重组疱疹病毒载体的制作方法

1.相关申请的引用
2.本技术要求于2019年5月30日提交的第62/854,637号和于2019年7月11日提交的第62/873,094号美国临时专利申请的申请日权益，上述各申请的全部内容在此以引用的方式并入本文。


背景技术：

3.使用与重组单纯疱疹病毒1型(rhsv)载体共感染的重组腺相关病毒(raav)载体生产是非常有效产生大量raav颗粒的方法(conway等人,gene therapy 6:986-993,1999；booth等人,gene therapy 11:829-837,2004；adamson-small等人,mol.ther.med.clin.dev.3:16031,2016)。所述生产方法依赖hsv在aav生命周期中所扮演的角色，即作为辅助病毒以在允许细胞中复制。因此，rhsv病毒既可作为辅助，也可作为穿梭子(shuttle)，将支持aav基因组复制和包装所需的aav功能递送给生产细胞。
4.用于此系统的一些rhsv载体是由hsv 1型病毒d27-1的复制缺陷变体所改造的，所述病毒在编码病毒的感染细胞蛋白27(infected cell protein 27)或icp27的基因中有1.6kb的缺失(rice and knipe,j.virol.64:1704-1715,1990)。icp27是具有512个氨基酸的蛋白质，也根据其分子量而称为立即早期63(immediate early 63，ie63)或病毒分子量63(viral molecular weight 63，vmw63)蛋白，或根据其在hsv-1基因组上的位置而称为独特长54(unique long 54，ul54)基因。icp27是在感染hsv-1的细胞中最早表达的蛋白质之一，其对于细胞培养中的病毒复制绝对必不可少。在没有icp27的情况下，rhsv基因组不能复制，除非icp27以反式(trans)方式提供，例如，通过v27细胞，一种vero细胞衍生物，其以包含ul54和部分ul55基因的2.4kb bamhi-hpai片段稳定转化以表达icp27(rice and knipe,j.virol.64:1704-1715,1990)。其他报道的icp27补充细胞系是vero衍生的2-2细胞和bhk21衍生的b130细胞，两者都以2.4kb bamhi-ssti片段稳定转化，也包含ul54和部分ul55基因(smith等人virology 186:74-86,1992；howard等人gene therapy 5:1137-1147,1998)。
5.v27是目前唯一用于大规模制造用于raav生产的rhsv原液的细胞系(penaud-budloo等人,mol.ther.:med.&clin.dev.8:166-180,2018)。rhsv原液通过在烧瓶中，或者，使用微载体在悬浮液中感染单层v27细胞而制备。所得的rhsv原液在3至4天后收获并浓缩(knop and harell,biotechnol.prog.23:715-721,2007；adamson-small等人,mol.ther.med.clin.dev.3:16031,2016)。
6.然而，每当复制缺陷病毒载体于辅助细胞系中增殖，最终的原液将包含病毒亚群，其通过病毒基因组与细胞基因组中存在的整合病毒基因之间的同源重组(homologous recombination，hr)过程而获得复制能力，此在腺病毒(ad)载体的生产期间也观察得到，其中e1基因缺失的ad载体基因组与293细胞中整合的e1序列之间的同源重组经常造成复制型ads(rca)，污染了e1载体的原液(hehir等人,journal of virology.70:8459-8467,1996)。
在v27细胞中使用目前的d27-1重组hsv(rhsv)载体的制造过程也不例外，也会导致rhsv批次的“野生型”样复制型hsv(replication-competent hsv，rchsv)污染的产生。
7.具体的说，复制型hsv(rchsv)或icp27回复体，可能在v27中扩增rhsv的期间通过同源重组出现(ye等人,hum.gene ther.clin.dev.25:212-217,2014)。rhsv原液中已显示低水平的rchsv，据报道，每3
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108rhsv pfu中少于1pfu(penaud-budloo等人,mol.ther.:med.&clin.dev.8:166-180,2018)。
8.然而，任何rchsv病毒在表型上表现得与野生型病毒一样，将对复制缺陷原液的治疗用途造成严重问题，因为hsv-1有可能使病毒复制不受控制，且由于病毒在脑中传播而有可能引起致残形式的脑炎(asenbauer等人,neuropediatrics 29:120-123,1998；gurses等人,annals of tropical paediatrics.16:173-175,1996；yamada等人journal of neurology,neurosurgery&psychiatry 74:262-264,2003)。
9.因此，需要改善现有利用d27-1 rhsv载体的rhsv生产过程。


技术实现要素：

10.本文描述的载体提供新rhsv载体，相比于现有的d27-1 icp27缺失，其骨架中有更大、相对完整的icp27基因缺失，且避免在rhsv生产细胞系中使用基于d27-1的互补系统生产rhsv的期间所产生的rchsv污染。实际上，源自疱疹病毒(herpesvirales)目的其他病毒中的相似病毒载体也是本发明的一部分。
11.本文描述的发明也提供可引入合适的病毒载体(例如rhsv)生产细胞系的重组载体，其中所述重组载体提供必要的icp27编码序列，用于在宿主细胞中增殖本发明的病毒(例如rhsv)载体。在某些具体例中，重组载体(其可整合到病毒生产细胞系的基因组中)的icp27编码序列很少或没有重叠，且主题病毒(例如rhsv)载体具有更大、相对完整的icp27基因缺失。
12.本发明还提供包括所述重组载体的宿主细胞。
13.本发明还提供增殖/扩增/生产所指病毒载体(例如rhsv载体)的方法。
14.本发明还提供使用所指病毒载体(诸如rhsv)生产重组腺相关病毒(raav)的方法。
15.因此，本发明的一方面提供一种源自疱疹病毒目的重组复制缺陷病毒，其中，所述病毒的特征在于编码icp27的基因或其功能等效基因的缺失，其中所述缺失的长度至少为1,200bp，且留下不超过300bp、250bp、200bp、150bp、100bp、50bp、30bp、20bp、10bp、9bp、8bp、7bp、6bp、5bp、4bp、3bp、2bp、1bp或0bp的所述编码icp27的基因(例如seq id no:11)或其功能等效基因的最3
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末端。
16.在某些具体例中，所述重组复制缺陷病毒源自疱疹病毒目的非临床或实验室病毒。
17.在某些具体例中，所述缺失包括编码icp27的基因或其功能等效基因的整个编码序列(或orf)或主要由其所组成或由其所组成。
18.在某些具体例中，所述缺失还包括所述编码icp27的基因或其功能等效基因的整个启动子区域，或所述启动子区域的一部份(例如最3’端约400个核苷酸)。
19.在某些具体例中，所述编码icp27的基因具有seq id no:11的多核苷酸序列。
20.在某些具体例中，所述病毒源自异疱疹病毒(alloherpesviridae)科或软体动物
疱疹病毒(malacoherpesviridae)科。
21.在某些具体例中，所述病毒源自疱疹病毒科。
22.在某些具体例中，所述病毒源自甲型疱疹病毒(alphaherpesvirinae)亚科、乙型疱疹病毒(betaherpesvirinae)亚科或丙型疱疹病毒(gammaherpesvirinae)亚科。
23.在某些具体例中，所述病毒源自hhv-1(单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)-1或hsv-1)、hhv-2(单纯疱疹病毒-2或hsv-2)、hhv-3(水痘带状疱疹病毒(varicella zoster virus)或vzv)、hhv-4(eb病毒(epstein-barr virus)或ebv)、hhv-5(巨细胞病毒(cytomegalovirus)或cmv)、hhv-6a/hhv-6b(玫瑰疱疹病毒属(roseolovirus)，嗜淋巴疱疹病毒(herpes lymphotropic virus))、hhv-7或hhv-8(卡波西肉瘤相关疱疹病毒(kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus)或kshv)。
24.在某些具体例中，所述病毒源自猕猴疱疹病毒-1(cehv-1)或鼠疱疹病毒68(mhv-68或muhv-4)。
25.在某些具体例中，所述病毒源自猪甲型疱疹病毒，包含伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，prv)。
26.在某些具体例中，所述病毒源自单纯疱疹病毒属，诸如侏猴疱疹病毒1型、蜘蛛猴疱疹病毒、猪疱疹病毒、牛疱疹病毒2型、猕猴疱疹病毒1型(疱疹b病毒)、果蝠α疱疹病毒1型、兔疱疹病毒4型、恒河猴疱疹病毒1型、小袋鼠疱疹病毒2型和狒狒疱疹病毒2型。
27.在某些具体例中，所述病毒源自水痘病毒属，诸如牛疱疹病毒1型、牛疱疹病毒5型、水牛疱疹病毒1型、山羊疱疹病毒1型、犬疱疹病毒1型、猕猴疱疹病毒9型、鹿疱疹病毒1型、鹿疱疹病毒2型、麋鹿疱疹病毒1型、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒3型、马疱疹病毒4型、马疱疹病毒8型、马疱疹病毒9型、猫疱疹病毒1型和猪源疱疹病毒1型(suid herpesvirus 1)。
28.在某些具体例中，所述病毒源自马利克病毒属，诸如鸭疱疹病毒1型、鸽疱疹病毒1型、鸡疱疹病毒2型、鸡疱疹病毒3型(gahv-3或mdv-2)、火鸡疱疹病毒1型(hvt)和孔雀疱疹病毒1型。
29.在某些具体例中，所述病毒源自传染性喉气管炎病毒属，诸如鸡疱疹病毒1型和鹦鹉疱疹病毒1型。
30.在某些具体例中，所述病毒源自爬行动物甲型疱疹病毒，诸如赤蠵龟疱疹病毒、海龟疱疹病毒1型、海龟疱疹病毒2型、海龟疱疹病毒3型、海龟疱疹病毒4型、绿蠵龟疱疹病毒、库伯疱疹病毒、水龟疱疹病毒1型、水龟疱疹病毒2型、纤维乳头状瘤相关疱疹病毒、盾蜥疱疹病毒1型、盾蜥疱疹病毒2型、盾蜥疱疹病毒3型、木雕龟疱疹病毒1型、木雕龟疱疹病毒2型、鬣蜥疱疹病毒1型、鬣蜥疱疹病毒2型、蠵龟口皮疱疹病毒、肺-眼-气管疱疹病毒、侧颈龟疱疹病毒1型、红耳龟疱疹病毒、箱龟疱疹病毒1型、箱龟疱疹病毒2型、陆龟疱疹病毒1型、陆龟疱疹病毒2型、陆龟疱疹病毒3型、陆龟疱疹病毒4型和巨蜥疱疹病毒1型。
31.在某些具体例中，所述病毒源自蛛猴疱疹病毒属，诸如狷羚疱疹病毒1型、狷羚疱疹病毒2型、侏猴疱疹病毒2型、牛疱疹病毒4型、猕猴疱疹病毒17型、马疱疹病毒2型、马疱疹病毒5型、马疱疹病毒7型、日本猕猴疱疹病毒、兔疱疹病毒1型和鼠疱疹病毒4型(鼠类丙型疱疹病毒-68或mhv-68)。
32.在某些具体例中，所述病毒为实验室hsv-1株，诸如kos、kos 1.1、kos 1.1a、kos63、kos79、mckrae、第17株、f17、mcintyre或其他。
33.在某些具体例中，所述其功能等效基因为kshv的orf57、ebv的mta/sm/eb2、人cmv的ul69或疱疹病毒目的任何病毒的其他等效基因。
34.在某些具体例中，本发明的重组复制缺陷病毒还包括aav rep和cap蛋白的编码序列和/或两侧为aav itr序列的目的基因(gene of interest，goi)。
35.在某些具体例中，所述aav rep和cap蛋白的编码序列和/或所述两侧为aav itr序列的目的基因(goi)整合到或替换病毒的非必需基因(例如无需用于病毒复制和无需用于病毒包装)。
36.本发明的另一方面提供一种能够在宿主细胞中表达icp27或其功能等效物的重组载体，所述载体包括：(1)所述icp27或其功能等效物的编码序列，其可操作地连接至能够导向所述编码序列在宿主细胞中转录的启动子；(2)所述编码序列3’端的多腺苷酸化位点；和(3)任选地，一个或多个多克隆位点；其中，所述载体包含不超过本发明的任一病毒的300bp、250bp、200bp、150bp、100bp、50bp、30bp、20bp、10bp、9bp、8bp、7bp或6bp的连续核苷酸。
37.在某些具体例中，所述icp27具有seq id no:10的氨基酸序列，或与seq id no:10至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.2％、99.4％、99.6％或99.8％相同。
38.在某些具体例中，所述启动子包括至少400个多核苷酸。
39.在某些具体例中，所述启动子包括seq id no:11的第1至538位核苷酸、seq id no:11的第127至538位核苷酸、基因库登录号kt887224的第113,139至113,550位核苷酸或基因库登录号kt887224的第113,013至113,550位核苷酸。
40.在某些具体例中，所述编码序列经过部分或完全密码子优化，以在哺乳动物宿主细胞中表达。
41.在某些具体例中，所述编码序列的最3’端的300至350个核苷酸经过密码子优化，以在哺乳动物宿主细胞中表达。
42.在某些具体例中，所述多腺苷酸化位点为牛生长激素(bgh)多腺苷酸化位点。
43.在某些具体例中，所述icp27的编码序列包括降低宿主细胞的前mrna剪接抑制，同时允许hsv晚期基因表达的突变。
44.在某些具体例中，所述突变为vbs3.3双突变、vbs4.3双突变或vbs5.3双突变。
45.本发明的另一方面提供一种包括本发明的重组载体的宿主细胞，其中所述宿主细胞能够表达icp27或其功能等效物。
46.在相关方面，本发明提供表达(例如组成型或诱导型表达)功能性icp27蛋白的病毒生产/包装细胞系，其中所述功能性icp27蛋白的编码序列与具有完整icp27基因缺失的所指rhsv载体具有很少(例如至多10、5、3、2、1bp重叠)或没有序列重叠。
47.在某些具体例中，所述功能性icp27蛋白的编码序列在编码序列的3’末端具有密码子优化区域，以使同一区域的与野生型icp27编码序列的序列同源性最小化。举例来说，广泛使用的d27-1 hsv-1载体在缺失的3’末端包含未缺失的icp27基因的一部分，所述未缺失的icp27基因序列可能与主题宿主细胞/病毒包装细胞系/病毒生产细胞系中的icp27编码序列重叠。通过利用冗余遗传密码，在此重叠区域的主题功能性icp27的编码序列可进行密码子优化，以保留被编码的氨基酸序列，同时将此区域在核酸层级上的序列同源性降低
至66％或更低，以阻碍重组。
48.在某些具体例中，所述重组载体稳定地整合到所述宿主细胞的基因组。
49.在某些具体例中，所述宿主细胞源自脊椎动物，诸如人、猴、牛、猪、马和其他马科动物、犬、猫、绵羊、山羊、鼠、大鼠、兔、貂、负鼠、骆驼和其他骆驼科动物、鸡和其他禽类、犰狳、青蛙、爬行动物或源自昆虫细胞。代表性细胞包含bhk细胞、vero细胞、hek293细胞和其他。
50.本发明的另一方面提供一种增殖/扩增/生产本发明的重组复制缺陷病毒的方法，所述方法包括以本发明的重组复制缺陷病毒感染本发明的宿主细胞。
51.在某些具体例中，所述方法还包括从被感染的本发明的宿主细胞中收获本发明的重组复制缺陷病毒。
52.在某些具体例中，本发明的重组复制缺陷病毒与所述icp27或其功能等效物的编码序列之间不超过300bp、250bp、200bp、150bp、100bp、50bp、30bp、20bp、10bp、9bp、8bp、7bp、6bp、5bp、4bp、3bp或2bp的序列重叠。
53.本发明的另一方面提供一种生产重组腺相关病毒(raav)的方法，所述raav包括两侧为aav itr序列的目的基因(goi)编码序列，所述方法包括以本发明的包括aav rep和cap蛋白的编码序列的第一重组复制缺陷病毒与本发明的包括两侧为aav itr序列的目的基因(goi)的第二重组复制缺陷病毒共感染生产宿主细胞。
54.本发明的另一方面提供一种生产重组腺相关病毒(raav)的方法，所述raav包括两侧为aav itr序列的目的基因(goi)编码序列，所述方法包括以本发明的包括aav rep和cap蛋白的编码序列的重组复制缺陷病毒感染生产宿主细胞，其中，所述生产宿主细胞(1)包括具有所述两侧为aav itr序列的goi编码序列的整合aav原病毒；(2)被具有所述两侧为aav itr序列的goi编码序列的载体(例如质粒)转染；或(3)被具有所述两侧为aav itr序列的goi编码序列的raav共感染。
55.在某些具体例中，所述生产细胞系为bhk、vero或hek293。
56.在某些具体例中，所述goi为肌萎缩蛋白的功能等效物(例如编码功能性微肌萎缩蛋白的肌萎缩蛋白小基因)。
57.在某些具体例中，所述aav的趋向性(tropism)包含血清型，诸如aav1、aav2、aav6、aav7、aav8或aav9、aav10、aav11，优选为aav9。在某些具体例中，aav衣壳可被遗传性修饰，或所述衣壳是合成的、设计的衣壳，其增强goi向特定组织(诸如肌肉、骨骼肌、心肌、平滑肌等)的组织特异性或生理性隔室递送。在某些具体例中，aav的趋向性通过假型或不同病毒血清型的衣壳和基因组的混合来改变，以改善转导效率以及改变的趋向性。示例性假型aav包含靶向成肌细胞的aav2/5或aav2/6。在某些具体例中，计算机衍生的序列是从头合成的，且以临床应用相关的生物学特性为特征。
58.在某些具体例中，所述目的基因(goi)包含负责/缺陷的lgmd2e(肢带型肌营养不良症2e型)、lgmd2d(肢带型肌营养不良症2d型)、lgmd2c(肢带型肌营养不良症2c型)、lgmd2b(肢带型肌营养不良症2b型)、lgmd2l(肢带型肌营养不良症2l型)、lgmd2i(肢带型肌营养不良症2i型)的基因或下述者的基因或编码序列：naglu(α-n-乙酰葡糖胺糖苷酶，导致圣菲利波综合征(sanfilippo syndrome)或黏多糖贮积症iiib型(mps iiib))、磺酰胺酶或sgsh(导致黏多糖贮积症iiia型或mps iiia)、因子ix、因子viii、肌管蛋白1(mtm1)、运动神
经元存活(survival of motor neuron，smn，导致脊髓性肌萎缩或sma)、galnac转移酶galgt2、钙蛋白酶3(capn-3)、酸性α-葡糖苷酶(gaa，导致庞贝氏症)、α-半乳糖苷酶a或gla(导致法布里病)、葡糖脑苷脂酶、肌萎缩蛋白或微肌萎缩蛋白。
59.在某些具体例中，所述goi为微肌萎缩蛋白基因。
60.在某些具体例中，所述微肌萎缩蛋白基因为us7,906,111、us7,001,761、us7,510,867、us6,869,777、us8,501,920、us7,892,824、pct/us2016/013733或us10,166,272中所描述的一者。
61.在某些具体例中，所述微肌萎缩蛋白基因包括全长肌萎缩蛋白的r16和r17血影蛋白样重复序列的编码序列(诸如us7,892,824中所描述的一者)。
62.在某些具体例中，所述微肌萎缩蛋白基因包括全长肌萎缩蛋白的r1、r16、r17、r23和r24血影蛋白样重复序列的编码序列(诸如pct/us2016/013733所描述的微肌萎缩蛋白基因)。
63.本发明的另一方面提供一种治疗有其需要的受试者的肌营养不良症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的编码微肌萎缩蛋白基因的重组aav(raav)载体，其中，所述raav通过本发明的方法生产。
64.在某些具体例中，所述方法还包括在向所述受试者施用所述raav前，通过本发明的方法生产所述raav。
65.本发明的另一方面提供一种制造源自疱疹病毒目的重组复制缺陷病毒的方法，其中，所述病毒的特征在于编码icp27的基因或其功能等效基因的缺失，其中所述缺失的长度至少为1,200bp，且留下不超过300bp、250bp、200bp、150bp、100bp、50bp、30bp、20bp、10bp、9bp、8bp、7bp、6bp、5bp、4bp、3bp、2bp、1bp或0bp的所述编码icp27的基因(例如seq id no:11)或其功能等效基因的最3
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末端，所述方法包括通过合适的宿主细胞中的同源重组创造所述编码icp27的基因或其功能等效基因的所述缺失。
66.在某些具体例中，所述同源重组通过使用细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，bac)进行，所述细菌人工染色体包含所述源自疱疹病毒目的病毒的基因组(例如hsv基因组)，其具有所述编码icp27的基因或其功能等效基因。
67.在某些具体例中，所述宿主细胞为大肠杆菌或真核细胞，诸如酵母菌、昆虫细胞(例如sf9)或哺乳动物细胞。所述哺乳动物细胞可为vero细胞、幼地鼠肾(bhk)细胞、hela细胞、人肺成纤维细胞mrc-5、人包皮成纤维细胞(hff)、人胚胎成纤维细胞(helf)、马-达二氏犬肾细胞(mdck)、马-达二氏牛肾细胞(mdbk)或其他。
68.本发明的另一方面提供一种产生icp27缺失的hsv载体的方法，在所述hsv载体的tk基因座包括aav rep/cap表达盒或两侧为aav itr序列的目的基因(goi，诸如肌萎缩蛋白小基因)，所述方法包括：(1)在供体dna上，通过同源重组将galk选择性标志插入aav rep/cap表达盒或两侧为aav itr序列的goi，以分别产生galk标志的aav rep/cap表达盒或galk标志的goi；(2)通过同源重组和galk阳性选择，将galk标记的aav rep/cap表达盒或galk标记的goi分别插入icp27缺失的hsv载体的tk基因座；(3)通过同源重组和galk阴性选择，从icp27缺失的hsv载体中分别去除galk标记的aav rep/cap表达盒或galk标记的goi中的galk选择性标志。
69.应理解，除非不适当或明确否认，否则本发明的任一具体例，包含仅在实施例、权
利要求书或其中一小节中所描述者，可以与任何其他一个或多个具体例组合。
附图说明
70.图1：bhk21细胞以0.1moi的d27-1 rhsv感染，接着以2.5μg的相应质粒转染，所述质粒带有seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5或无关的gfp质粒对照序列。转染24小时后，以pbs洗涤细胞，并在每个孔中加入新培养基。感染72小时后，从每个孔中收集细胞上清液，并通过对v27细胞单层的噬斑测定来确定rhsv滴度。lod：检测极限(limit of detection)。
71.图2：bhk-27克隆以0.1moi的d27-1 rhsv感染。感染72小时后，从每个孔中收集细胞上清液，并通过对v27细胞单层的噬斑测定来确定rhsv滴度。lod：检测极限(limit of detection)。
72.图3和图4显示基于如实施例1和实施例8所描述的噬斑测定，具有icp27(ul54)基因2.1kb(2,077bp)完整缺失而没有rchsv污染的rhsv病毒的稳健生产。显然的，如v27细胞上大量的噬斑所证明，具有icp27基因完整缺失的主题rhsv载体(图3中的克隆3和图4中的克隆4)生产出高滴度rhsv，且如vero细胞上不存在噬斑所证明，基本上没有rchsv污染。
73.图5显示vero mw75亚克隆在δ27hsv病毒ddpcr滴度方面为顶尖。
74.图6显示v75亚克隆#4、#20和#24的δ27hsv病毒噬斑滴度(pfu/ml)。
75.图7显示当在主题v75.4细胞中增殖时，相比于具有不完整icp27缺失的对照hsv载体(δ27hsv)，具有完整icp27缺失的主题hsv载体(slb27)有较高滴度。
76.图8显示意外的合胞噬斑形成在几乎所有被具有完整icp27缺失的主题hsv载体感染的测试的v75.4培养物的p6中，而在具有部分icp27缺失的传统hsv载体d27-1中没有观察到合胞噬斑形成。
77.图9显示在bhk生产细胞中，相比于对照hsv载体(δ27hsv)，主题hsv载体(slb27)有较高aav9-dys滴度。
具体实施方式
78.1、概述
79.目前基于d27-1 rhsv-v27的载体-宿主细胞系统在d27-1病毒中的序列和整合到补充v27细胞中的hsv-1序列之间有815个核苷酸重叠。相似或更大尺寸的重叠也存在于其他icp27缺失病毒和相似的补充细胞中，即2-2细胞或b130细胞。这种815个核苷酸或更大的重叠使得icp27缺失病毒中的序列与整合到icp27补充细胞中的hsv-1序列之间发生同源重组，导致在icp27缺失病毒的原液中出现野生型样复制型的污染病毒。然后这些原液也在应限制icp27缺失病毒增殖的非补充细胞上生长，此通过增加的病毒原液的细胞毒性和在非补充细胞上产生病毒噬斑观察而得。通过去除创造这些重叠的区域，本发明的rhsv载体和方法可以减轻这些不良影响。
80.本技术人设计出编码icp27表达盒的多个dna编码序列，用于产生于新的icp27补充细胞系，有利于hsv-1 icp27缺失病毒突变体的生长和增殖。这种表达盒可用于贴壁vero细胞、贴壁bhk细胞、以及无血清悬浮液适应型bhk细胞系或任何其他支持hsv复制的细胞系。当这些生产细胞用于rhsv生产时，相比于目前使用的基于d27-1 rhsv-v27的载体-宿主
细胞系统增殖rhsv，产生具有复制型rchsv的可能性将显著降低(如果不为零)。尽管不希望受限于任何特定理论，但据信本发明部分建立在病毒基因组与存在于icp27补充细胞系(诸如新的贴壁无血清vero或无血清悬浮液适应型bhk细胞系)基因组中的整合icp27基因之间的较小(或无)序列同源区或重叠。
81.以带有icp27盒的质粒(具有序列seq id nos:1、2、3、5、6、7、8或9)稳定地转染的bhk细胞根据分离的克隆命名，诸如图2所示的bhk153。
82.在某些具体例中，相比于目前在d27-1载体中使用的icp27缺失(约1.6kb缺失)，本发明的rhsv载体具有最大的icp27缺失(约2kb缺失)。所有分析的icp27表达构建体都能够以相似的效率支持rhsv复制。因此，在icp27基因中具有约2kb缺失的主题rhsv载体代表一种新的rhsv生产系统，其可用于生产无复制型hsv(rchsv)的rhsv。
83.具体而言，申请人设计出用于产生具有全部2,077bp ul54基因缺失的rhsv-1基因组的dna序列。这是目前最大和完整的编码icp27的ul54基因的缺失。涵盖如此大的icp27缺失的新复制缺陷病毒(例如复制缺陷rhsv-1)产生复制型rchsv的可能性较低，部分原因是新病毒基因组与存在于目前的icp27补充细胞系(例如v27、2-2、b130细胞等)细胞基因组中的任何整合icp27基因之间的序列重叠较小。
84.在新的贴壁vero细胞或无血清悬浮液适应型bhk细胞系中，携带这种更大的icp27缺失(例如编码icp27的ul54基因完整缺失)的新复制缺陷病毒(例如rhsv-1)的增殖，其整合到细胞基因组中的icp27基因与具有完整ul54基因缺失的rhsv病毒基因组之间没有重叠，将能够生产不含复制型rchsv病毒的rhsv原液。这种不含rchsv的rhsv原液非常有利于raav的大规模生产，而raav又可用于基因疗法、用于治疗性蛋白质(肽、酶、抗体等)、寡核苷酸(即shrna、mirna)和基因编辑以及沉默工具(crispr-cas、talen、shrna、mirna等)的表达等。
85.根据在此阐述的本发明的一般原理，以下部分提供对本发明各个方面的进一步详细描述。应理解，本发明的任何具体例都可以与本发明的任何一个或多个附加具体例组合，包括在本技术的不同部分中所描述的那些具体例和仅在实施例、附图或权利要求书中描述者。
86.2、重组复制缺陷病毒
87.在一方面，本发明提供一种源自疱疹病毒目的重组复制缺陷病毒，其中，所述病毒的特征在于编码icp27的基因或其功能等效基因的缺失，其中所述缺失的长度至少为1,200bp，且留下不超过300bp、250bp、200bp、150bp、100bp、50bp、30bp、20bp、10bp、9bp、8bp、7bp、6bp、5bp、4bp、3bp、2bp、1bp或0bp的所述编码icp27的基因(例如seq id no:11)或其功能等效基因的最3
’‑
末端。
88.在某些具体例中，所述重组复制缺陷病毒(例如hsv)不为hsv的临床病毒株/非实验室病毒株。
89.在某些具体例中，所述重组复制缺陷病毒(例如hsv)为实验室hsv株，诸如kos、kos 1.1、kos 1.1a、kos63、kos79、mckrae、第17株、f17、mcintyre或其他。
90.如本文所使用，“临床病毒株”和“非实验室病毒株”在本文中可互换使用，其指相对最近或刚从人或非人动物分离出的病毒株。实验室和非实验室病毒株之间的一个主要区别是实验室病毒株在培养或连续传代(不包括冷冻后的储存时间)中长期保持(例如在某些
情况下为数年)。在培养中经过多代连续传代的实验室病毒株可能积累了有助于在培养中快速复制和生长的突变，但也可能失去了某些对实际应用有用的特性，例如维持沿轴突移动的能力。
91.在某些具体例中，本发明的病毒载体(例如hsv载体)源自自其未修饰的临床前体病毒株从其宿主分离以来已经培养超过三年的病毒株。培养时间为实际培养时间，不包括冷冻后的储存时间。
92.在某些具体例中，本发明的病毒载体(例如hsv载体)源自自其未修饰的临床前体病毒株从其宿主分离以来已经连续传代超过1,000个循环的病毒株。
93.由于所述缺失，本发明的重组复制缺陷病毒在不存在由宿主细胞反式提供的icp27蛋白或功能等效物的情况下是复制缺陷型的。
94.人疱疹病毒1型(hhv-1)(人单纯疱疹病毒1型)中的icp27(感染细胞蛋白27)基因编码512个氨基酸的蛋白质(uniprotkb-q3mu88(q3mu88_hhv1)，以引用的方式并入本文)。它也被称为mrna输出因子、立即早期蛋白ie63、vmw63和ul54。icp27基因的序列提供于seq id no:11，包含来自hsv-1的天然启动子序列。
95.所指重组复制缺陷病毒可源自疱疹病毒目的任何病毒，其带有来自hsv-1的icp27功能等效基因。icp27基因或其功能等效基因的缺失的长度至少为1,200bp，且留下所述编码icp27的基因(seq id no:11)或其功能等效基因的最3
’‑
末端的不超过300bp、250bp、200bp、150bp、100bp、50bp、30bp、20bp、10bp、9bp、8bp、7bp、6bp、5bp、4bp、3bp、2bp、1bp或0bp(即未留下)。
96.疱疹病毒属建立于1971年在国际病毒分类委员会(international committee on taxonomy of viruses，ictv)的第一份报告中。此属由23种病毒和4群病毒所组成。在1976年的第二份ictv报告中，此属被提升到科级别－疱疹病毒科(herpetoviridae)。由于可能与源自爬行动物的病毒混淆，该名称在1979年的第三份报告中更改为疱疹病毒科(herpesviridae)。在此份报告中，疱疹病毒科分成3个亚科(甲型疱疹病毒、乙型疱疹病毒和丙型疱疹病毒)以及5个未命名的属：列出了21个病毒。于2009年，疱疹病毒科被提升为疱疹病毒目。由于发现鱼类和软体动物的疱疹病毒与鸟类和哺乳动物的疱疹病毒只有远亲关系，因此必须进行此提升。两个新的科被创造－合并硬骨鱼和青蛙病毒的异疱疹病毒科，和包含软体动物病毒的软体动物疱疹病毒科。
97.来自疱疹病毒目的已知病毒(包括来自各种已命名科、亚科、属和种的病毒)的功能等效基因可以很容易地从公共或专有数据库中获得，例如genbank、unipro、embl等，使用人hsv-1icp27多核苷酸序列(如seq id no:11)作为查询。因此，这些序列在本文中没有描述，而是以引用方式并入本文。
98.在某些具体例中，编码icp27的基因或其功能等效基因的最3
’‑
末端定义为紧邻各自病毒基因组上的下一个基因的5’端的核苷酸(例如icp27基因或等效物的3’端的“下一个”基因的启动子的第一个核苷酸)。
99.在某些具体例中，编码icp27的基因或其功能等效基因的最3
’‑
末端定义为icp27或其功能等效基因的终止密码子，包含终止密码子本身。
100.在某些具体例中，所述编码icp27的基因具有seq id no:11的多核苷酸序列。
101.在某些具体例中，所述缺失为至少1,300bp、1,400bp、1,500bp、1,600bp、1,700bp、
1,800bp、1,900bp、2,000bp、2,100bp或更多。
102.在某些具体例中，所述缺失包括编码icp27的基因或其功能等效基因的整个编码序列(或orf)或主要由其所组成或由其所组成。
103.在某些具体例中，所述缺失还包括所述编码icp27的基因或其功能等效基因的全部启动子区域，或所述启动子区域的一部份(例如最3’端约400个核苷酸)。
104.在某些具体例中，所述病毒源自异疱疹病毒科或软体动物疱疹病毒科。
105.在某些具体例中，所述病毒源自疱疹病毒科，诸如甲型疱疹病毒亚科、乙型疱疹病毒亚科或丙型疱疹病毒亚科。
106.在某些具体例中，所述病毒源自hhv-1(单纯疱疹病毒-1或hsv-1)、hhv-2(单纯疱疹病毒-2或hsv-2)、hhv-3(水痘带状疱疹病毒或vzv)、hhv-4(eb病毒或ebv)、hhv-5(巨细胞病毒或cmv)、hhv-6a/hhv-6b(玫瑰疱疹病毒属，嗜淋巴疱疹病毒)、hhv-7或hhv-8(卡波西肉瘤相关疱疹病毒或kshv)。
107.在某些具体例中，所述病毒源自猕猴疱疹病毒-1(cehv-1)或鼠疱疹病毒68(mhv-68或muhv-4)。
108.在某些具体例中，所述病毒源自猪甲型疱疹病毒，包含伪狂犬病病毒(prv)。
109.在某些具体例中，所述病毒源自单纯疱疹病毒属，诸如侏猴疱疹病毒1型、蜘蛛猴疱疹病毒、猪疱疹病毒、牛疱疹病毒2型、猕猴疱疹病毒1型(疱疹b病毒)、果蝠α疱疹病毒1型、兔疱疹病毒4型、恒河猴疱疹病毒1型、小袋鼠疱疹病毒2型和狒狒疱疹病毒2型。
110.在某些具体例中，所述病毒源自水痘病毒属，诸如牛疱疹病毒1型、牛疱疹病毒5型、水牛疱疹病毒1型、山羊疱疹病毒1型、犬疱疹病毒1型、猕猴疱疹病毒9型、鹿疱疹病毒1型、鹿疱疹病毒2型、麋鹿疱疹病毒1型、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒3型、马疱疹病毒4型、马疱疹病毒8型、马疱疹病毒9型、猫疱疹病毒1型和猪源疱疹病毒1型。
111.在某些具体例中，所述病毒源自马利克病毒属，诸如鸭疱疹病毒1型、鸽疱疹病毒1型、鸡疱疹病毒2型、鸡疱疹病毒3型(gahv-3或mdv-2)、火鸡疱疹病毒1型(hvt)和孔雀疱疹病毒1型。
112.在某些具体例中，所述病毒源自传染性喉气管炎病毒属，诸如鸡疱疹病毒1型和鹦鹉疱疹病毒1型。
113.在某些具体例中，所述病毒源自爬行动物甲型疱疹病毒，诸如赤蠵龟疱疹病毒、海龟疱疹病毒1型、海龟疱疹病毒2型、海龟疱疹病毒3型、海龟疱疹病毒4型、绿蠵龟疱疹病毒、库伯疱疹病毒、水龟疱疹病毒1型、水龟疱疹病毒2型、纤维乳头状瘤相关疱疹病毒、盾蜥疱疹病毒1型、盾蜥疱疹病毒2型、盾蜥疱疹病毒3型、木雕龟疱疹病毒1型、木雕龟疱疹病毒2型、鬣蜥疱疹病毒1型、鬣蜥疱疹病毒2型、蠵龟口皮疱疹病毒、肺-眼-气管疱疹病毒、侧颈龟疱疹病毒1型、红耳龟疱疹病毒、箱龟疱疹病毒1型、箱龟疱疹病毒2型、陆龟疱疹病毒1型、陆龟疱疹病毒2型、陆龟疱疹病毒3型、陆龟疱疹病毒4型和巨蜥疱疹病毒1型。
114.在某些具体例中，所述病毒源自蛛猴疱疹病毒属，诸如狷羚疱疹病毒1型、狷羚疱疹病毒2型、侏猴疱疹病毒2型、牛疱疹病毒4型、猕猴疱疹病毒17型、马疱疹病毒2型、马疱疹病毒5型、马疱疹病毒7型、日本猕猴疱疹病毒、兔疱疹病毒1型和鼠疱疹病毒4型(鼠类丙型疱疹病毒-68或mhv-68)。
115.在某些具体例中，所述病毒为hsv-1株，诸如kos、kos 1.1、kos 1.1a、kos63、
kos79、mckrae、第17株、f17、mcintyre或其他。
116.在某些具体例中，所述其功能等效基因为kshv的orf57、ebv的mta/sm/eb2或、人cmv的ul69或疱疹病毒目的任何病毒的其他等效基因。
117.在某些具体例中，所述病毒还包括aav rep和cap蛋白的编码序列和/或两侧为aav itr序列的目的基因(goi)。
118.在某些具体例中，所述aav rep和cap蛋白的编码序列和/或所述两侧为aav itr序列的目的基因(goi)整合到或替换病毒的非必需基因(例如无需用于病毒复制和无需用于病毒包装)。示例性的此非必需基因包含tk基因和病毒基因组的其他约50％的大部分。
119.本发明的另一方面提供一种增殖/扩增/生产本发明的重组复制缺陷病毒的方法，所述方法包括以所指重组复制缺陷病毒感染表达互补/功能性icp27基因或其功能等效物(见下文)的主题宿主细胞。
120.在某些具体例中，所述方法还包括从被感染的宿主细胞中收获所述重组复制缺陷病毒。
121.在某些具体例中，所指重组复制缺陷病毒与可整合到宿主细胞基因组中的所述icp27或其功能等效物的编码序列之间不超过300bp、250bp、200bp、150bp、100bp、50bp、30bp、20bp、10bp、9bp、8bp、7bp、6bp、5bp、4bp、3bp或2bp的序列重叠。
122.源自疱疹病毒目的主题重组复制缺陷病毒可使用常规分子生物学技术制备或构建，诸如同源重组。举例来说，要从hsv野生型病毒株(或来自疱疹病毒目的病毒的功能等效基因)中删除天然icp27基因或编码序列，可将野生型病毒的基因组插入合适的载体中，诸如细菌人工染色体(bac)或酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，yac)。同源重组可在合适的宿主细胞中进行，诸如大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞(例如sf9)或哺乳动物，以删除靶基因(即icp27或其功能等效物)。这可以通过，例如，将带有位于靶基因(即icp27或其功能等效物)两侧的同源区域的线性化质粒引入同一宿主细胞中来实现。
123.合适的哺乳动物宿主细胞包含vero细胞、幼地鼠肾(bhk)细胞、hela细胞、人肺成纤维细胞mrc-5、人包皮成纤维细胞(hff)、人胚胎成纤维细胞(helf)、马-达二氏犬肾细胞(mdck)、马-达二氏牛肾细胞(mdbk)或任何其他合适的哺乳动物细胞。
124.因此，本发明的另一方面提供一种制造源自疱疹病毒目的重组复制缺陷病毒的方法，其中，所述病毒的特征在于编码icp27的基因或其功能等效基因的缺失，其中所述缺失的长度至少为1,200bp，且留下不超过300bp、250bp、200bp、150bp、100bp、50bp、30bp、20bp、10bp、9bp、8bp、7bp、6bp、5bp、4bp、3bp、2bp、1bp或0bp的所述编码icp27(例如seq id no:11)或其功能等效物的基因的最3
’‑
末端，所述方法包括通过合适的宿主细胞中的同源重组创造所述编码icp27或其功能等效物的基因的所述缺失。
125.在某些具体例中，所述同源重组通过使用细菌人工染色体(bac)进行，所述细菌人工染色体包含所述源自疱疹病毒目的病毒的基因组(例如hsv基因组)，其具有所述编码icp27或其功能等效物的基因。
126.在某些具体例中，用于扩增主题rhsv dna的细胞可选自一大群细胞类型，诸如大肠杆菌或真核细胞，诸如酵母、昆虫细胞(例如sf9)或哺乳动物细胞。rhsv病毒的增殖可在哺乳动物细胞中进行，例如vero细胞、幼地鼠肾(bhk)细胞、hela细胞、人肺成纤维细胞mrc-5、人包皮成纤维细胞(hff)、人胚胎成纤维细胞(helf)、马-达二氏犬肾细胞(mdck)、马-达
二氏牛肾细胞(mdbk)或其他。
127.3、raav中的目的基因(goi)和可治疗的疾病
128.本发明的重组复制缺陷病毒，诸如本发明的rhsv载体，可用于大规模生产带有目的基因(goi)的重组aav载体。所述goi可为aav包装能力内的任何基因或编码序列，例如约4至5kb，或包括itr序列的约4.7kb或不考虑itr序列的约4.4kb。
129.在某些具体例中，带有goi的raav可用于基因疗法，以治疗因缺少宿主的内源基因功能所引起的疾病或病症，诸如goi的缺陷形式。
130.如本文所使用，“目的基因”或goi通常指核酸或多核苷酸序列，诸如基因、开放阅读框(open reading frame，orf)或蛋白质或rna的编码序列，诸如sirna。然而，在某些情况或内文中，术语goi也泛指蛋白质(由goi编码)或可由goi治疗的疾病或适应症或可(但非必然)因丧失goi的功能而引起的疾病或适应症。
131.举例来说，基因galgt2编码蛋白galnac转移酶(β-1,4-n-乙酰半乳糖胺半乳糖基转移酶)，其为将复杂的糖分子转移到一些特定蛋白质(包括肌养蛋白聚糖)上的酶。在正常情况下，galnac转移酶仅在神经肌肉接头(neuromuscular junction，nmj)处发现，此处的肌养蛋白聚糖相关蛋白复合物的一些成分与其他肌肉部位不同。重要的是，在nmj，存在肌营养相关蛋白而不是肌萎缩蛋白。在肌营养不良症的mdx小鼠模型中，galgt2的病毒基因转移导致galnac转移酶的表达遍及整个肌肉膜，而不仅仅是在nmj的正常表达域，且遍及整个肌肉纤维的肌营养相关蛋白上调。在mdx小鼠中，此表达可改正肌肉功能性缺陷到与微肌萎缩蛋白基因表达相同的程度。此外，galgt2的过表达改正其他肌营养不良症小鼠模型中的肌肉病理，包含lgmd2a和先天性肌营养不良症(mdc1a)。因此，galgt2为治疗诸如dmd、bmd、lgmd2a和mdc1a的肌营养不良症的goi，尽管在需要治疗的患者中，galgt2本身不一定有缺陷。
132.在另一个例子中，肌脂蛋白(sarcolipin，sln)抑制肌/内质网(sr)ca
2+
atp酶(serca)，且在dmd患者和动物模型(诸如dmd的mdx小鼠模型)的肌肉中异常升高。通过aav9介导的rna干扰降低sln水平改善dmd的严重肌萎缩蛋白/肌营养相关蛋白双突变(mdx:utr-/-)小鼠模型中的营养不良病理，包含肌肉病理的减弱和膈肌、骨骼肌和心脏功能的改善。因此，sln rnai的编码序列为治疗dmd的goi。
133.因此，goi可为基因(或蛋白质)，当被表达时，其取代突变的、受损的或无活性的基因或蛋白质。goi可为基因(或蛋白质)，当被表达时，其协助已经起作用的过程，所述过程需要修饰以治疗疾病、障碍或功能障碍。goi可为基因(或蛋白质)，当被表达时，其协助功能失调的过程，所述过程需要修饰以治疗疾病、障碍或功能障碍。goi核酸序列可为dna、rna或合成的核酸分子。goi可为蛋白、酶、结构蛋白、功能性蛋白或基于细胞功能的适应性蛋白。goi可为疾病、障碍或功能障碍提供治疗益处或治疗模态。
134.在某些具体例中，goi可为crispr-cas9、cas 13、talen或其他基于遗传的基因编辑蛋白，彼等为细胞内递送以实现彼等预期活性所必需的。
135.本文使用的任何和所有goi可能需要通过基于计算机的已知算法进行密码子优化，以增强表达和活性。
136.因此，可通过使用主题病毒载体(例如rhsv载体)和互补细胞(以反式方式供应icp27基因产物)生产的raav，可以编码有用于，例如，基因疗法的目的基因(goi)，以治疗疾
病或病症。代表性(非限制性)的目的基因(goi)可包含负责/缺陷的lgmd2e(肢带型肌营养不良症2e型)、lgmd2d(肢带型肌营养不良症2d型)、lgmd2c(肢带型肌营养不良症2c型)、lgmd2b(肢带型肌营养不良症2b型)、lgmd2l(肢带型肌营养不良症2l型)、lgmd2i(肢带型肌营养不良症2i型)的基因或下述者的基因或编码序列：naglu(α-n-乙酰葡糖胺糖苷酶，导致圣菲利波综合征或黏多糖贮积症iiib型(mps iiib))、磺酰胺酶或sgsh(导致黏多糖贮积症iiia型或mps iiia)、因子ix、因子viii、肌管蛋白1(mtm1)、运动神经元存活(smn，导致脊髓性肌萎缩或sma)、galnac转移酶galgt2、钙蛋白酶3(capn-3)、酸性α-葡糖苷酶(gaa，导致庞贝氏症)、α-半乳糖苷酶a或gla(导致法布里病)、葡糖脑苷脂酶、肌萎缩蛋白或微肌萎缩蛋白。
137.在某些具体例中，所述goi为微肌萎缩蛋白基因。
138.在某些具体例中，所述微肌萎缩蛋白基因为以下专利中所描述的任一者：us7,906,111；us7,001,761；us7,510,867；us6,869,777；us8,501,920；us7,892,824；pct/us2016/013733；us10,166,272(全部以引用方式并入本文)。在某些具体例中，所述微肌萎缩蛋白基因能够被包装至raav病毒粒体，例如尺寸不超过约4.7kb。
139.在某些具体例中，所述微肌萎缩蛋白基因在其编码序列中包含血影蛋白样重复序列r16和r17，彼等能够恢复肌膜的一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，nnos)活性(诸如us7,892,824中所描述的那些)。
140.在某些具体例中，所述微肌萎缩蛋白基因包括全长肌萎缩蛋白的r1、r16、r17、r23和r24血影蛋白样重复序列(即分别为sr1、sr16、sr17、sr23和sr24)的编码序列，诸如pct/us2016/013733所描述的一者(以引用方式并入本文)。在某些具体例中，所述微肌萎缩蛋白基因不编码sr1、sr16、sr17、sr23和sr24以外的任何其他全长肌萎缩蛋白的血影蛋白重复序列。
141.可能从基于rhsv的系统生产的raav中受益的疾病或病症包含：亨廷顿病、x连锁肌管性肌病(x-linked myotubular myopathy，xlmtm)、酸性麦芽糖酶缺乏症(例如庞贝氏症)、脊髓性肌萎缩(spinal muscular aatrophy，sma)、重症肌无力(myasthenia gravis，mg)、肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，als)、弗里德赖希共济失调(friedreich’s ataxia)、线粒体肌病、肌营养不良症(杜氏肌营养不良症(duchenne’s muscular dystrophy)、强直性肌营养不良症、贝克肌营养不良症(becker muscular dystrophy，bmd)、肢带型肌营养不良症(limb-girdle muscular dystrophy，lgmd)、面肩胛肱肌营养不良症(facioscapulohumeral muscular dystrophy，fsh)、先天性肌营养不良症(congenital muscular dystrophy，cdm)、眼咽型肌营养不良症(oculopharyngeal muscular dystrophy，opmd)、远端型肌营养不良症、埃默里-德赖弗斯肌营养不良症(emery-dreifuss muscular dystrophy，edmd)、黏多糖贮积症(mucopolysaccharidoses，mps)、异染性脑白质营养不良(metachromatic leukodystrophy，mld)、贝敦氏症(batten disease)、雷特综合征(rett syndrome)、克拉伯病(krabbe disease)、卡纳万病(canavan disease)、x连锁视网膜劈裂症(x-linked retinitis pigmentosa)、全色盲(cngb3和cnga3)、x连锁视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性、新生血管性黄斑变性、庞贝氏症,法布里病(fabry’s disease)、mps i、mps ii、mps iiia、mps iiib、戈谢病(gaucher’s disease)、丹农病(dannon disease)、a1at缺乏症、弗里德赖希共济失调、威尔逊氏症
(wilson’s disease)、贝敦氏症(cln1、cln3、cln6、cln8)、沃尔曼病(wolman disease)、泰-萨克斯病(tay-sachs)、尼曼-皮克病c型、cdkl5缺乏病、b-地中海贫血、镰状细胞病。
142.在某些具体例中，可能从基于rhsv的系统生产的raav中受益的疾病或病症可包含：贝克肌营养不良症(bmd)、先天性肌营养不良症(cmd)、贝特莱姆先天性肌营养不良症(bethlem cmd)、福山先天性肌营养不良症(fukuyama cmd)、肌-眼-脑病(mebs)、刚性脊柱综合征、乌尔里希先天性肌营养不良症(ullrich cmd)、沃克-沃伯格综合征(walker-warburg syndromes，wws)、杜氏肌营养不良症(dmd)、埃默里-德赖弗斯肌营养不良症(edmd)、面肩胛肱肌营养不良症(fshd)、肢带型肌营养不良症(lgmd)、强直性肌营养不良症(dm)、眼咽型肌营养不良症(opmd)、运动神经元疾病，包含als(肌萎缩侧索硬化)、脊髓延髓肌萎缩(spinal-bulbar muscular atrophy，sbma)、脊髓性肌萎缩(sma)。
143.在某些具体例中，可能从基于rhsv的系统生产的raav中受益的疾病或病症可包含离子通道疾病，其通常以肌肉无力、肌张力缺乏或发作性肌肉麻痹为特征。彼等包含安德森氏综合征(andersen-tawil syndrome)、高血钾性周期性麻痹、低血钾性周期性麻痹、先天性肌强直、贝克肌强直(becker myotonia)、汤姆森肌强直(thomsen myotonia)、先天性副肌强直、钾加重肌强直(potassium-aggravated myotonia)。
144.在某些具体例中，可能从基于rhsv的系统生产的raav中受益的疾病或病症可包含线粒体疾病，其发生于为细胞生产能量的结构故障时。此类疾病包含：弗里德赖希共济失调(friedreich’s ataxia，fa)、线粒体肌病、卡恩斯-塞尔综合征(kearns-sayre syndrome，kks)、利氏综合征(leigh syndrome，亚急性坏死性脑肌病)、线粒体dna耗竭综合征、线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和中风样发作(melas)、线粒体神经胃肠脑肌病(mitochondrial neurogastrointestinal encephalomyopathy，mngie)、肌阵挛癫痫伴破碎红纤维综合征(myoclonus epilepsy with ragged red fibers，merrf)、神经病、共济失调和视网膜色素变性(narp)、皮尔逊综合征(pearson syndrome),进行性眼外肌麻痹(progressive external opthalmoplegia，peo)。
145.在某些具体例中，可能从基于rhsv的系统生产的raav中受益的疾病或病症可包含肌病，其为一种肌肉疾病，其中肌纤维不能正常运作，导致肌肉无力。肌病包含：帽肌病(cap myopathies)、中心核肌病(centronuclear myopathies)、先天性肌病伴随肌纤维比例失常(congenital myopathies with fiber type disproportion)、核心肌病(core myopathies)、中央轴空病(central core disease)、多微小核心肌病(multiminicore myopathies)、肌球蛋白贮积肌病(myosin storage myopathies)、肌管性肌病、杆状体肌病(nemaline myopathies)、远端肌病(distal myopathies)、gne肌病/野中肌病(nonaka myopathy)/遗传性包涵体肌病(hereditary inclusion-body myopathy，hibm)、莱恩远端肌病(laing distal myopathy)、马克斯伯格-格里格斯迟发性远端肌病(markesberg-griggs late-onset distal myopathy)、三好肌病(miyoshi myopathy)、乌德肌病(udd myopathy)/胫骨肌营养不良症、声带和咽部远端肌病、韦兰德远端肌病(welander distal myopathy)、内分泌肌病、甲亢性肌病、甲状腺功能减退性肌病、炎症性肌病、皮肌炎、包涵体肌炎、多发性肌炎、代谢性肌病、酸性麦芽糖酶缺乏症(amd、庞贝氏症(pompe disease))、肉碱缺乏症、肉碱棕榈酰转移酶缺乏症、脱支酶缺乏症(科里病(cori disease)、福布斯病(forbes disease))、乳酸脱氢酶缺乏症、肌腺苷酸脱氨酶缺乏症、磷酸果糖激酶缺乏症(樽
井病(tarui disease)、磷酸甘油酸激酶缺乏症、磷酸甘油酸变位酶缺乏症、磷酸化酶缺乏症(麦克阿德尔病(mcardle disease))、肌原纤维肌病(myofibrillar myopathies，mfm)、肩腓肌病(scapuloperoneal myopathy)。
146.在某些具体例中，可能从基于rhsv的系统生产的raav中受益的疾病或病症可包含神经肌肉接头疾病，其由参与在肌肉和神经之间的信号传递的一个或多个主要蛋白的破坏、故障或缺乏所引起。此类疾病包含：
147.先天性肌无力综合征(congenital myasthenic syndromes，cms)、兰伯特-伊顿肌无力综合征(lambert-eaton myasthenic syndrome，lems)、重症肌无力(mg)。
148.在某些具体例中，可能从基于rhsv的系统生产的raav中受益的疾病或病症可包含周围神经疾病，其中将大脑和脊髓连接到身体其他部位的运动和感觉神经受到影响，导致感觉、运动或其他功能受损。此类疾病包含：夏科-马里-图思病(charcot-marie-tooth disease，cmt)、巨轴突神经病(giant axonal neuropathy，gan)、恶病质和衰老中的肌肉消瘦。
149.4、互补重组载体
150.本发明的病毒载体，诸如本发明的重组hsv载体，可在合适的宿主细胞中增殖，所述宿主细胞提供从主题病毒载体中删除的icp27功能。此icp27功能可由编码icp27的主题互补重组载体(或简称重组载体)提供。本发明的互补重组载体可整合到宿主细胞的基因组中。icp27编码序列可从icp27基因起源的疱疹病毒目基因组中的天然启动子转录。
151.因此，本发明的另一方面提供一种能够在宿主细胞中表达icp27或其功能等效物的(互补)重组载体，所述载体包括：(1)所述icp27或其功能等效物的编码序列，其可操作地连接至能够导向所述编码序列在宿主细胞中转录的启动子；(2)所述编码序列3’端的多腺苷酸化位点；和(3)任选地，一个或多个多克隆位点；其中，所述载体包含不超过300bp、250bp、200bp、150bp、100bp、50bp、30bp、20bp、10bp、9bp、8bp、7bp或6bp的任何主题重组复制缺陷病毒(例如rhsv)的连续核苷酸。
152.由于反式提供的icp27蛋白不需要有野生型icp27的100％活性，因此在某些具体例中，所述icp27具有seq id no:10的氨基酸序列，或与seq id no:10至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.2％、99.4％、99.6％或99.8％相同。
153.同样的，icp27编码序列的启动子不需要是icp27起源的病毒中的天然启动子，尽管在一些具体例中，启动子是天然启动子。
154.在某些具体例中，所述启动子包括至少约400个多核苷酸、450个多核苷酸、500个多核苷酸或约550个多核苷酸。
155.在某些具体例中，所述启动子包括seq id no:11的第1至538位核苷酸或seq id no:11的第127至538位核苷酸或基因库登录号kt887224的第113,139至113,550位核苷酸或基因库登录号kt887224的第113,013至113,550位核苷酸(全部序列以引用方式并入本文)。
156.在某些具体例中，在本发明的互补重组载体上的icp27编码序列与从主题病毒载体删除的icp27编码序列之间没有序列重叠。
157.在某些具体例中，作为宿主细胞中互补dna的icp27编码序列(有利于缺乏icp27编码序列的主题病毒(例如rhsv)载体的增殖)经过部分或完全密码子优化，以在真核生物或哺乳动物细胞系(诸如bhk细胞、vero细胞或hek293细胞)中转译。举例来说，在某些具体例
中，所述编码序列的最3’端的300至350个核苷酸经过密码子优化，以在哺乳动物宿主细胞中表达。
158.在某些具体例中，所述多腺苷酸化位点为牛生长激素(bgh)多腺苷酸化位点。
159.在某些具体例中，多腺苷酸化位点或多(a)信号序列来自其他合适的来源，例如合成序列或来自其他真核生物基因或病毒的序列。
160.在某些具体例中，本发明的互补重组载体上的icp27编码序列与未删除icp27编码序列/orf的主题重组复制缺陷病毒载体之间的任何极少或剩余重叠显著不足以允许或支持两者之间的同源重组。举例来说，主题病毒载体上残留的icp27编码序列和/或启动子序列极少(如果有)，使得主题病毒载体和icp27编码序列(加上任何天然启动子序列)之间的任何序列重叠不足以引起同源重组。
161.在某些具体例中，作为宿主细胞中互补dna的icp27编码序列(有利于缺乏icp27编码序列的主题病毒(例如rhsv)载体的增殖)包含降低icp27蛋白的抑制宿主前mrna剪接能力的突变，同时仍允许促进晚期基因表达。这种icp27突变可导致更高感染性raav的产量，至少部分原因为aav rep和cap蛋白的表达增加。
162.示例性的此突变包含vbs3.3、vbs4.3、vbs5.3突变，如soliman等人(j virol 71:9188-9197,1997。以引用方式并入本文)中所描述者。具体而言，soliman描述了使用温度敏感的icp27等位基因－lg4－在39.5℃的限制温度下失去icp27活性，用于基因内抑制因子(intragenic suppressor)的遗传筛选。确定了三个基因内抑制因子，即vbs3.3、vbs4.3和vbs5.3。lg4等位基因在野生型icp27的羧基末端锌指的n末端有一个r480h点突变。vbs3.3、vbs4.3和vbs5.3基因内抑制因子等位基因都保留了原始的r480h点突变，但还分别包含一个额外的v496i、s334l和v487i点突变。因此，vbs3.3为r480h和v496i双点突变，vbs4.3为r480h和s334l双点突变，vbs5.3为r480h和v487i双点突变。
163.5、宿主细胞
164.许多不同类型的真核生物宿主细胞可用于增殖主题重组复制缺陷病毒载体，前提是此类真核生物宿主细胞经改造以表达从主题重组复制缺陷病毒载体中删除的icp27。
165.在某些具体例中，所指宿主细胞包括互补重组载体，且能够表达icp27以启动主题病毒载体的复制和包装。
166.在某些具体例中，所述重组载体稳定地整合到所述宿主细胞的基因组。
167.在某些具体例中，所述宿主细胞源自脊椎动物，诸如人、猴、牛、猪、马和其他马科动物、犬、猫、绵羊、山羊、鼠、大鼠、兔、貂、负鼠、骆驼和其他骆驼科动物、鸡和其他禽类、犰狳、青蛙、爬行动物或源自昆虫细胞。人细胞包含bhk细胞、vero细胞、hek293细胞等。
168.在某些具体例中，所述宿主细胞为hek293(人胚胎肾细胞)，可使用标准组织培养基培养，例如补充有l-gln、5％至10％胎牛血清(fbs)和1％青霉素-链霉素的dmem。对于贴壁hek293细胞的生长，在raav生产期间可降低fbs的百分比，以限制动物源性成分的污染。
169.在某些具体例中，所述宿主细胞为vero细胞。这种细胞可生长于固体支持物，包含组织培养盘、皿、烧瓶、瓶子和微载体，允许贴壁的vero细胞在悬浮样条件下生长。
170.在某些具体例中，所述宿主细胞为bhk(幼地鼠肾)细胞，诸如bhk21。在某些具体例中，所述bhk适应于生长在无血清悬浮液中。
171.在某些具体例中，所述宿主细胞为hek293细胞。在某些具体例中，所述hek293细胞
适应于生长在无血清培养基中(诸如f17或expi293培养基)和悬浮液中，因此适合在生物反应器中大规模生长。参见例如，grieger等人(mol.ther.24:287-297,2016。以引用方式并入本文)。
172.在某些具体例中，所述hek293细胞为hek293t细胞，其表达sv40t抗原(温度敏感等位基因tsa1609)和新霉素/遗传素遗传霉素抗性基因。
173.在某些具体例中，用于扩增主题rhsv dna的细胞可选自一大群细胞类型，诸如大肠杆菌或真核细胞，诸如酵母、昆虫细胞(例如sf9)或哺乳动物细胞。rhsv病毒的增殖可在哺乳动物细胞中进行，例如vero细胞、幼地鼠肾(bhk)细胞、hela细胞、人肺成纤维细胞mrc-5、人包皮成纤维细胞(hff)、人胚胎成纤维细胞(helf)、马-达二氏犬肾细胞(mdck)、马-达二氏牛肾细胞(mdbk)或其他。
174.在某些具体例中，如此增殖的病毒载体原液可经过检查，以确保不存在复制型病毒载体。举例来说，实施例1中使用的测定可用于确定rhsv的滴度，以及存在或不存在rchsv。
175.在某些具体例中，本发明的病毒载体可适用于生产编码目的基因(goi)的重组aav载体，其可用于基因疗法。参见下文标题为“重组aav生产”的部份。在此具体例中，一个或多个raav生产细胞系可被主题病毒载体感染，诸如编码aav rep和cap蛋白的rhsv载体，且任选地，编码两侧为aav itr序列的目的基因(goi)的rhsv载体。
176.在某些具体例中，这种用于raav生产的生产细胞系为hela或a549衍生的细胞系，其以包含aav的rep-cap基因和raav载体基因组(带有goi)以及药物选择性标志的质粒转染。
177.在某些具体例中，这种用于raav生产的生产细胞系为vero细胞。
178.在某些具体例中，这种用于raav生产的生产细胞系为bhk细胞。
179.在某些具体例中，这种用于raav生产的生产细胞系为hek293细胞。
180.在某些具体例中，这种用于raav生产的生产细胞系包括raav原病毒，其编码两侧为aav itr序列的goi，其中raav原病毒整合到用于raav生产的生产细胞系的基因组中。goi可为本文描述的用于基因疗法的任何一种goi，诸如us7,906,111；us7,001,761；us7,510,867；us6,869,777；us8,501,920；us7,892,824；或us10,166,272；或在pct/us2016/013733中所描述的小基因或微肌萎缩蛋白基因(均以引用方式并入本文)。
181.举例来说，pct/us2016/013733(wo2016/115543a2)提供一种与调节盒可操作地连接的微肌萎缩蛋白基因，其中所述微肌萎缩蛋白基因编码的蛋白质包括：氨基末端肌动蛋白结合域；β-肌养蛋白聚糖结合域；和血影蛋白样重复序列域，包含至少四个血影蛋白样重复序列，其中，所述至少四个血影蛋白样重复序列中的两个包含神经元一氧化氮合酶结合域。在某些具体例中，所述至少血影蛋白样重复序列包含血影蛋白样重复序列1(sr1)、血影蛋白样重复序列16(sr16)、血影蛋白样重复序列17(sr17)、血影蛋白样重复序列24(sr24)。在某些具体例中，由微肌萎缩蛋白基因编码的蛋白质还包括铰链域(hinge domain)的至少一部份，诸如铰链1域、铰链2域、铰链3域、铰链4域和铰链样域(hinge-like domain)。在某些具体例中，微肌萎缩蛋白基因以n-末端到c-末端的顺序包含铰链1域(h1)；血影蛋白样重复序列1(sr1)；血影蛋白样重复序列16(sr16)；血影蛋白样重复序列17(sr17)；血影蛋白样重复序列24(sr24)；和铰链4域(h4)。在某些具体例中，h1直接耦合到sr1。在某些具体例中，
sr1直接耦合到sr16。在某些具体例中，sr16直接耦合到sr17。在某些具体例中，sr17直接耦合到sr24。在某些具体例中，sr24直接耦合到h4。在某些具体例中，由微肌萎缩蛋白基因编码的蛋白质在sr1和sr16之间还包括，以n-末端到c-末端的顺序，血影蛋白样重复序列2(sr2)和血影蛋白样重复序列3(sr3)。在某些具体例中，sr1直接耦合到sr2，且sr2直接耦合到sr3。在某些具体例中，h1直接耦合到sr1，sr1直接耦合到sr16，sr16直接耦合到sr17，sr17直接耦合到sr23，sr23直接耦合到sr24，sr24直接耦合到h4。
182.在某些具体例中，所述调节盒选自由ck8启动子和心肌肌钙蛋白t(ctnt)启动子所组成的组。在某些具体例中，由微肌萎缩蛋白基因编码的蛋白质具有5个血影蛋白样重复序列到8个血影蛋白样重复序列。在某些具体例中，由微肌萎缩蛋白基因编码的蛋白质与wo2016/115543a2中的seq id no:4或5的氨基酸序列具有至少80％或90％的序列同一性(以引用方式并入本文)。
183.在某些具体例中，如此生产的raav病毒可经过检查，以确保raav病毒原液中不存在rhsv和rchsv病毒载体。举例来说，实施例1中使用的测定可用于确定存在或不存在rhsv和rchsv。
184.6、重组aav生产
185.主题重组复制缺陷病毒载体，尤其是主题重组hsv载体，以及生产细胞系，共同形成基于hsv的互补系统，可用于大规模生产重组aav载体(raav)，有利用于基因疗法。
186.可用主题病毒(例如rhsv)载体和生产细胞系生产的重组aav载体通常包含目的基因(goi)和表达调节物(诸如goi的启动子)，代替野生型aav病毒rep和cap开放阅读框(orf)。aav rep和cap orfs，任选地，彼等的天然启动子p5、p19和p40，反而是由主题重组hsv载体和/或生产细胞系供应。所述rep orf编码4个非结构rep蛋白，彼等参与在aav病毒生命周期，而所述cap orf编码3个结构蛋白(即vp1、vp2和vp3)，彼等形成二十面体的aav衣壳。通常，保留在raav载体基因组的唯一aav病毒序列是末端反向重复序列(inverted terminal repeat，itr)－aav dna复制和包装所需的最小顺式作用元件。
187.目的基因(goi)可包含有利于治疗某些疾病或病症的基因疗法的基因。代表性(非限制性)的goi可包含负责/缺陷的lgmd2e(肢带型肌营养不良症2e型)、lgmd2d(肢带型肌营养不良症2d型)、lgmd2c(肢带型肌营养不良症2c型)、lgmd2b(肢带型肌营养不良症2b型)、lgmd2l(肢带型肌营养不良症2l型)、lgmd2i(肢带型肌营养不良症2i型)的基因或下述者的基因或编码序列：naglu(α-n-乙酰葡糖胺糖苷酶，导致圣菲利波综合征或黏多糖贮积症iiib型(mps iiib))、磺酰胺酶或sgsh(导致黏多糖贮积症iiia型或mps iiia)、因子ix、因子viii、肌管蛋白1(mtm1)、运动神经元存活(smn，导致脊髓性肌萎缩或sma)、galnac转移酶galgt2、钙蛋白酶3(capn-3)、酸性α-葡糖苷酶(gaa，导致庞贝氏症)、α-半乳糖苷酶a或gla(导致法布里病)、葡糖脑苷脂酶、肌萎缩蛋白或微肌萎缩蛋白。
188.合适的微肌萎缩蛋白基因已描述于以下专利：us7,906,111；us7,001,761；us7,510,867；us6,869,777；us8,501,920；us7,892,824；pct/us2016/013733；us10,166,272(全部以引用方式并入本文)。
189.可能从基于主题rhsv的系统生产的raav中受益的疾病或病症包含：亨廷顿病、x连锁肌管性肌病(xlmtm)、酸性麦芽糖酶缺乏症(例如庞贝氏症)、脊髓性肌萎缩(sma)、重症肌无力(mg)、肌萎缩侧索硬化(als)、弗里德赖希共济失调、线粒体肌病、肌营养不良症(杜氏
肌营养不良症、强直性肌营养不良症、贝克肌营养不良症(bmd)、肢带型肌营养不良症(lgmd)、面肩胛肱肌营养不良症(fsh)、先天性肌营养不良症(cdm)、眼咽型肌营养不良症(opmd)、远端型肌营养不良症、埃默里-德赖弗斯肌营养不良症(edmd)、黏多糖贮积症(mps)、异染性脑白质营养不良(mld)、贝敦氏症、雷特综合征、克拉伯病、卡纳万病、x连锁视网膜劈裂症、全色盲(cngb3和cnga3)、x连锁视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性、新生血管性黄斑变性、庞贝氏症,法布里病、mps i、mps ii、mps iiia、mps iiib、戈谢病、丹农病、a1at缺乏症、弗里德赖希共济失调、威尔逊氏症、贝敦氏症(cln1、cln3、cln6、cln8)、沃尔曼病、泰-萨克斯病、尼曼-皮克病c型、cdkl5缺乏病、b-地中海贫血、镰状细胞病等。
190.作为天然复制缺陷人类细小病毒，野生型aav将其基因组位点特异性地整合到宿主细胞染色体内，在缺乏辅助复制的情况下，将无限期地持续存在，除非通过细胞感染辅助病毒而获救。引入辅助病毒至宿主细胞引发aav复制和后代病毒粒体的产生。在raav病毒粒体可用于基因疗法的情况下，如果必要的rep和cap编码序列也在同一系统中供应，则引入辅助病毒功能至合适的宿主细胞引发raav病毒粒体中的goi包装。
191.换句话说，重组aav的生产完全依赖于(1)aav rep和cap编码序列的存在，以及(2)辅助病毒的功能。主题重组(hsv)载体和生产细胞系可提供raav生产所需的功能。
192.疱疹病毒科的病毒，诸如hsv，已被证明为aav复制提供必要的反式功能(handa and carter,j.biol.chem.254:6603
–
6610,1979；buller等人,j.virol.40:241
–
247,1981)。为简单起见，本文的描述将hsv称为可为aav复制提供必要反式功能的疱疹病毒科病毒的具体实例，且应理解，此描述广泛适用于疱疹病毒目的其他病毒，诸如疱疹病毒科。
193.来自疱疹病毒目的病毒(诸如疱疹病毒科(例如hsv))的复制蛋白可直接被aav用于有效的基因组复制和包装。
194.在某些具体例中，主题rhsv可与基于hsv扩增子的系统一起使用，以生产带有goi的raav。根据此具体例，aav rep和cap编码序列，任选地带有彼等的天然启动子(p5、p19和p40)，由所谓的phsv-rc质粒提供，所述质粒带有hsv复制起点和包装信号(例如hsv扩增子)。带有aav rep和cap基因的hsv颗粒通过将phsv-rc质粒转染到合适的宿主细胞中而产生，诸如vero细胞，其感染了具有icp27缺失的主题rhsv载体。在该系统中，具有icp27缺失的主题rhsv载体用作为辅助病毒，以供应缺少的反式因子，其为hsv扩增子dna复制和包装成hsv颗粒所需。如此产生hsv颗粒可进一步通过以hsv颗粒和具有icp27缺失的主题rhsv载体感染合适的宿主细胞(诸如vero细胞)的连续感染传代来扩增。在某些具体例中，具有期望goi的重组aav载体通过以这种具有aav rep和cap基因的hsv颗粒感染原病毒细胞系而生产，其中所述原病毒细胞系包含具有整合到原病毒细胞系基因组的goi的raav。在某些具体例中，具有期望goi的重组aav载体通过以这种具有aav rep和cap基因的hsv颗粒感染细胞而生产，其中所述细胞被具有两侧为aav itr序列的goi的raav质粒转染。在某些具体例中，具有期望goi的重组aav载体通过以这种具有aav rep和cap基因的hsv颗粒感染细胞而生产，其中所述细胞被具有goi的raav转染。
195.在某些具体例中，主题rhsv可通过将aav rep和cap编码序列并入主题rhsv而直接用于生产具有goi的raav。根据此具体例，aav rep和cap基因可通过例如同源重组，插入(替换或不替换)至具有icp27缺失的主题复制缺陷rhsv载体的非必需基因(诸如胸苷激酶(thymidine kinase，tk)基因座)中。所得的rhsv可在本发明的v27样细胞(诸如源自vero细
胞的那些)中增殖，所述v27样细胞包含与主题icp27缺失的rhsv不重叠(或极小重叠)的icp27编码序列。当用于感染合适的aav生产细胞系(诸如bhk细胞、vero细胞或hek293细胞)时，所得的rhsv颗粒可生产必需的aav rep和cap蛋白。在某些具体例中，具有期望goi的重组aav载体通过以这种具有aav rep和cap基因的rhsv颗粒感染原病毒细胞系而生产，其中所述原病毒细胞系包含具有整合到原病毒细胞系基因组的goi的raav。在某些具体例中，具有期望goi的重组aav载体通过以这种具有aav rep和cap基因的rhsv颗粒感染细胞而生产，其中所述细胞被具有两侧为aav itr序列的goi的raav质粒转染。在某些具体例中，具有期望goi的重组aav载体通过以这种具有aav rep和cap基因的rhsv颗粒感染细胞而生产，其中所述细胞被具有goi的raav转染。
196.在某些具体例中，主题rhsv可通过将aav rep和cap编码序列并入第一主题rhsv，和将两侧为aav itr序列的goi并入第二主题rhsv，而直接用于生产具有goi的raav。aav rep和cap编码序列和两侧为aav itr序列的goi可通过例如同源重组，插入至主题rhsv上相同(或不同)非必需基因的基因座中，诸如具有icp27缺失的主题复制缺陷rhsv载体的胸苷激酶(tk)基因座)。所得的rhsv可在本发明的v27样细胞(诸如源自vero细胞的那些)中增殖，所述v27样细胞包含与主题icp27缺失的rhsv不重叠(或极小重叠)的icp27编码序列。所得的rhsv颗粒－带有aav rep和cap编码序列的第一群rhsv颗粒和带有两侧为aav itr序列的goi的第二群rhsv颗粒，可用于共感染aav生产细胞系，诸如bhk细胞、vero细胞或hek293细胞，以生产带有goi的raav病毒粒体。此为仅基于hsv感染的raav制造系统。带有goi的raav颗粒的生产可首先通过以必要的互补系统(诸如与主题rhsv不重叠的icp27编码序列)共感染合适的rhsv生产细胞系(诸如vero细胞或bhk细胞)来生产rhsv原液。在回收rhsv载体并浓缩至高滴度后，带有aav rep和cap编码序列rhsv载体和带有两侧为aav itr序列的goi的rhsv载体被用于共感染合适的aav生产细胞系，诸如hek293或bhk细胞，以产生带有goi的raav载体。
197.因此，本发明的另一方面提供一种生产重组腺相关病毒(raav)的方法，所述raav包括两侧为aav itr序列的目的基因(goi)编码序列，所述方法包括以包括aav rep和cap蛋白的编码序列的第一重组复制缺陷病毒与包括两侧为aav itr序列的目的基因(goi)的第二重组复制缺陷病毒共感染生产宿主细胞。
198.在相关方面，本发明提供一种生产重组腺相关病毒(raav)的方法，所述raav包括两侧为aav itr序列的目的基因(goi)编码序列，所述方法包括以包括aav rep和cap蛋白的编码序列的重组复制缺陷病毒感染生产宿主细胞，其中，所述生产宿主细胞(1)包括具有所述两侧为aav itr序列的goi编码序列的整合aav原病毒；(2)被具有所述两侧为aav itr序列的goi编码序列的载体(例如质粒)转染；或(3)被具有所述两侧为aav itr序列的goi编码序列的raav共感染。
199.在某些具体例中，所述生产细胞系为bhk、vero或hek293。
200.在某些具体例中，所述aav的趋向性包含血清型，诸如aav1、aav2、aav6、aav7、aav8或aav9、aav10、aav11，优选为aav9。在某些具体例中，如所述的，aav衣壳可被遗传性修饰，或所述衣壳是合成的、设计的衣壳，其增强goi向特定组织(诸如肌肉、骨骼肌、心肌、平滑肌等)的组织特异性或生理性隔室递送(参见例如，zinn and grimm,high-throughput dissection of aav
–
host interactions:the fast and the curious,jmb 430(17):
2626-2640,2018；kotterman and schaffer,engineering adeno-associated viruses for clinical gene therapy.nature reviews genetics(2014)4445-4451,1997。两者皆以引用方式并入本文)。也可采用通过假型或不同病毒血清型的衣壳和基因组的混合而得的aav趋向性。这些血清型以斜线表示，因此，aav2/5表示包含包装在血清型5的衣壳中的血清型2的基因组的病毒。使用这些假型病毒可改善转导效率，以及改变趋向性。举例来说，假型aav2/5靶向成肌细胞(duan等人,enhancement of muscle gene delivery with pseudotyped adeno-associated virus type 5correlated with myoblast differentiation.j virol 75(16):7662-7671,2001)。其他假型aav包含aav2/6。在某些具体例中，计算机衍生的序列是从头合成的，且以临床应用相关的生物学特性为特征。这种努力造成九个功能性假定的祖先aav的产生和anc80的鉴定，即被广泛研究的aav血清型1、2、8和9的预测祖先，其作为高效的体内基因疗法载体，用于靶向肝脏、肌肉和视网膜(zinn等人,in silico reconstruction of the viral evolutionary lineage yields a potent gene therapy vector,cell reports12(6):1056-1068,2015)；buning等人,engineering the aav capsid to optimize vector
–
host-interactions,current opinion in pharmacology,24:94-104,2015)。
201.在某些具体例中，所述aav的趋向性包含骨骼肌(诸如aav1、aav6、aav7、aav8或aav9，优选为aav9)。
202.在某些具体例中，所述目的基因(goi)包含负责/缺陷的lgmd2e(肢带型肌营养不良症2e型)、lgmd2d(肢带型肌营养不良症2d型)、lgmd2c(肢带型肌营养不良症2c型)、lgmd2b(肢带型肌营养不良症2b型)、lgmd2l(肢带型肌营养不良症2l型)、lgmd2i(肢带型肌营养不良症2i型)的基因或下述者的基因或编码序列：naglu(α-n-乙酰葡糖胺糖苷酶，导致圣菲利波综合征或黏多糖贮积症iiib型(mps iiib))、磺酰胺酶或sgsh(导致黏多糖贮积症iiia型或mps iiia)、因子ix、因子viii、肌管蛋白1(mtm1)、运动神经元存活(smn，导致脊髓性肌萎缩或sma)、galnac转移酶galgt2、钙蛋白酶3(capn-3)、酸性α-葡糖苷酶(gaa，导致庞贝氏症)、α-半乳糖苷酶a或gla(导致法布里病)、葡糖脑苷脂酶、肌萎缩蛋白或微肌萎缩蛋白。
203.在某些具体例中，所述goi为肌萎缩蛋白的功能等效物(例如编码功能性微肌萎缩蛋白的肌萎缩蛋白小基因)。
204.在某些具体例中，所述goi为微肌萎缩蛋白基因。
205.在某些具体例中，所述微肌萎缩蛋白基因为us7,906,111、us7,001,761、us7,510,867、us6,869,777、us8,501,920、us7,892,824、pct/us2016/013733或us10,166,272中所描述的一者。
206.在某些具体例中，所述微肌萎缩蛋白基因包括全长肌萎缩蛋白的r16和r17血影蛋白样重复序列的编码序列(诸如us7,892,824中所描述的一者)。
207.在某些具体例中，所述微肌萎缩蛋白基因包括全长肌萎缩蛋白的r1、r16、r17、r23和r24血影蛋白样重复序列的编码序列(诸如pct/us2016/013733所描述的微肌萎缩蛋白基因)。
208.在某些具体例中所述微肌萎缩蛋白基因不包括sr1、sr16、sr17、sr23和sr24重复序列(例如按该顺序)以外的全长肌萎缩蛋白的血影蛋白重复序列和其编码序列。
209.在某些具体例中，主题rhsv提供aav生产所需的hsv基因极小集合，包含hsv核心复制机制(machinery)-hsv解旋酶-引发酶复合物(由ul5、ul8和ul52编码)，以及由ul29编码的单链dna结合蛋白，以及其他hsv基因，包括hsv聚合酶ul30、聚合酶辅助因子ul42和起点结合蛋白ul9。
210.在某些具体例中，除本文所描述的icp27缺失之外，主题重组hsv载体还具有一个或多个编码感染细胞蛋白(icp)(诸如icp0、icp4、icp22和/或icp47)的立即早期(ie)基因的缺失。主题无复制能力型rhsv载体的生产需要足够的补充细胞系，以反式提供rhsv缺少的复制和包装功能。
211.在某些具体例中，除了icp27缺失外，主题hsv还缺少编码hsv糖蛋白h(gh)的基因。感染性颗粒可由只来自互补的gh表达细胞系的这种rhsv产生，从而赋予更高水平的安全性。
212.除了与本文所描述的icp27缺失相关的必要特征外，主题rhsv载体可保留大部分野生型hsv基因组，或具有超过50％的编码非必需基因产物的野生型hsv基因组被删除而不妨害病毒扩增。主题rhsv载体还可包括hsv复制和包装所需的两个顺式作用元件－复制起点(oris)和包装信号(序列a或pac)。
213.在某些具体例中，主题rhsv和/或raav载体在体外培养条件下生产，诸如在生物反应器中(例如0.5l、1l、2l、3l、5l、10l、20l、50l、100l、250l、500l或1,000l工作体积的生物反应器)，诸如celligen plus填充床生物反应器(new brunswick scientific)，用于感染3天后的补料分批载体生产。
214.在某些具体例中，主题rhsv载体作为体外培养物是在依赖于固体支持物的粘附依赖性细胞系(诸如vero和vero衍生细胞系)上生产。在某些具体例中，所述固体支持物为组织培养表面，诸如组织培养皿、盘、瓶、烧瓶、细胞工厂等。在某些具体例中，固体支持物为微载体，诸如cytodex 1(ge healthcare life sciences,piscataway,nj)；大载体(macrocarrier)，诸如fibracel(new brunswick scientific，edison，nj)；或多层培养容器，诸如cellcube(corning life sciences，lowell，ma)，其允许培养基灌注。
215.在某些具体例中，主题rhsv载体作为体外培养物是在适应于悬浮液中生长的真核生物细胞上生产，诸如bhk细胞系的悬浮液培养。
216.在某些具体例中，培养上清液产出超过1
×
1010噬斑形成单位(plaque-forming units，pfu)的rhsv、1
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1011噬斑形成单位(pfu)的rhsv、1
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1012噬斑形成单位(pfu)的rhsv、1
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1013噬斑形成单位(pfu)的rhsv、1
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1014噬斑形成单位(pfu)的rhsv。
217.在某些具体例中，载体原液通过一个或多个后处理步骤所生产，诸如过滤和/或浓缩(例如滤床过滤、死端式过滤、切向流过滤(tangential flow filtration，ttf)和渗滤)、多柱式层析纯化、最终浓缩/缓冲液交换等，以获得足够纯度的载体原液，用于动物，包含人类。在某些具体例中，纯化过程和纯化的载体原液满足gmp标准。
218.在某些具体例中，rhsv和/或raav载体原液的滴度为约1至2
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107pfu/ml、约1至2
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108pfu/ml、约1至2
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109pfu/ml、约1至2
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1010pfu/ml、约1至2
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1011pfu/ml或约1至2
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1012pfu/ml。
219.在某些具体例中，raav载体原液的总产量为约1至25
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1014纯化raav总vg、约1至10
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1014纯化raav总vg、约1至5
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1014纯化raav总vg或约2至4
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1014纯化raav总vg。
220.在某些具体例中，如此生产的rhsv和/或raav载体通过离子交换层析和/或通过碘克沙醇密度梯度离心从粗细胞裂解物中进一步纯化，以确保最终产品的高纯度。在某些具体例中，如此生产的raav载体有资格作为临床级载体批次。
221.在某些具体例中，本发明的aav生产方法还包括确定如此生产的raav载体的滴度、纯度和/或效力。这可包含使用以下一者或多者来表征纯化的raav原液：以蛋白质sds-page分离的银染确定纯度、以qpcr确定raav完整衣壳与感染性颗粒的比率(tcid50)、以elisa确定剩余的hsv蛋白和以qpcr确定剩余的hsv dna。
222.7、使用由rhsv生产的aav治疗肌营养不良症
223.主题基于rhsv的系统可用于大规模生产raav，而raav又可用于基因疗法，以治疗各种形式的肌营养不良症，诸如杜氏肌营养不良症(dmd)、强直性肌营养不良症、贝克肌营养不良症(bmd)、肢带型肌营养不良症(lgmd)、面肩胛肱肌营养不良症(fsh)、先天性肌营养不良症(cdm)、眼咽型肌营养不良症(opmd)、远端型肌营养不良症、埃默里-德赖弗斯肌营养不良症(edmd)等。在某些具体例中，所述肌营养不良症为dmd或bmd。
224.因此，本发明的另一方面提供一种治疗有其需要的受试者的肌营养不良症(诸如dmd和bmd)的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的编码肌营养不良症中缺陷基因(诸如微肌萎缩蛋白基因)的功能形式的重组aav(raav)载体，其中，所述raav通过使用主题rhsv载体和互补系统的本发明的方法生产。
225.在某些具体例中，所述微肌萎缩蛋白基因为us7,906,111、us7,001,761、us7,510,867、us6,869,777、us8,501,920、us7,892,824、pct/us2016/013733或us10,166,272中所描述的一者(全部以引用方式并入本文)。
226.在某些具体例中，所述微肌萎缩蛋白基因包括全长肌萎缩蛋白的r1、r16、r17、r23和r24血影蛋白样重复序列的编码序列(诸如pct/us2016/013733所描述的一者)。
227.在某些具体例中，所述方法还包括在向所述受试者施用如此生产的raav前，通过使用主题rhsv载体和互补系统的本发明的方法生产所述raav。
228.实施例
229.实施例1 rhsv和rchsv的检测
230.此处描述两种测定法，可利用于确定hsv原液中和最终aav原液中rhsv和rchsv的存在。
231.在一测定法中，在生产icp27的v27细胞上测定hsv原液，以确定rhsv的噬斑形成单位(pfu)滴度(其繁殖取决于反式供应的icp27)。同时，还在不生产icp27的vero细胞上测定相同的hsv原液，以评估任何rchsv的存在(其繁殖不依赖于反式供应的icp27)。
232.这种测定法基于以下事实：在细胞核中复制后，rhsv或rchsv诱导致细胞病变(cytopathic effect，cpe)，导致被感染的细胞形成噬斑(ye等人,2014；adamson-small等人,2016)。
233.建立剩余的hsv检测以确保尽可能低的检测极限。目前，已有描述检测极限低至10至20pfu/ml(kang等人,2009；ye等人,2011)。
234.或者，或另外，icp27的基于pcr的第二个测定法利用来检测rhsv和/或rchsv。这种测定法的一个主要限制是此测定不会表明病毒颗粒是否有感染性。然而，连续传代可揭示检测到的信号是否随时间放大，这有助于确定粒子是否有复制能力和/或感染性。
235.实施例2新icp27表达盒设计
236.此处描述数种编码icp27表达盒的dna序列，有用于产生新的贴壁vero、无血清悬浮液适应型bhk细胞系或任何其他允许疱疹感染并因此支持其增殖的细胞。
237.这种新icp27补充细胞，如果用于增殖具有编码icp27的ul54基因的完整缺失的新复制缺陷rhsv-1病毒/载体，则产生复制型rchsv的可能性非常低(如果有的话)。新icp27补充细胞也可用于增殖目前使用的基于d27-1 rhsv的载体，原因为病毒基因组与新贴壁vero或无血清悬浮液适应型bhk细胞系的细胞基因组中的整合icp27基因之间的序列重叠较小。
238.在主题新的贴壁vero或无血清悬浮液适应型bhk细胞系中增殖具有编码icp27的ul54基因的完整缺失的新复制缺陷rhsv-1病毒/载体，其中整合到细胞基因组的icp27基因与具有完整ul54基因缺失的rhsv病毒基因组之间将没有重叠。这得以生产不含或实质上不含任何复制型rchsv病毒的rhsv原液。
239.下文更详细地描述编码较小icp27表达盒的dna序列(即，比v27、2-2或b130细胞中约2.4kb的icp27表达盒小)。
240.seq id no:1(2,188nts)为包含1951nts的hsv-1(kos 1.1)ul54基因的dna序列(基因库登录号kt887224；nts:113,139至115,089)的多核苷酸序列，其包含412nts的ul54启动子；1,539nts的与hsv-1 kos 1.1相同的icp27 orf序列，编码icp27 hsv-1株kos 1.1icp27肽(seq id no:10；genpept登录号aaf43147)；和237nts的多个限制位点接头和牛生长激素多聚腺苷酸化(bgh多(a))信号序列。相似的序列可包含以来自其他合适来源的任何多(a)信号序列替换bgh多(a)信号序列，诸如合成序列或来自其他真核生物基因或病毒的序列。
241.seq id no:2(2,188nts)为包含1629nts的hsv-1(kos 1.1)ul54基因的dna序列(基因库登录号kt887224；nts:113,139至114,767)的多核苷酸序列，其包含412nts的ul54启动子；与hsv-1kos 1.1相同的icp27 orf序列的前1217nts，和剩余的322nts的icp27密码子优化序列，编码icp27 hsv-1株kos 1.1icp27肽(seq id no:10；genpept登录号aaf43147)；和237nts的多个限制位点接头和bgh多(a)信号序列。相似的序列可包含以来自其他合适来源的任何多(a)信号序列替换bgh多(a)信号序列，诸如合成序列或来自其他真核生物基因或病毒的序列。
242.seq id no:3(2,188nts)为包含412nts的hsv-1(kos 1.1)ul54基因的dna序列(基因库登录号kt887224；nts:113,139至113,550)的多核苷酸序列，其包含412nts的ul54启动子；完整1,539nts的密码子优化的hsv-1 icp27 orf序列，编码icp27 hsv-1株kos 1.1icp27肽(seq id no:10；genpept登录号aaf43147)；和237nts的多个限制位点接头和牛bgh多(a)信号序列。相似的序列可包含以来自其他合适来源的任何多(a)信号序列替换bgh多(a)信号序列，诸如合成序列或来自其他真核生物基因或病毒的序列。
243.seq id no:4(2,447nts)为包含与在v27细胞中相同的dna序列的多核苷酸序列(rice and knipe,1990)，其构成为2,447nts的hsv-1(kos 1.1)ul54和ul55基因的dna序列(基因库登录号kt887224；nts:113,139至115,585)，包含412nts的ul54启动子；1,539nts的与hsv-1kos 1.1相同的icp27 orf序列，编码icp27 hsv-1株kos 1.1icp27肽(seq id no:10；genpept登录号aaf43147)；和496nts的hsv-1ul55基因序列。
244.seq id no:5(2,314nts)为包含1,753nts的hsv-1(kos 1.1)ul54基因的dna序列
(基因库登录号kt887224；nts:113,013至114,765)的多核苷酸序列，其包含538nts的完整ul54启动子；与hsv-1 kos 1.1相同的icp27 orf序列的前1215nts，和剩余的324nts的icp27密码子优化序列，编码icp27 hsv-1株kos 1.1icp27肽(seq id no:10；genpept登录号aaf43147)；和237nts的多个限制位点接头和bgh多(a)信号序列。相似的序列可包含以来自其他合适来源的任何多(a)信号序列替换bgh多(a)信号序列，诸如合成序列或来自其他真核生物基因或病毒的序列。
245.seq id no:6为包含hsv-1(kos 1.1)ul54基因的dna序列(基因库登录号kt887224；nts:113,139至113,550)的多核苷酸序列，其包含412nts的ul54启动子；完整1,539nts的密码子优化的hsv-1 icp27 orf序列，编码icp27 hsv-1株kos 1.1icp27肽(seq id no:10；genpept登录号aaf43147)；多个限制位点接头和bgh多(a)信号序列。相似的序列可包含以来自其他合适来源的任何多(a)信号序列替换bgh多(a)信号序列，诸如合成序列或来自其他真核生物基因或病毒的序列。
246.seq id no:7为包含hsv-1(kos 1.1)ul54基因的dna序列(基因库登录号kt887224；nts:113,139至113,550)的多核苷酸序列，其包含412nts的ul54启动子；完整1,539nts的密码子优化的hsv-1 icp27 orf序列，编码icp27 hsv-1株kos 1.1icp27肽(seq id no:10；genpept登录号aaf43147)；和237nts的多个限制位点接头和bgh多(a)信号序列。相似的序列可包含以来自其他合适来源的任何多(a)信号序列替换bgh多(a)信号序列，诸如合成序列或来自其他真核生物基因或病毒的序列。
247.seq id no:8(2,314nts)为包含2,077nts的hsv-1(kos 1.1)ul54基因的dna序列(基因库登录号kt887224；nts:113,013至115,089)的多核苷酸序列，其包含538nts的完整ul54启动子；1,539nts的与hsv-1 kos 1.1相同的icp27 orf序列，编码icp27 hsv-1株kos 1.1icp27肽(seq id no:10；genpept登录号aaf43147)；和237nts的多个限制位点接头和牛生长激素多聚腺苷酸化(bgh多(a))信号序列。相似的序列可包含以来自其他合适来源的任何多(a)信号序列替换bgh多(a)信号序列，诸如合成序列或来自其他真核生物基因或病毒的序列。
248.seq id no:9(2,188nts)为包含1,644nts的hsv-1(kos 1.1)ul54基因的dna序列(基因库登录号kt887224；nts:113,139至114,782)的多核苷酸序列，其包含412nts的ul54启动子；与hsv-1 kos 1.1相同的icp27 orf序列的前1232nts，和剩余的307nts的icp27密码子优化序列，编码icp27 hsv-1株kos 1.1icp27肽(seq id no:10；genpept登录号aaf43147)；和237nts的多个限制位点接头和bgh多(a)信号序列。相似的序列可包含以来自其他合适来源的任何多(a)信号序列替换bgh多(a)信号序列，诸如合成序列或来自其他真核生物基因或病毒的序列。
249.seq id no:10为icp27 hsv-1株kos 1.1icp27肽(seq id no:10；genpept登录号aaf43147)的多肽序列。
250.实施例3 icp27互补测定
251.为了测试新icp27表达构建体支持rhsv复制的能力，进行了一系列互补实验。具体而言，bhk21细胞以0.1moi的rhsv感染，同时以质粒转染，所述质粒带有seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5或无关的gfp质粒对照序列。转染24小时后，以pbs洗涤细胞以去除转染混合残留物。接着于每个孔中加入新鲜培养基。在感染72小
时后收集细胞上清液样本，并使用标准噬菌斑测定在v27细胞单层上滴定(参见实施例1)。互补实验的结果示于图1。
252.结果表明，所有分析的icp27表达构建体都能够以相似的效率支持rhsv复制。
[0253][0254]
实施例4新cp27表达细胞系bhk-27和vero-27的产生
[0255]
bhk-27和vero-27细胞系和相关细胞系通过以带有icp27序列的质粒分别转染bhk-21或vero细胞，或通过以带有由seq id no:1、2、3、5、6、7、8或9定义的icp27序列的第三代慢病毒载体感染这些细胞而产生。在遗传霉素选择下分离稳定克隆，并通过免疫印迹(western blot)测试icp27表达和通过标准噬斑测定测试rhsv产生。
[0256]
bhk-27克隆之一，称为bhk153，用于下述实施例8。
[0257]
实施例5在bhk-27和vero-27中生产rhsv
[0258]
分离的稳定bhk-27或vero-27细胞克隆以0.1moi的d27-1 rhsv感染并培育72小时。通过标准噬斑测定确定细胞上清液中的rhsv滴度。代表性结果表明，鉴定出的阳性克隆生产高水平的rhsv(诸如克隆#16、50、63、110和153)(图2)。
[0259]
实施例6从在bhk-27和vero-27中生产的rhsv生产aav载体
[0260]
raav载体通过以编码具有goi的raav基因组或aav rep/cap表达盒的两种rhsv载体，以2moi共感染hek 293或bhk-21细胞而生产。在感染72小时后收获raav载体。
[0261]
实施例7具有ul54基因完整缺失的rhsv-1基因组
studies.human gene therapy 20:796-806,2009，全部内容以引用方式并入本文)。
[0271]
实施例8具有完整icp27缺失的rhsv载体的生产
[0272]
在此实验中，通过使用电转感受态大肠杆菌中的同源重组，将整合到细菌人工染色体(bac)载体(hsv-1 kos 1.1-bac)中的野生型hsv-1 kos 1.1菌株基因组的icp27基因(ul54)，包含其启动子和编码序列，均完全删除。使用实施例1中描述的v27和vero细胞噬斑测定测试在ul54基因中具有2.1kb(2,077bp)缺失的四个独立分离的icp27缺失hsv-1-bac克隆，用以显示通过这些icp27缺失的hsv-1-bac克隆，可达成基本上没有rchsv污染的icp27缺失hsv-1病毒的稳健生产。四个克隆中的两个代表性结果，克隆#3和克隆#4，分别显示于图3和4。
[0273]
具体而言，首先根据本发明，通过在电转感受态大肠杆菌中使用同源重组以完整删除icp27基因(ul54)。
[0274]
电转感受态大肠杆菌中的同源重组技术是基于同源重组和位于靶dna序列两侧的每侧约50bp的同源性区域。这种系统可通过删除靶dna来修改靶dna，诸如bac载体上的野生型hsv基因组，特别是icp27基因。
[0275]
这种电转感受态大肠杆菌菌株的一者为dy380，其源自dh10b大肠杆菌菌株。这种菌株的另一者为sw102，其源自dy380。sw102中的半乳糖操纵子已被修改，因此其功能齐全，除了半乳糖激酶基因(galk)已被删除，但可反式添加galk功能，从而恢复以半乳糖作为碳源的生长能力。这形成sw102中基于galk的选择的生物学基础。
[0276]
基于galk的选择是两步系统，包括阳性选择和阴性选择。首先，在阳性选择步骤中，通过同源重组将包含与bac中特定位置(诸如icp27基因座)的同源性(例如每侧至少50bp)的galk盒插入至bac中。然后，所得的重组细菌能够在以半乳糖作为唯一碳源的基本培养基上生长(阳性选择)。其次，galk盒被与bac载体中galk盒两侧同源的供体序列取代。在以甘油为碳源的基本培养盘上，通过基于对2-脱氧半乳糖(dog)的抗性选择galk盒可鉴定成功的重组体。尽管dog本身是无害的，但galk可将dog磷酸化成2-脱氧半乳糖-1-磷酸，其为不可代谢的中间体，因此对细菌宿主有毒。因此，只有失去galk盒(例如通过重组)的细菌才能存活并成为dog抗性菌落(阴性选择)。
[0277]
使用这种系统，首先通过电穿孔将带有野生型hsv-1 kos 1.1株的bac引入大肠杆菌sw102菌株中。接着，通过pcr扩增产生具有galk编码序列的galk盒，所述galk编码序列的两侧为每侧约50bp的序列，其与icp27基因两侧的基因组区域同源。此处，icp27基因两侧的50bp同源区域被设计为完整消除icp20基因，即2,077bp的hsv-1(kos 1.1)ul54基因的dna序列(基因库登录号kt887224；nts：113,013至115,089)。参见实施例7和seq id no:11。此缺失包含538bp ul54启动子(seq id no:11的第1至538位核苷酸)，和1539bp icp27编码序列(seq id no:11的第539至2077位核苷酸)。
[0278]
同源重组后，进行galk阳性选择，以鉴定用galk盒替换2,077bp icp27基因的重组体。
[0279]
接着，通过使用icp27两侧序列(将kt887224中第113,013位核苷酸上游约50bp连接到kt887224中第115,089位核苷酸下游约50bp)，类似地使用同源重组从bac载体中消除galk。在此步骤之后，进行galk阴性选择，以鉴定缺少galk盒的重组体。所得的bac克隆命名为icp27缺失的hsv-1-bac克隆。四个这样的克隆，即克隆1至4，经过进一步测试以显示它们
支持稳健的rhsv生产的能力，而基本上没有rchsv污染。
[0280]
具体而言，bhk153细胞(参见实施例4)被来自个别icp27缺失的hsv-1-bac克隆(即克隆1至4)的bac dna转染。来自icp27缺失的hsv-1-bac克隆的bac dna序列与稳定整合到bhk153细胞中的icp27基因不共享同源区域，先前已证实其能够为rhsv生产提供icp27功能(参见图2)。转染后约12至13天收集转染的bhk153细胞的裂解物，使用实施例1的方法在6孔板中测定包含rhsv的上清液，以确定v27细胞和vero细胞上的rhsv病毒滴度。克隆3和4在感染2天后的结果分别显示在图3和图4中。
[0281]
显然，具有icp27基因2,077bp缺失的本发明的rhsv载体完全能够支持稳健的rhsv生产。在表达icp27的v27细胞中，四个icp27缺失的hsv-1-bac克隆在所有系列稀释(10-1、10-2、...和10-6)中，均在v27细胞上产生了噬斑。参见图3和图4。在10-6稀释度上有约2至10个噬斑，在10-1和10-2稀释度上观察到致细胞病变(cpe)，彼等分别代表100μl和10μl的收获物。
[0282]
在连续稀释10-1和10-2，vero细胞(缺乏icp27缺失的hsv-1病毒增殖所需的icp27功能)上的四个icp27缺失的hsv-1-bac克隆中的任何一个均未观察到噬斑。参见图3和图4。
[0283]
作为对照，在以先前通过在bhk153细胞上转染hsv-1 kos 1.1-bac dna而产生的野生型hsv-1 kos 1.1-bac病毒感染后，于连续稀释10-1、10-2和10-3的vero细胞上观察到cpe(数据未显示)。
[0284]
实施例9具有完整icp27缺失的rhsv载体的产生和以人肌萎缩蛋白小基因或aav rep/cap编码序列替换tk基因座
[0285]
在此实施例中，实施例8的icp27缺失的hsv-1-bac载体进一步通过同源重组修饰，用目的基因(goi)，诸如人肌萎缩蛋白小基因(微肌萎缩蛋白)，或raav生产所需的任何aav rep/cap表达盒，以替换hsv-1胸苷激酶(tk)基因座(ul23)。合适的生产细胞系与两种rhsv载体(rhsv goi；和rhsvrep/cap)的共感染可用于产生基因疗法用的raav基因疗法载体。
[0286]
将其实现的一种方法是使用如上所述的使用galk选择的两步过程。首先，tk基因座(ul23)通过电穿孔和重组而被galk盒替换。通过使用两个引物的pcr扩增galk盒，每个引物位于galk盒的两侧，并扩增在hsv-1 tk基因座序列(ul23)内的插入位点的每侧至少50bp序列的序列。所得的pcr产物具有galk编码序列，两侧为两个50bp tk同源区域，用于电穿孔和重组。然后将所得的pcr产物引入具有icp27缺失的hsv-1-bac克隆的大肠杆菌sw102(参见实施例8)，以进行同源重组。阳性galk选择导致修饰的icp27缺失的hsv-1-bac基因组，其具有完整icp27缺失和插入至hsv tk基因的galk基因(icp27缺失的hsv-1-bac tkmut/galk+)。
[0287]
在下一步骤中，galk通过电穿孔和重组被goi或rep/cap dna盒替换，从而生成用于raav生产的一对rhsv载体(rhsv goi和rhsvrep/cap)。
[0288]
或者，作为一种不同的方法，在galk标记的rep/cap表达盒或galk标记的goi使用同源重组插入到icp27缺失的hsv tk基因座之前，首先将galk选择性标志插入aav rep/cap表达盒或goi中，以产生galk标记的rep/cap表达盒或galk标记的goi。数据未显示。
[0289]
又或者，可使用生产细胞系(producer cell line，pcl)构建单个rhsv rep/cap载体，以用于aav生产，所述生产细胞系具有两侧为av itr序列的稳定整合的goi盒。
[0290]
这对rhsv载体中的一者具有两侧为aav itr序列的目的基因(goi)。具体而言，目
的基因可为pct/us2016/013733(公开为wo/2016/115543，以引用方式并入本文)所描述的肌萎缩蛋白小基因。这种特定微肌萎缩蛋白基因的一者包括全长肌萎缩蛋白的r1、r16、r17、r23和r24血影蛋白样重复序列的编码序列，彼等受ck8启动子的转录控制，其在本文中称为“ck8-hudys5”。两侧为aav itr序列的目的基因还被电穿孔和重组所需的50bp的同源区域包夹(例如，tk-itr-ck8-hudys5-itr-tk)。整个构建体可携带在质粒上(例如pj234tk-itr-ck8-hudys5-itr-tk-最终)，且在大肠杆菌(以sw102为例)中icp27缺失的hsv-1-bac tkmut/galk+的同源重组之前，所述质粒可通过nrui和zrai进行线性化。在galk阴性选择后，筛选成功重组体的克隆，其中galk已去除，且goi盒已插入tk位置中(icp27缺失的hsv-1-bac tkmut/itr-goi-itr)。此为修饰的rhsv bac载体，包括完整缺失的icp27(ul54)基因和tkmut基因，后者被人肌萎缩蛋白小基因替换，其受ck8启动子的控制且两侧为aav itr序列。
[0291]
此外，可使用生产细胞系(pcl)构建单个rhsv rep/cap载体，以用于aav生产，所述生产细胞系具有两侧为av itr序列的稳定整合的goi盒。
[0292]
在具有galk阴性选择的icp27缺失的hsv-1-bac tkmut/galk+上进行电穿孔和重组后，使用实质上相同的方法，可以将任何aav rep/cap表达盒插入到icp27缺失的hsv-1-bac tkmut/galk+的tk(ul23)基因座中，以生成icp27缺失的hsv-1-bac tkmut/rep/cap。所述rep/cap盒可通过pcr扩增产生，其中使用具有在tk基因座两侧的50bp序列同源区域的引物。
[0293]
在上述构建体中，hsv基因组被插入到pbac质粒中，且插入序列的两侧为loxp序列。通过各个bac载体和cre表达质粒共转染至表达icp27的bhk或vero细胞，bac序列可从icp27缺失的hsv-1-bac tkmut/itr-goi-itr和icp27缺失的hsv-1-bac tkmut/rep/cap骨架中去除。缺少bac序列的后代病毒的噬斑纯化生成病毒icp27缺失的hsv-1 tkmut/itr-goi-itr和icp27缺失的hsv-1 tkmut/rep-cap。
[0294]
举例来说，根据实施例6，可使用这两个rhsv载体生产raav载体。所得的raav载体在itr序列内具有受肌肉特异性ck8启动子控制的人肌萎缩蛋白小基因hudys5，且可容易地用于治疗肌营养不良症的基因疗法。
[0295]
上述过程的轻微变化可包含使用同源重组将任何goi直接替换为任何其他goi。举例来说，在产生icp27缺失的hsv-1 tkmut/itr-goi-itr克隆后，goi可通过galk选择直接被另一个goi替换。举例来说，如果新goi和旧goi的启动子和多(a)区域相同，则它们可作为50bp的最小同源区域来进行同源重组。如果这些序列不同，则可使用间隔区域(spacer regions)(如果它们的长度至少为50bp)。
[0296]
具体而言，假设启动子和多(a)区域相同，首先可通过电穿孔和重组将galk盒插入到icp27缺失的hsv-1 tkmut/itr-goi-itr中，介于goi编码序列的启动子和多(a)序列之间。在galk阳性选择之后，获得icp27缺失的hsv-1 tkmut/itr-启动子-galk-多(a)-itr，其中，在其启动子和多(a)信号序列之间的goi编码序列被galk取代。接着，以来自另一个goi的编码序列通过电穿孔和重组替换icp27缺失的hsv-1 tkmut/itr-启动子-galk-多(a)-itr中插入的galk盒。在galk阴性选择之后，获得icp27缺失的hsv-1 tkmut/itr-goi-itr。
[0297]
类似地，在具有galk阴性选择的icp27缺失的hsv-1 tkmut/galk+上进行电穿孔和重组后，可以将任何aav rep-capx表达盒插入到icp27缺失的hsv-1 tkmut/galk+的被删除
capx-frth。
[0306]
通过各个bac载体和cre表达质粒共转染至vero细胞，icp27缺失的hsv-1-bac tkmut/frtg-itr-goi-itr-frth中两侧为loxp的bac骨架和icp27缺失的hsv-1-bac tkmut/frtg-rep-capx-frth中两侧为loxp的bac骨架均可去除。缺少β半乳糖苷酶的后代病毒的噬斑纯化生成病毒icp27缺失的hsv-1-bac tkmut/frtg-itr-goi-itr-frth和icp27缺失的hsv-1-bac tkmut/frtg-rep-capx-frth。
[0307]
根据实施例6，可使用这两个rhsv载体生产raav载体。所得的raav载体在itr序列内具有任何goi，诸如人肌萎缩蛋白小基因，且可容易地用于治疗肌营养不良症的基因疗法。
[0308]
实施例11通过在icp27补充细胞中的同源重组，然后进行hsv克隆的阿昔洛韦(acyclovir)选择，产生具有完整icp27缺失和aav rep/cap编码序列插入至tk(ul23)基因座的rhsv载体
[0309]
在此实施例中，且类似于实施例9，实施例8的icp27缺失的hsv-1-bac载体进一步通过将raav生产所需的aav rep/cap表达盒插入至其hsv-1 tk基因座(ul23)表达盒来修饰。此实施例与实施例9之间的区别在于同源重组是在真核icp27补充细胞共转染后进行，而不是在合适的大肠杆菌菌株中进行电穿孔，且用于hsv克隆选择的选择性标志是针对具有完整tk基因的克隆的阿昔洛韦(acv)，而不是选择和/或针对中间构建体中的galk盒。
[0310]
类似(如果不相同)的方法也可用于将任何目的基因(诸如人肌萎缩蛋白小基因)或其他基因插入至tk基因座中。
[0311]
具体而言，阿昔洛韦为抗病毒药物，于1974年首次开发，主要用于治疗单纯疱疹病毒感染、水痘、带状疱疹和其他疱疹病毒。其也可用作为实验室试剂。阿昔洛韦为核苷类似物，由疱疹tk酶(胸苷激酶)转化为阿昔洛韦单磷酸酯，然后由宿主细胞激酶转化为阿昔洛韦三磷酸酯(acv-tp)。acv-tp为竞争性抑制剂，使疱疹特异性dna聚合酶失活，从而阻止病毒dna的进一步合成，而不影响正常的细胞过程。
[0312]
使用同源重组，goi(例如人肌萎缩蛋白小基因)或，在这种情况下，aav rep/cap8表达盒的两侧可为围绕hsv tk基因座ul23的同源区域，且用作供体dna以使tk基因在hsv载体中失活。只有因同源重组而失去tk基因功能(并因此同时获得goi或rep/cap盒)的hsv才可在阿昔洛韦的存在下存活。
[0313]
使用这种方法，repcap表达盒两侧为约50bp的同源区域，在表达盒每侧围绕着hsv tk基因座，所述表达盒基于22.5μg/ml的阿昔洛韦选择，以用于使icp27缺失的hsv-1-bac载体上的tk基因座(ul23)失活。具体而言，v75.4细胞，一种vero衍生的细胞系，其表达与icp27缺失的hsv-1-bac载体没有重叠序列的功能性icp-27基因，将此细胞以icp27缺失的hsv-1-bac载体(用cre预处理)和包含供体dna的质粒共转染，所述供体dna含有repcap8表达盒，两侧各为围绕hsv tk基因座的约50bp同源区域。然后将v75.4细胞在22.5μg/ml阿昔洛韦的存在下培养，以选择可能通过同源重组灭活hsv tk基因座的克隆。在感染3至7天后(3至7dpi)观察到阿昔洛韦抗性克隆，且通过qpcr测定证实了repcap8表达盒的存在。
[0314]
当将goi插入至本发明的icp27缺失的hsv-1-bac载体的tk基因座中时，也可以使用相同的选择方案，所述goi的两侧为aav itr序列，诸如两侧为aav itr序列的迷你肌萎缩蛋白(minidystrophin)表达盒。
[0315]
然后，根据实施例6，可使用这两个rhsv载体生产raav载体。所得的raav载体在itr序列内具有任何goi，诸如人肌萎缩蛋白小基因，且可容易地用于治疗肌营养不良症的基因疗法。
[0316]
实施例12新v75.4细胞系
[0317]
此实施例显示用于生产缺失icp27基因的hsv载体的包装细胞系(v75.4细胞系)的建立。所述包装细胞系包含icp27编码序列，其设计为与本发明的hsv载体没有序列重叠，但icp27基因完整缺失。
[0318]
用于产生v75.4细胞系的亲代细胞系为vero细胞系ccl-81，从美国典型培养物保藏中心(atcc)(manassas,va)获得。vero细胞系为非洲绿猴(cercopithecus aethiops)肾细胞系，其对各种类型的病毒高度敏感，包括单纯疱疹病毒1型(hsv-1)。通过插入核苷酸序列ul54-002(启动子和密码子优化的orf)seq id no:12，由慢病毒质粒产生的慢病毒载体稳定转导vero细胞。稳定整合到v75.4细胞中的icp27表达盒包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element，wpre)序列和来自3'ltr慢病毒序列的慢病毒多腺苷酸化信号，如seq id no:13所示。
[0319]
转导、克隆和细胞系鉴定
[0320]
在37℃、5％co2的加湿co2控制的培养箱中，将vero细胞维持在含有5％fbs的dmem中，再以感染复数(moi)为10的慢病毒载体pr-ul54-002转导。来自这种池的细胞通过不同密度涂布到15cm2的盘中进行克隆，并在37℃、5％co2的加湿co2控制的培养箱中维持在含有10％fbs的dmem中，无需进行选择。2至3周后，通过胰蛋白酶分离单个菌落-主孔(master wells，mw)，并使用克隆圆筒收获。将来自主孔(mw)的细胞接种到24孔盘中，并维持在相同的培养基和条件下。当孔达到汇合时，使用胰蛋白酶分离克隆，并扩展到两个24孔盘(一个用于终端复制品的筛选，一个用于扩展)。将用于hsv生产筛选的培养物的一部分以moi为0.15的δ27hsv感染，并在72小时后收获，并测试hsv ul36拷贝的ddpcr滴度和每毫升噬斑。
[0321]
鉴定出四个表现优异的mw并显示在表1中。
[0322]
表1、表现优异的mws ddpcr(ul36)和每毫升噬斑滴度
[0323]
mw克隆ddpcr滴度(vg/ml)v27滴度(pfu/ml)lv-vero002#283.61e+082.00e+06lv-vero002#364.11e+081.20e+07lv-vero002#755.49e+082.20e+07lv-vero002#764.07e+088.00e+06
[0324]
最终在mw lv-vero002#75(mw75)中发现了最高水平的生产，其被选择用于进一步亚克隆。
[0325]
来自mw75的细胞通过有限稀释进行克隆，以0.3个细胞/孔的密度接种在96孔盘中，培养基和条件与前述相同。目视检查盘，以鉴定仅接种单个细胞的孔。生长一周后，更换培养基，且在达到汇合的孔中，使用胰蛋白酶分离克隆并扩展至24孔盘。当孔达到汇合时，使用胰蛋白酶分离克隆，并扩展到两个24孔盘(一个用于终端复制品的筛选，一个用于扩展)。将用于hsv生产筛选的培养物的一部分以moi为0.15的δ27hsv感染，并在72小时后收获，并测试hsv ul36拷贝的ddpcr滴度。如图5所示，通过ul36 ddpcr选择出表现优异的mw75亚克隆。
[0326]
将亚克隆范围缩小为克隆#4、#20和#24，并评估彼等的生存力、耦合时间和直至传代p26的世代稳定性。δ27hsv病毒的稳定性和产量在mw75克隆#4中是最好的(因此是v75.4细胞系)(图6)，其被选择于本发明的无rc-hsv系统中进一步使用。
[0327]
这些新建立的包装细胞系(包含v75.4)中的icp-27编码序列包含编码icp27蛋白c末端的密码子优化区域。相比于目前广泛使用的d27-1 hsv载体中剩余的icp27编码序列，密码子优化设计为在核酸层级上具有最小的序列同源性。这是为了将产生rchsv病毒颗粒的机会最小化，当传统的d27-1 hsv载体被包装在主题v75.4型包装细胞系中时，因为d27-1 hsv载体上残留的icp27编码序列与主题包装细胞系中的icp27编码序列之间的任何序列重叠将由于密码子简并而减少到67％或更少。
[0328]
事实上，初步结果(数据未显示)表明，当传统的d27-1 hsv载体包装在v75.4细胞系中时，没有产生rchsv病毒颗粒，以至于d27-1 hsv原液中没有rchsv污染。
[0329]
实施例13在v75.4细胞系中制备的hsv制剂中缺乏可检测的rchsv
[0330]
此实施例表明，主题hsv载体和包装细胞系一起使用时，生产的hsv原液中没有可检测的rchsv回复体。
[0331]
具体而言，数种具有完整icp-27缺失的主题hsv载体(本文中的“slb27”载体)，与插入到hsv载体tk基因座中的rep/cap表达盒(slb27-rc9#1、#2和、#3)或两侧为itr序列的goi(slb27-goi#1和#2)进行了测试。这些载体用于感染主题v75.4包装细胞系，以增殖和生产这些载体的第一代(p1)。然后使用p1载体感染v75.4细胞以生产这些载体的第二代(p2)。然后在vero细胞(没有功能性icp27)或v75.4细胞(有功能性icp27)中测试p2代hsv载体，接着使用ddpcr检测可能在主题icp27缺失的hsv载体和宿主细胞(v75.4)中的hsv icp27片段之间发生不期望的重组事件后导致的任何rchsv。
[0332]
在此处使用ddpcr是因为它能够提供每个输入样本的靶dna拷贝的绝对计数，而无需运行标准曲线，具有无与伦比的精度和提高的信噪比。
[0333]
数据显示，在主题v75.4细胞中增殖的任何slb27制剂的p2中或当p2在vero细胞中扩增时，均未检测到rchsv(blq，或“低于定量极限”(below limit of quantification))。事实上，在主题v75.4细胞中增殖至p8代的任何slb27制剂中，vero噬斑测定均未检测到rchsv。
[0334]
作为对照，具有部分icp27缺失和在tk基因座(δ27hsvgoi)中有相似goi插入的传统hsv载体具有显著量的rchsv回复体，尤其是当在vero细胞中测试假定无rchsv的hsv病毒原液时(参见下表)。
[0335]
icp27滴度/毫升培养基的ddpcr结果
[0336][0337]
ddpcr icp27滴度测定的定量极限
[0338]
样本icp27滴度rchsv pfu/mlrchsv稀释度10-1
8.10e+084.50e+07rchsv稀释度10-2
6.66e+074.50e+06rchsv稀释度10-3
6.67e+064.50e+05rchsv稀释度10-4
4.60e+054.50e+04rchsv稀释度10-5
7.70e+044.50e+03rchsv稀释度10-6
blq4.50e+02v75培养基+dna酶blq-仅v75培养基1.72e+05-[0339]
实施例14在v75.4细胞系中增殖时具有完整或不完整icp27缺失的hsv载体的更高滴度
[0340]
此实施例表明，当在诸如v75.4的主题包装细胞系中增殖时，主题hsv载体生产的hsv原液比具有不完整icp27缺失的传统hsv载体具有更高的滴度。
[0341]
此结果令人惊讶，因为相比于仅具有相同基因座部分缺失的传统hsv载体相比，主题hsv载体在icp27基因座处具有更大的基因组缺失。因此，相比于传统的hsv载体，预计主题hsv载体不太“健康”。事实上，先前的研究显示，hsv中比常用的d27-1 hsv株更大的缺失(d27-1株具有部分icp27缺失，在所得的hsv载体中留下了icp27的c端区域编码序列)确实在v27包装细胞系中的生长不佳，受感染的v27细胞需要明显更长的时间才能发育。更重要的是，收获的hsv的病毒滴度低了5到10倍(bunnell,ph.d.thesis,univ.of alberta,2001)。
[0342]
因此，令人惊讶的是，当两者都在主题v75.4包装细胞系中增殖时，相比于传统d27-1 hsv菌株(具有不完整icp27缺失)，具有更大(完整)缺失的主题hsv载体实际上生产了比d27-1更高的滴度。如图7所示，相比于v75.4细胞中的δ27hsv载体，观察到主题slb27载体(参见实施例13)的滴度高出2倍(100％)。注意滴度轴的对数刻度。
[0343]
同样令人惊讶的是，当使用具有完整icp27缺失的主题slb27hsv载体时，相比于受d27-1 hsv载体感染的相同细胞，在受感染的包装细胞(即，在这种情况下，v75.4细胞)中观察到高至非常高百分比的合胞噬斑表型。合胞噬斑是由受感染的细胞与其相邻(未受感染
的)细胞融合而形成，导致多核扩大细胞的形成，此可能导致更有效的hsv生产。合胞噬斑形成可显示为更高的基因组拷贝(通过ddpcr测量)和感染性(噬斑)滴度/ml。
[0344]
事实上，如图8所示，几乎所有以主题slb27 hsv病毒感染的v75.4细胞培养物在第6代(p6)中均发展出合胞噬斑表型。其中一个克隆(slb27-rc9#2)在受感染的v75.4细胞中具有74％的合胞噬斑，另一个克隆(slb27-goi#1)在受感染的v75.4细胞中有75％的合胞噬斑。相比之下，在相同条件下，以d27-1 hsv载体感染的相应v75.4培养物均未表现出合胞噬斑形成。
[0345]
这些令人惊讶的发现表明，hsv载体中icp27的完整缺失，加上包装细胞中互补的icp27编码序列，不仅基本上消除了hsv病毒原液中有害的rchsv生成，而且意外地导致了更有效的hsv病毒生产，可能通过高比例的合胞噬斑形成。
[0346]
实施例15在bhk细胞系中增殖时使用具有完整或不完整icp27缺失的hsv载体制备的aav载体的更高滴度
[0347]
此实施例表明，具有aav rep/cap编码序列或两侧为aav itr序列的goi的主题hsv载体，当用于共感染诸如bhk的合适的aav生产细胞系时，可生产比具有不完整icp27缺失的相似hsv载体所生产的更高的aav滴度。
[0348]
具体而言，本发明的具有完整icp27缺失的两种hsv载体，一种为在tk基因座中具有aav9 rep/cap编码序列，另一种为具有两侧为aav itr序列的肌萎缩蛋白小基因，将彼等在主题v75.4包装细胞系中增殖以收获hsv原液。然后使用收获的hsv原液感染aav生产细胞系bhk，以生产aav颗粒。确定所得的aav滴度，并与使用具有不完整icp27缺失的传统hsv载体(d27hsv)所类似生产的aav进行比较。
[0349]
在每个实验中使用相同数量的病毒或感染复数(moi＝2)和相同数量的细胞(每个实验1
×
106个细胞；每组n＝3)。
[0350]
在用于aav产量实验的δ27hsv-goi#3和δ27hsv-rc9载体中，检测到rchsv和icp27，与之前的发现一致。相比之下，在相应的slb27-rc9#2和slb27-goi#2hsv载体原液中未检测到rchsv污染和icp27。
[0351]
使用于aav生产实验中的hsv原液的ddpcr icp27测定
[0352]
样本icp27滴度slb27-rc9#1blqslb27-rc9#2blqslb27-rc9#3blqslb27-goi#1blqslb27-goi#2blqδ27hsvgoi#1blqδ27hsvgoi#21.24e+06δ27hsvgoi#35.55e+05δ27hsv-rc91.83e+06
[0353]
如图9所示，相比于约2.5
×
109，aav滴度平均约为5.5
×
109。与使用主题hsv载体和包装细胞系相关的高得多的aav滴度可能是由于用于感染bhk生产细胞系的hsv原液中缺乏rchsv或icp27，因为rchsv和icp27可能会抑制aav的生产。
[0354]
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dna和肽序列
[0374]
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