。在本发明的上下文中，合适的载体包括但不限于矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。
[0205]
剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。特别地，药物组合物可作为单剂量产品提供。在一些实施方案中，药物组合物中抗体的量，特别是如果作为单剂量产品提供，则不超过200mg，例如不超过100mg或50mg。
[0206]
对于单剂量，例如每日、每周或每月剂量，根据本发明的药物组合物中抗体的量不可超过1g或500mg。在一些实施方案中，对于单剂量，根据本发明的药物组合物中抗体的量不可超过200mg或100mg。例如，对于单剂量，根据本发明的药物组合物中抗体的量不可超过50mg。
[0207]
药物组合物通常包含“有效”量的一种或多种本发明的抗体，即足以治疗、改善、减弱、减轻或预防所需疾病或病症，或表现出可检测的治疗效果的量。治疗效果还包括致病效力或身体症状的降低或减弱。任何特定对象的精确有效量将取决于他们的大小、体重和健康状况、病症的性质和程度以及选择用于给药的治疗剂或治疗剂的组合。给定情况的有效量由常规实验确定并且在临床医生的判断范围内。出于本发明的目的，有效剂量通常可为约0.005至约100mg/kg，例如约0.0075至约50mg/kg或约0.01至约10mg/kg。在一些实施方案中，本发明的抗体的有效剂量(例如，药物组合物中抗体的量)将为约0.02至约5mg/kg，相对于待给药个体的体重(例如，按kg计)。
[0208]
此外，根据本发明的药物组合物还可包含另外的活性成分，其可以是另外的抗体或不是抗体的成分。因此，根据本发明的药物组合物可包含一种或多种另外的活性成分。
[0209]
根据本发明的抗体可以存在于与另外的活性成分相同的药物组合物中，或者，根据本发明的抗体包含在第一种药物组合物中并且另外的活性成分包含在不同于第一药物组合物的第二种药物组合物中。因此，如果预想多于一种另外的活性成分，则每种另外的活性成分和根据本发明的抗体可包含在不同药物组合物中。这种不同药物组合物可组合/同时或在不同时间或在不同位置(例如身体的不同部分)给药。
[0210]
根据本发明的抗体和另外的活性成分可以提供另外的治疗效果，例如协同治疗效
果。术语“协同作用”用于描述两种或更多活性剂的组合作用，其大于每种相应活性剂的单独作用的总和。因此，当两种或更多种药剂的组合作用导致活性或工艺的“协同抑制”时，其意指对活性或工艺的抑制大于每个相应活性剂的抑制效果的总和。术语“协同治疗效果”是指使用两种或多种疗法的组合观察到的治疗效果，其中治疗效果(如通过多个参数中的任一个测量)大于使用相应单个疗法观察到的单独治疗效果的总和。
[0211]
在一些实施方案中，本发明的组合物可包含本发明的抗体，其中抗体可占组合物中总蛋白质的至少50重量％(例如，60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)。在本发明的组合物中，抗体可以是纯化形式。
[0212]
本发明还提供药物组合物的制备方法，其包括以下步骤：(i)制备本发明的抗体；和(ii)将纯化的抗体与一种或多种药学上可接受的载体混合。
[0213]
在其他实施方案中，药物组合物的制备方法包括以下步骤：将抗体与一种或多种药学上可接受的载体混合，其中抗体是获自本发明的转化b细胞或培养浆细胞的单克隆抗体。
[0214]
作为出于治疗目的递送抗体或b细胞的替代方案，可将编码源自b细胞或培养的浆细胞的感兴趣单克隆抗体的核酸(通常是dna)递送至对象，使得核酸可在对象中原位表达以提供所需的治疗效果。合适的基因治疗和核酸递送载体在本领域是已知的。
[0215]
药物组合物可包括抗微生物剂，特别是如果以多剂量形式包装。它们可包含清洁剂，例如吐温(聚山梨酯)，例如吐温80。清洁剂通常以低水平存在，例如小于0.01％。组合物还可包括钠盐(例如氯化钠)以提供张力。例如，10
±
2mg/ml nacl的浓度是典型的。
[0216]
此外，药物组合物可包含糖醇(例如甘露醇)或二糖(例如蔗糖或海藻糖)，例如约15-30mg/ml(例如25mg/ml)，特别是如果它们将冻干或者如果它们包括由冻干材料重构的材料。在冻干之前，用于冻干的组合物ph可调节到5至8或5.5至7或约6.1。
[0217]
本发明的组合物还可包含一种或多种免疫调节剂。在一些实施方案中，一种或多种免疫调节剂包括佐剂。
[0218]
医学治疗及用途
[0219]
另一方面，本发明提供根据本发明的抗体或其抗原结合片段、根据本发明的核酸分子(或核酸分子的组合)、根据本发明的载体(或载体的组合)、根据本发明的细胞或根据本发明的药物组合物在预防和/或治疗疟疾中；或在(ii)诊断疟疾中的用途。因此，本发明还提供减少疟疾或降低恶性疟原虫感染风险的方法，包括：向有此需要的对象给药治疗有效量的根据本发明的抗体或其抗原结合片段、根据本发明的核酸分子(或核酸分子的组合)、根据本发明的载体(或载体的组合)、根据本发明的细胞或根据本发明的药物组合物。此外，本发明还提供根据本发明的抗体或其抗原结合片段、根据本发明的核酸分子(或核酸分子的组合)、根据本发明的载体或(或载体的组合)、根据本发明的细胞或根据本发明的药物组合物在制备用于预防、治疗或减弱疟疾的药物中的用途。
[0220]
诊断方法可包括将抗体与样品接触。这种样品可从对象中分离，例如从例如鼻道、窦腔、唾液腺、肺、肝、胰腺、肾、耳、眼、胎盘、消化道、心脏、卵巢、垂体、肾上腺、甲状腺、脑、皮肤或血液如血浆或血清中获取的分离组织样品。诊断方法还可包括检测抗原/抗体复合物，特别是在抗体与样品接触之后。这种检测步骤通常在工作台上进行，即与人体或动物体没有任何接触。检测方法的实例是本领域技术人员众所周知的，包括例如elisa(酶联免疫
吸附测定)。
[0221]
疟疾的预防特别是指预防性环境，其中对象未被诊断患有疟疾(未进行诊断或诊断结果为阴性)和/或对象未表现出疟疾症状。相比之下，在治疗环境中，对象通常被诊断患有疟疾和/或表现出疟疾症状。值得注意的是，术语疟疾的“治疗”和“疗法”/“治疗性”包括(完全)治愈以及减轻/减少疟疾和/或相关症状。
附图说明
[0222]
下面将给出附图的简要说明。附图旨在更详细地说明本发明。然而，它们并不旨在以任何方式限制本发明的主题。
[0223]
图1显示了实施例3中对照抗体(a)和抗体mgu10(b)、mgu10v2(c)和mgu10v2_ls(d)的子孢子侵袭/成熟测定的结果，其中每种抗体测试五种稀释度。
[0224]
图2显示了实施例4中对照抗体(a)和抗体mgu10(b)和mgu10v2_ls(c)的子孢子滑行测定的结果，其中每种抗体测试五个稀释度。
[0225]
图3显示了实施例5中对照抗体(a)和抗体mgu10(b)和mgu10v2_ls(c)的子孢子穿越测定的结果，其中每种抗体测试五个稀释度。
[0226]
图4显示了实施例6中抗体mgu10v2_ls(上图)和mgu10_ls(下图)在如所示的两种不同缓冲液中在40℃下的二聚化(二聚体)和聚集(hmw)。
[0227]
图5显示了实施例7在攻击研究中由mgu10抗体赋予的体内保护的结果；具有生物发光(a)和抑制百分比(b)。
[0228]
图6显示了实施例8在攻击研究中由mgh2抗体赋予的体内保护的结果；具有生物发光(a)和抑制百分比(b)。
[0229]
图7显示了实施例9中mgu10v2和mgu10v8与肽nanp(a)和npdp19(b)的结合。
实施例
[0230]
下文中，呈现了说明本发明的各种实施方案和方面的特定实施例。然而，本发明的范围不应受到本文描述的具体实施方案的限制。为使本领域技术人员能够更清楚地理解和实施本发明，给出以下制备方法和实施例。然而，本发明的范围不受示例性实施方案的限制，这些示例性实施方案仅用于说明本发明的单个方面，并且功能等同的方法也在本发明的范围内。实际上，根据前面的描述、附图和下面的实施例，除了本文描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将变得明显。所有这些修改都落入所附权利要求的范围内。
[0231]
实施例1：mgu10和mgh2抗体变体的设计
[0232]
最近，描述了非常有效的抗疟疾抗体，这些抗体对恶性疟原虫环子孢子蛋白(csp)具有特异性(tan j，sack bk，oyen d等人，a public antibody lineage that potently inhibits malaria infection through dual binding to the circumsporozoite protein.nat med.2018；24(4)：401-407.doi：10.1038/nm.4513)。本研究中描述的最有效的双特异性抗体包括抗体“mgu10”和“mgh2”。
[0233]
基于此，本发明人设计了以下mgu10(seq id no：1-8)和mgh2(seq id no：17-27)的变体，其在所述参考抗体的重链和/或轻链中表现出氨基酸突变：
[0234]
1.mgu10变体1(mgu10v1)，其在重链可变区(vh；seq id no：11)的构架区(fr)与mgu10不同；
[0235]
2.mgu10变体2(mgu10v2)，其在重链cdr3(cdrh3：seq id no：12；vh：seq id no：13)中与mgu10不同；
[0236]
3.mgu10变体3(mgu10v3)，其在轻链cdr3(cdrl3：seq id no：14；轻链可变区(vl)：seq id no：15)中与mgu10不同；
[0237]
4.mgu10变体4(mgu10v4)，其代表mgu10v1和mgu10v2的组合，因此在重链cdr3(cdrh3；seq id no：12)和重链fr(vh；seq id no：16)中与mgu10不同；
[0238]
5.mgu10变体5(mgu10v5)，其代表mgu10v1和mgu10v3(包括mgu10v1的vh和mgu10v3的vl)的组合，因此在重链fr(vh；seq id no：11)和cdrl3(cdrl3：seq id no：14；vl：seq id no：15)中与mgu10不同；
[0239]
6.mgu10变体6(mgu10v6)，其代表mgu10v2和mgu10v3的组合(包括mgu10v2的vh和mgu10v3的vl)，因此在cdrh3(cdrh3：seq id no：12；vh：seq id no：13)和cdrl3(cdrl3：seq id no：14；vl：seq id no：15)中与mgu10不同；
[0240]
7.mgu10变体7(mgu10v7)，其代表mgu10v1、mgu10v2和mgu10v3的组合(包括mgu10v4的vh和mgu10v3的vl)，因此在cdrh3(seq id no：12)和重链fr(vh；seq id no：16)和cdrl3(cdrl3：seq id no：14；vl：seq id no：15)中与mgu10不同；和
[0241]
8.mgh2变体1(mgh2v1)，其在轻链cdr3(cdrl3：seq id no：28；vl：seq id no：29)中与mgh2不同。
[0242]
表2中提供了分别与mgu10和mgh2相比，变体的cdr和vh/vl序列的seq id no概述：
[0243]
[0244][0245]
表2.
[0246]
实施例2：本发明的抗体显示出双重特异性
[0247]
tan等人，2018表明，他们研究中最有效的抗体，包括mgu10和mgh2，同时靶向(i)csp的nanp-重复区域，和(ii)csp的n-末端区域中的表位，从而覆盖n-末端结构域和nanp-重复区域之间的连接(tan j，sack bk，oyen d等人，a public antibody lineage that potently inhibits malaria infection through dual binding to the circumsporozoite protein.nat med.2018；24(4)：401-407.doi：10.1038/nm.4513)。此外，这项研究表明，这些抗体的极端效力是由于它们的双重特异性，而仅针对一个csp表位的抗体通常效力较低。
[0248]
因此，产生本发明的抗体并且测试它们的如下能力：结合tan等人，2018描述(i)csp的nanp-重复区域，和(ii)csp的n-末端区域中的两个表位，从而覆盖n-末端结构域和nanp-重复区域之间的连接。
[0249]
为此，制备抗体mgu10v1、mgu10v2、mgu10v3和mgh2v1。即，抗体由genscript合成并且亚克隆到载体中以表达igg1和κ或λ链。将重链和轻链的纯化质粒组合并且用于使用聚乙烯亚胺(在96孔板中微量转染(600μl))转染expi293f细胞(thermofisher scientific)。在第6天收获转染的细胞并且通过离心和过滤收集上清液。
[0250]
将上清液中存在的总igg使用涂有10μg/ml山羊抗人igg(southernbiotech)的96孔maxisorp板(nunc)进行定量。然后将板用含有1％bsa的pbs封闭并且与滴定的单克隆抗体使用认证参考材料470(erms-da470，sigma-aldrich)作为标准一起孵育。然后将板洗涤并且与1/500碱性磷酸酶(ap)偶联的山羊抗人igg(southern biotech)一起孵育。添加底物(磷酸对硝基苯酯(p-npp)，sigma)并且将板在405nm波长下读取以确定光密度(od)值。
[0251]
为了测试与(i)csp的nanp-重复区域，和(ii)csp的n-末端区域的特异性结合，从而覆盖n-末端结构域和nanp-重复区域之间的连接的抗体，将elisa板涂覆10μg/ml亲和素(sigma)。将板用含1％bsa的pbs封闭，并且与1μg/ml生物素化的nanp-肽(seq id no：34)或与1μg/ml生物素化的npdp-肽(seq id no：35)一起孵育。将板洗涤并且用滴定的单克隆抗体孵育，然后用1/500ap偶联的山羊抗人igg(southern biotech)和pnpp底物孵育。计算使用graphpad prism 7软件通过非线性回归分析测试的每个样品的ec
50
(ng/ml)值。
[0252]
mgu10及其变体mgu10v1、mgu10v2和mgu10v3的结果如表3所示，mgh2及其变体mgh2v1的结果如表4所示：
[0253][0254]
表3.
[0255][0256]
表4.
[0257]
出人意料地，与mgh2相比，针对mgu10测试的所有变体都显示出对两个csp表位的结合亲和力增加，而mgh2v1仅显示对nanp-重复区域的结合亲和力增加。
[0258]
实施例3：子孢子侵袭/成熟测定
[0259]
选择变体抗体mgu10v2用于功能测定中的进一步表征。子孢子侵袭/成熟测定是功能性测定，用于测试抗体对子孢子感染性的作用。子孢子侵袭肝细胞并且随后成熟为外红细胞形式是建立疟疾感染的必要步骤。
[0260]
将冷冻保存的人原代肝细胞接种在微量滴定板中并且孵育2天。唾液腺恶性疟原虫nf54子孢子从感染恶性疟原虫的an.stephensi蚊子中分离。对于每个孔，子孢子与连续稀释的抗体样品一起预孵育30分钟，然后转移到肝细胞上。3小时后，将未侵袭的子孢子洗掉，培养细胞4天。将细胞固定并且用抗hsp70和dapi染色。肝细胞核和hsp70阳性形式的数量通过自动高内涵成像进行量化。
[0261]
在该测定中，将变体抗体mgu10v2与亲本抗体mgu10进行比较。此外，测试mgu10v2的fc变体“mgu10v2_ls”，其与变体抗体mgu10v2的不同之处仅在于它在重链恒定区(mgu10v2_ls重链的氨基酸序列：seq id no：100)包含突变m428l和n434s(eu编号)。因此，mgu10v2_ls的可变区与mgu10v2的可变区相同。不相关的抗体用作对照。每个抗体样品测试五个稀释度，每个稀释度重复两次。3sp2/阿托伐醌处理的子孢子用作min对照，载剂处理的子孢子用作max对照。
[0262]
数据表示为肝细胞核总数、hsp70阳性形式总数、感染的肝细胞％。使用四参数非线性回归模型使用最小二乘法来估计ic
50
值以找到最佳拟合。结果值(以μg/ml表示)列于下表5中：
[0263]
抗体ic50(μg/ml)mgu100.418mgu10v20.302mgu10v2_ls0.179control＞10
[0264]
表5.
[0265]
结果的图示显示在图1中。除对照抗体外，所有抗体都在功能上阻断人原代肝细胞中肝期裂殖体的发育。有趣的是，变体抗体mgu10v2比亲本抗体mgu10更有效，并且另外的fc变体mgu10v2_ls最有效。
[0266]
实施例4：子孢子滑行测定
[0267]
子孢子滑行测定是功能性测定，其中可评估化合物对子孢子滑行运动的作用。疟原虫子孢子通过传染性蚊子的叮咬传播至其脊椎动物宿主的皮肤中。子孢子运动是寄生虫传播和成功感染脊椎动物宿主的关键先决条件。运动性构成可抑制的第一寄生虫机制，因此对于干预策略很感兴趣。
[0268]
将板用抗csp mab 3sp2涂覆以捕获脱落的csp(环状子孢子蛋白)。从感染有恶性疟原虫的an.stephensi蚊子中分离出新鲜的唾液腺子孢子，并且将其与连续稀释的样品(5次稀释/样品)一起预孵育30分钟，然后转移至3sp2涂覆的孔中。90分钟后，将子孢子洗掉，将滑行轨迹固定并且用生物素化的抗csp抗体染色，然后用链霉亲和素-af555染色。将滑行轨迹由自动高内涵成像捕获，并且将总滑行轨迹长度使用机器学习算法进行分析。
[0269]
在该测定中，将变体抗体mgu10v2_ls与亲本抗体mgu10进行比较。不相关的抗体用作对照。每个抗体样品测试五个稀释度，其中每个稀释度重复两次。3sp2/短杆菌肽处理的子孢子被用作min对照，载剂处理的子孢子被用作max对照。
[0270]
将总滑行轨迹通过图像分析量化并且报告为相对荧光计数。使用四参数非线性回归模型使用最小二乘法来估计ic
50
值以找到最佳拟合。结果值(以μg/ml表示)列于下表6中：
[0271]
抗体ic50(μg/ml)mgu100.975mgu10v2_ls0.748对照＞10
[0272]
表6.
[0273]
结果的图示显示在图2中。抗体mgu10和mgu10v2_ls而非对照抗体功能性阻断恶性
疟原虫子孢子的滑行运动。变体抗体mgu10v2_ls比亲本抗体mgu10更有效。
[0274]
实施例5：子孢子穿越测定
[0275]
疟原虫子孢子沉积在脊椎动物宿主的皮肤中。当子孢子向肝脏移动时，它们可进入和离开瞬时液泡内的宿主细胞，这一过程称为细胞穿越。穿越允许子孢子穿过细胞屏障并且逃避宿主免疫反应，从而代表成功感染脊椎动物宿主的关键先决条件。子孢子穿越测定是功能性测定，其中可评估化合物对子孢子细胞穿越的作用。
[0276]
将人肝癌(hc-o4)细胞接种在微量滴定板中并且生长至接近融合。新鲜的恶性疟原虫唾液腺子孢子是从an.stephensi蚊子中分离出来的并且在添加罗丹明-葡聚糖之前用稀释的igg预孵育30分钟。在37℃下孵育1小时后，用dapi染色细胞核。将穿越细胞的荧光水平使用高内涵自动成像仪进行量化。
[0277]
在该测定中，将变体抗体mgu10v2_ls与亲本抗体mgu10进行比较。不相关的抗体用作对照。每个抗体样品测试五个稀释度，其中每个稀释度重复两次。3sp2/细胞松弛素d处理的子孢子被用作min对照，并且载剂处理的子孢子被用作max对照。
[0278]
数据表示为相对于测定板的min和max对照的穿越细胞％。使用四参数非线性回归模型使用最小二乘法来估ic
50
值以找到最佳拟合。结果值(以μg/ml表示)列于下表7中：
[0279]
抗体ic50(μg/ml)mgu101.928mgu10v2_ls1.356对照＞10
[0280]
表7.
[0281]
结果的图示显示在图3中。抗体mgu10和mgu10v2_ls而非对照抗体功能性地阻断恶性疟原虫子孢子的穿越。变体抗体mgu10v2_ls比亲本抗体mgu10更有效。
[0282]
实施例6：抗体的稳定性
[0283]
为了测试它们的稳定性，将变体抗体mgu10v2_ls与其亲本mgu10_ls进行比较。mgu10_ls与亲本抗体mgu10的不同之处仅在于它在重链恒定区(mgu10_ls重链的氨基酸序列：seq id no：101)包含突变m428l和n434s(eu编号)。因此，mgu10_l的可变区与mgu10的可变区相同。变体抗体mgu10v2_ls及其亲本mgu10_ls在不同条件下暴露于热应激。
[0284]
为此，将变体抗体mgu10v2_ls及其亲本mgu10_ls在40℃下在ph为5.6的醋酸钠缓冲液中孵育两周。通过尺寸排阻色谱评估聚集体和二聚体(高分子量和低分子量种类)的形成。结果如下表8所示：
[0285]
[0286]
表8.hmws：高分子量物质，表示聚集；lmws：低分子量物质，表示二聚体形成；％单体表示非二聚化或聚集的抗体。
[0287]
为了进一步评估mab mgu10的稳定性和聚集，在具有不同ph值的两种不同缓冲液中测试亲本和开发的mab。为了比较不同缓冲液中mab的二聚化和聚集，在纯化后将mab批次的缓冲液更换为50mm醋酸钠、50mm nacl、ph 5.5或20mm柠檬酸钠、50mm nacl，ph 6.0。使用beh450 sec蛋白质标准混合物5组分蛋白质混合物(甲状腺球蛋白、igg、bsa、肌红蛋白、尿嘧啶)进行大小计算，使用尺寸排阻色谱法评估mab物种在40℃下4天和15天后的分子量。
[0288]
结果如图4所示。变体抗体mgu10v2_ls在40℃下在50mm醋酸钠/50mm nacl缓冲液、ph 5.5中保持两周时，与其亲本mgu10_ls相比，形成的高分子量物种较少(较少的聚集体)。因此，与亲本抗体相比，变体抗体mgu10v2_ls显示出增加的稳定性。
[0289]
实施例7：变异抗体mgu10v2赋予的体内保护——攻击研究
[0290]
为了评估对表达全长恶性疟原虫csp的伯氏疟原虫嵌合寄生虫的体内保护作用，将c57bl/6小鼠(n＝5只/组)静脉注射54.5μg/小鼠变异抗体mgu10v2_ls或100μg/小鼠各自的亲本抗体mgu10_ls。作为阴性对照，使用不相关的抗体ab-1245(100μg/小鼠)。注射抗体后48小时，将抗体处理的小鼠以及另一组原始小鼠(n＝5)接受2x103个嵌合伯氏疟原虫子孢子的攻击，表达通过静脉注射的全长恶性疟原虫csp。攻击后42小时，将小鼠注射100μl d-荧光素(30mg/ml)，用异氟醚麻醉并且用ivis光谱成像以测量嵌合寄生虫表达的生物发光。计算与原始组(代表100％感染)相比的抑制％。
[0291]
结果如图5所示。与不相关的对照抗体ab-1245相比，变体抗体mgu10v2_ls和各自的亲本抗体mgu10_ls均显著抑制体内寄生虫感染，分别为80.76％抑制(mgu10v2_ls)和69.60％抑制(mgu10_ls)。因此，与其亲本抗体mgu10_ls相比，变体抗体mgu10v2_ls实现更强的感染抑制。
[0292]
实施例8：变异抗体mgh2v1赋予的体内保护——攻击研究
[0293]
为了评估对表达全长恶性疟原虫csp的伯氏疟原虫嵌合寄生虫的体内保护作用，将c57bl/6小鼠(n＝5只/组)静脉注射100μg/小鼠的变异抗体mgh2v1_ls或各自的亲本抗体mgh2_ls。fc变体mgh2v1_ls和mgh2_ls分别与mgh2v1和mgh2的不同之处仅在fc区的两个突变，即保持各自的可变区。即，变体抗体mgh2v1_l与变体抗体mgh2v1的不同之处仅在于它在重链恒定区(mgh2v1_ls重链的氨基酸序列：seq id no：102)中包含突变m428l和n434s(eu编号)。因此，抗体mgh2_ls与抗体mgh2的不同之处仅在于它在重链恒定区(mgh2_ls重链的氨基酸序列：seq id no：102)中包含突变m428l和n434s(eu编号)。由于变异抗体mgh2v与亲本抗体mgh2的不同之处仅在于轻链cdr3(vl)，因此mgh2_ls和mgh2v1_ls的重链氨基酸序列相同。
[0294]
作为阴性对照，使用不相关的抗体ab-1245(100μg/小鼠)。射抗体注后48小时，抗体处理的小鼠以及另一组原始小鼠(n＝5)接受2x103个嵌合伯氏疟原虫子孢子的攻击，表达通过静脉注射注射的全长恶性疟原虫csp，如实施例7中所述。攻击后42小时，将小鼠注射有100μl d-荧光素(30mg/ml)，用异氟醚麻醉并且用ivis光谱成像以测量嵌合寄生虫表达的生物发光。计算与原始组(代表100％感染)相比的抑制％。
[0295]
结果如图6所示。与不相关的对照抗体ab-1245相比，变体抗体mgh2v1_ls和各自的亲本抗体mgh2_ls抑制体内寄生虫感染，分别为38.62％抑制(mgh2v1_ls)和25.23％抑制
(mgh2_ls)。因此，与其亲本抗体mgh2v1_ls相比，变体抗体mgh2v1_ls实现更强的感染抑制。
[0296]
实施例9：mgu10/mgu10v2的其他变体的设计和测试
[0297]
如上文实施例6中所示，与mgu10不同之处在于突变d106e的mgu10v2显示出增加的稳定性。不受任何理论的束缚，本发明人认为突变d106e去除异构化基序，从而增加抗体mgu10v2的稳定性，如实施例6中所示。
[0298]
鉴于此，设计mgu10的其他变体，其中与mgu10v2相比，在mgu10v2的重链(vh)框架区中引入另外的突变d97e，以便去除其他异构化基序(以进一步增加抗体的稳定性和可制造性)。因此，mgu10v8包含与mgu10v2相同的cdr序列；和与mgu10v2及其亲本抗体mgu10相同的vl序列。mgu10v8的vh包含如seq id no：104所示的氨基酸序列。seq id no：106提供编码mghv8vh的示例性核苷酸序列。
[0299]
新的变体抗体mgu10v8基本上如实施例2中所述，使用expicho细胞(更大体积，例如25ml或100ml或更多)表达，并且结合(i)csp的nanp-重复区域(“nanp
”‑
肽)，和(ii)csp的n-末端区域，从而覆盖n-末端结构域和nanp-重复区域(“npdp
”‑
肽)之间的连接，并且在elisa中进行测试。为此，使用pierce
tm
链霉亲和素涂覆板(life technologies)涂覆生物素化的nanp-肽(n-末端生物素化；seq id no：34)或生物素化的npdp19-肽(n-末端生物素化；seq id no：105)，各自以5μg/ml在封闭缓冲液(pbs，1％bsa)中。在添加滴定的抗体mgu10v2或mgu10v8之前在室温下将板洗涤(pbs，0.05％吐温20)90分钟。在另一洗涤步骤之后，以0.8μg/ml添加二抗山羊抗人igg hrp f(ab’)2片段，对fcg特异性(jackson immunoresearch)。sure blue tmb(bioconcept)用于显色，其用1％hcl水溶液终止。使用elisa阅读器elx808iu(biotek)检测450nm处的光密度。
[0300]
结果如图7所示。如图7所示，与nanp和npdp19这两种肽的结合在变体抗体mgu10v2和mgu10v8中非常相似。
[0301]
序列表和序列id号(序列表)：
[0302]
[0303]
[0304]
[0305]
[0306]
[0307]
[0308]
[0309]
[0310]
[0311]
[0312]
[0313][0314]
[0315]
[0316]
[0317]
[0318]
[0319]
[0320]
[0321]
[0322]
[0323]