用于多发性硬化的交叉反应表位的制作方法

用于多发性硬化的交叉反应表位
1.交叉引用
2.本专利申请案主张于2019年9月4日提交的编号为62/895,805的美国临时专利申请案的优先权，上述专利中的内容全文以引用方式并入本文。


背景技术：

3.长期以来，人们对操纵免疫系统细胞以控制自身免疫性疾病和其他炎性疾病一事颇感兴趣。常规治疗方法通常不具抗原特异性。例如，常规免疫抑制使用诸如甲泼尼龙、其他类固醇、甲氨蝶呤、克拉屈滨、环磷酰胺之类的药剂。然而，这些疗法实现的整体免疫抑制具有相当大的不良副作用。
4.免疫系统的进一步选择性修饰使用诸如细胞因子阻断剂之类的药剂，例如抗tnfα抗体、可溶性tnfα受体、可溶性il-1受体(阿那白滞素)和抗il-6r抗体(托珠单抗)；t细胞靶向疗法(ctla4-ig[阿巴西普])、b细胞靶向疗法(抗cd20[利妥昔单抗])等。或者，也可以使用抗炎细胞因子，例如干扰素β(ifnβ)-1b(贝他费隆/倍泰龙)。但是，尽管这些疗法更具针对性，但仍然存在对一整类反应的免疫抑制，而非对非预期反应产生特异性免疫抑制。
[0005]
因此，高选择性、抗原特异性疗法的前景虽然难以捉摸，但仍具有吸引力。这种特异性可以潜在地针对非预期免疫反应提供有效治疗，而不影响整个免疫系统群体或反应。初始抗原的鉴定对此以及诊断目的具有临床意义，本文就此进行了讨论。


技术实现要素：

[0006]
本发明提供了与涉及自身免疫性疾病的新型肽有关的组合物和方法。在本文所述的实验中，使用了无偏倚方式来筛选来自多发性硬化(ms)患者的致病性cd4
+ t细胞，并确定由这些致病性细胞表达的所述t细胞受体(tcr)的所述抗原特异性。通过此方法，令人惊讶地发现，存在于人腺病毒中的肽表位能够在mhc相关环境中活化ms致病性t细胞，并且在一些情况下，由此肽活化的所述tcr也与被认为是ms自身免疫反应的靶标的髓鞘碱性蛋白表位(mbp)反应。所述腺病毒氨基酸序列与所述mbp氨基酸序列并不相似，不太可能通过常规筛选方法检测到所述交叉反应性。所述腺病毒和相关肽在本文中可以称之为“交叉反应”肽。
[0007]
尽管不受理论约束，但可以设想，在某些mhc环境(包括但不限于人dr15蛋白)中，t细胞对病毒蛋白的初始反应可能会引起波及到能够活化所述相同tcr的自身抗原(缺乏明显的序列相似性)的反应。
[0008]
激发自身抗原的相关知识可用于开发ms的特异性疗法和诊断，以代替常规使用的非特异性免疫调节。本发明提供了参与ms发展初始阶段的重要候选抗原；并为诊断和治疗干预提供了靶标。
[0009]
本发明提供了用于多发性硬化的交叉反应肽的组合物。在一些实施例中，所述交叉反应肽包含氨基酸序列(序列号：1)atftsyrswyla或其变体或由所述氨基酸序列或其变体组成，例如因1、2、3或更多个氨基酸缺失或取代而改变的肽。在其他实施例中，所述肽包
含氨基酸序列(序列号：2)anygkarswylk、(序列号：3)idrhmyhsylk、(序列号：4)dkgqqyrnwflk或其变体或由所述氨基酸序列或其变体组成，例如因1、2、3或更多个氨基酸缺失或取代而改变的肽。在一些实施例中，所述交叉反应肽包含图2或图4序列号：23-75所示的肽序列或其变体或由所述肽序列或其变体组成，例如因1、2、3或更多个氨基酸缺失或取代而改变的肽。在某些实施例中，变体肽保留着变体从中而来的所述肽的氨基酸序列(即序列号：1；2；3；4；等等)相同的tcr结合特异性和/或亲和力。在其他实施例中，变体肽保留着变体从中而来的所述肽(即序列号：1；2；3；4；等等)的t细胞受体特异性，但亲和力发生了改变。
[0010]
t细胞对交叉反应肽的反应可作为ms的诊断标志物。可以利用多种方法检测增强的t细胞反应，例如筛查体液(包括脑脊液)中交叉反应肽特异性t细胞上的活化标志物，检查特异性t细胞的频率或响应于交叉反应肽的细胞因子产生增强情况。针对体液或细胞交叉反应肽的免疫反应增加可能与ms特异性相关，并用于辅助诊断。
[0011]
可以产生针对以下各项的抗体：交叉反应肽；所述交叉反应肽和人mhc蛋白(包括但不限于dr15蛋白)的复合体；或对如本文所述的交叉反应肽有反应的tcr，例如图1g序列号：5-22或图9序列号：76-83所示的tcr序列。此类抗体在阻断致病性t细胞活化方面可能具有治疗作用。
[0012]
交叉反应肽还可用于耐受策略，例如通过改变的肽配体(apl)减少致病性反应、操纵树突细胞反应、使t细胞反应偏向于非致病性反应等。
附图说明
[0013]
结合附图阅读以下详细说明，可获得对本发明最全面的理解。本专利或申请文件含有至少一张彩色附图。专利局将在必要费用已付的情况下根据要求提供具有彩色附图的本专利或专利申请公开说明书副本。需要强调的是，根据惯例，附图的各个特征未按比例绘制。相反，为了清楚起见，可任意扩大或缩小各个特征的尺寸。附图中包括以下图示：
[0014]
图1a-1g.分析了18例新诊ms患者pbmc和4例健康对照者(hc)pbmc。起初进行了cytof，以确定hc和ms之间的t细胞群体是否存在差异。结果发现，ms患者的大脑归巢活化t细胞的频率较高。我们对其进行了单细胞分选和配对tcr测序，结果发现：1.ms cd8 t细胞大量扩增，2.ms cd4 t细胞极少扩增，3.γδt细胞扩增至与hc相同的水平。我们专注于cd4 tcr特异性，因为ms与dr150101高度相关(20-30％易感性)。为了鉴定抗原特异性，我们利用gliph进行cd4 tcr聚类。使用gliph，我们能够鉴定dr150101 ms个体中富集的cd4 tcr聚类。如上所示，我们挑选了9种基于dr15进行聚类的cd4 tcr用于抗原发现。我们生成了这9种cd4 tcr作为可溶性重组蛋白，并筛选了12mer和15mer dr15酵母文库。(b-e)如上所示，在这9种cd4 tcr中，通过筛选，我们发现4种cd4 tcr(ms-1
–
ms-4 tcr)富集(a647-myc)和四聚体(pe-tcr tet)染色。(a和f)对于一些tcr，我们未发现肽富集(dr15-tcr1和dr15-tcr9)。(g)列出了基于dr15酵母文库进行筛选的cd4 tcr序列(序列号：5-22)的表格。
[0015]
图2.我们生成了ms1-tcr细胞系，将其与负载有酵母文库生成肽的t2-dr15抗原呈递细胞系共培养，并检查其活化情况。cd69用作t细胞活化的标志物。(a)如上所示，大多数文库(序列号：23-52)富集肽刺激ms-1 tcr细胞系。我们使用酵母文库富集数据来预测适用于ms-1 cd4 tcr的实际肽/抗原(自身或非自身)。令人惊讶的是，我们发现，腺病毒肽
(adeno
–
atftsyrswyla，序列号：1)与富集肽几乎相同，它还刺激ms-1 tcr细胞系。
[0016]
图3.除酵母文库肽富集外，还添加了附加层，帮助算法确定野生型肽。基本上，单点突变在最富集的文库肽上发生，并使用这些位置突变肽t细胞刺激数据来更好地生成取代矩阵，此矩阵反过来可用于算法，以检索人蛋白质组中的实际肽。t细胞受体2，tcr2；表达dr15的t2淋巴母细胞系、dr15 t2；髓鞘碱性蛋白，mbp；腺肽，adeno；文库肽，lib-pp；改变的文库肽alibpp。利用此位置突变/改进的取代矩阵数据，我们能够鉴定出适用于tcr2/ms-1 tcr的3种自身肽。
[0017]
图4.使用酵母文库肽(a)上的单点突变，生成了改进的取代矩阵。利用新的取代矩阵(b)，预测候选自身肽，并且使用这些新预测的肽(序列号：53-75)进行ms-1 tcr刺激。
[0018]
图5.利用位置突变/改进的取代矩阵数据，鉴定出适用于tcr2/ms-1 tcr的3种自身肽(序列号：2、3和4)，具体如(a和b)所示。
[0019]
图6.为了检测/确定直接来自ms患者(n＝9)和健康者(n＝9)(a)的腺特异性t细胞，我们生成了pmhc四聚体(b)、富集的以及列举的腺肽特异性cd4。(c)我们能够检测到腺特异性cd4 t细胞，与hc(d)相比，ms患者中的腺特异性cd4 t细胞数量更多。我们还对这些腺特异性cd4 t细胞进行了单细胞分选，对其tcr进行测序，并生成了tcr细胞系(腺特异性tcr)。
[0020]
图7.测试了来自腺四聚体分选的cd4 tcr的tcr细胞系与mbp 85-99肽的交叉反应性。我们还测试了ms-1 tcr与mbp的交叉反应性。用腺肽和mbp刺激腺特异性tcr。(a)tcr2/ms-1 tcr和一些(b)adeno-tcr(adeno-tcr1和9)与mbp肽发生交叉反应。
[0021]
图8.测试了来自ms(n＝28)和hc(n＝10)的血清中的腺病毒滴度。与hc血清相比，ms血清子集的腺病毒滴度更高。
[0022]
图9.dr15 tcr2/ms-1 tcr、dr15-adeno tcr2的tcrαβ序列(序列号：76-83)；adeno tcr9的相应序列；以及mbp、adeno和3种自身肽的肽序列(序列号：84、1-4)。
[0023]
图10.对来自8例ms和5例hc的cd3+ t细胞进行分选，并使用10x平台进行tcr和rna-seq。此外，对于8例ms患者中的4例，对来自脑脊液的t细胞进行了测序。
[0024]
图11.对于8例ms患者中的4例，对来自脑脊液的t细胞进行了测序。在每例ms患者的csf内发现(a)cd4+和(b)cd8+ t细胞克隆扩增。
具体实施方式
[0025]
在描述本发明的方法之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定方法，因为在实际实施中一定会存在差异。还应当理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，而无意限制本发明构思，本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。
[0026]
在提供数值范围的情况下，应当理解，该范围的上限和下限之间的每个中间值以及在该范围内的任何其他规定值或中间值都包含在本发明的范围内。除非上下文另有明确规定，否则每个中间值应低至下限单位的十分之一。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围内，但需遵守所述范围内任何特别排除的限值的要求。如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式的“一”、“一个”和“所述/该”包括复数指代对象，除非上下文另有明确说明。
[0027]
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的
普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文所描述的方法和材料类似或等同的方法和材料也可用于本发明的实施或测试中，但下文描述了首选的方法和材料。本文提及的所有出版物均以引用方式并入本文，以公开和描述与所引用出版物有关的方法和/或材料。
[0028]
本文所讨论的出版物仅供在本专利的申请日之前披露。本文中无任何内容可以解释为承认由于之前的发明使得本发明无权早于此类出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，可能需要单独确认。
[0029]
分子学和细胞生物化学的一般检查方法可参阅以下标准教材：分子克隆：实验室手册，第3版(sambrook等人，harbor laboratory press 2001)；精编分子生物学实验指南，第4版(编辑：ausubel等人，john wiley&sons 1999)；蛋白质方法(bollag等人，john wiley&sons 1996)；用于基因治疗的非病毒载体(编辑：wagner等人，academic press 1999)；病毒载体(编辑：kaplift和loewy，academic press 1995)；免疫学方法手册(编辑：i.lefkovits，academic press 1997)；细胞与组织培养：生物技术实验室程序(doyle和griffiths，john wiley&sons 1998)。本发明中提及的用于基因操纵的试剂、克隆载体和试剂盒可从商业供货商处获得，例如，biorad、stratagene、invitrogen、sigma-aldrich和clontech。
[0030]
为了包含本发明优选的实施方式，已根据发明人发现或提出的特定实施例来描述本发明。本领域技术人员应当理解，根据本发明所述，在不脱离本发明的预定范围的情况下，可对例举的特定实施例做出大量修改和变更。所有这些修改都会包括在所附权利要求的范围内。
[0031]
本发明提供了涉及与自身免疫性疾病相关的免疫原性肽的表征、使用和操纵的组合物和方法。
[0032]
标的方法可用于诊断、预防或治疗目的。本文中使用的术语“治疗”用来指代预防复发和治疗既往病症。例如，自身免疫性疾病的预防可以通过在复发发展之前施用药剂来实现。本文中使用的“治疗”涵盖了哺乳动物，特别是人体疾病的任何治疗，包括：(a)防止受试者患上疾病或出现症状，其中所述受试者可能易患上该疾病或出现该症状但尚未确诊；(b)抑制该疾病症状，即阻止其发展；或(c)减轻该疾病症状，即，使疾病或症状消退。特别受关注的是当前疾病的治疗，其中所述治疗可稳定或改善患者的临床症状。
[0033]“抑制”疾病发作意指减少疾病发作的可能性，或完全防止疾病发作。降低复发的严重程度意指与复发相关的临床指标在治疗情况下的严重程度低于未经治疗的疾病的严重程度。本文中使用的发作可以指患有持续复发缓解疾病的患者的复发。本发明的方法可具体应用于确诊患有炎性疾病(包括，例如自身免疫性疾病)的患者。治疗可以旨在治疗或降低复发的严重程度，复发是指既往病症恶化。
[0034]
本文中使用的“诊断”通常包括：确定受试者对疾病或病症的易感性；确定受试者目前是否受疾病或病症影响；受疾病或病症影响的受试者的预后(例如，鉴定病情、疾病分期、疾病对治疗的反应)；以及治疗措施的使用(例如，监测受试者的状况以提供有关治疗效果或功效的信息)。
[0035]
术语“生物学样本”涵盖从生物体获取的各种样本类型，并且可用于诊断或监测测定。该术语涵盖生物来源的血液、脑脊液和其他液体样本、固体组织样本(例如活检标本)、组织培养物或由其衍生的细胞及其后代。该术语还涵盖在采购后以任何方式处理过的样
本，例如通过试剂、增溶或富集某些成分而处理过的样本。该术语涵盖临床样本，还包括细胞培养物中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物流体和组织样本。
[0036]
术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，是指需要对其进行诊断、治疗或实施疗法的任何哺乳动物受试者，例如人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、豚鼠、兔子等。
[0037]
本文中使用的术语“药剂”包括任何物质、分子、元素、化合物、实体或其组合。它包括但不限于，例如，蛋白质、寡肽、有机小分子、多糖、多核苷酸等。它可以是天然产物、合成化合物或化学化合物或两种或更多种物质的组合。除非另有说明，否则术语“药剂”、“物质”和“化合物”可互换使用。
[0038]“合适的条件”的含义应当取决于此术语的使用环境。也就是说，当与抗体结合使用时，该术语应表示允许抗体与其相应抗原结合的条件。当与使药剂与细胞接触的操作结合使用时，该术语应表示允许能够如此操作的药剂进入细胞并发挥其预期功能的条件。在一实施例中，本文中使用的术语“合适的条件”是指生理条件。
[0039]
在本发明的范围内，“受试者”或“患者”通常是指哺乳动物。人以外的哺乳动物可以有利地用作代表炎症动物模型的受试者。受试者可以是男性/雄性或女性/雌性。
[0040]“分析”包括通过测量样本中的标志物(例如，标志物的存在与否或组成型表达水平)来确定与样本相关的一组值，并将这些测量值与来自同一受试者或其他对照受试者的样本或一组样本的测量值进行比较。特别是，本发明的标志物可通过本领域中已知的各种常规方法中的任何一种来分析。“分析”可包括进行统计分析，以便确定受试者是治疗(例如，实施本文所述的肽治疗)的反应者还是非反应者等事宜。
[0041]“药学上可接受的赋形剂”、“药学上可接受的稀释剂”、“药学上可接受的载体”和“药学上可接受的佐剂”是指可用于制备通常较为安全、无毒且在生物学或其他方面均无不合需求之处的药物组合物的赋形剂、稀释剂、载体和佐剂，包括兽医用途以及人类药物用途可接受的赋形剂、稀释剂、载体和佐剂。本说明书和权利要求书中使用的“药学上可接受的赋形剂、稀释剂、载体和佐剂”包括一种和多于一种的此类赋形剂、稀释剂、载体和佐剂。
[0042]
本文中使用的“药物组合物”意在涵盖适合施用于受试者(例如哺乳动物，尤其是人类)的组合物。通常情况下，“药物组合物”是无菌的，并且优选地，不含能够在受试者体内引起非预期反应的污染物(例如，药物组合物中的化合物是药用级别化合物)。药物组合物可以设计用于通过多种不同的给药途径施用于有相应需求的受试者或患者，所述给药途径包括口服、经颊、直肠、胃肠外、腹膜内、皮内、气管内、肌肉内、皮下给药等。
[0043]“剂量单位”是指适合特定待治疗个体的单一剂量的物理离散单位。每个单位含有预定量的活性化合物，所述活性化合物经计算以产生与所需药物载体相关的治疗效果。剂量单位形式的规格受(a)活性化合物的特征和待实现的治疗效果，以及(b)本领域这种复合活性化合物的局限性影响。
[0044]“药学上可接受的赋形剂”是指可用于制备安全、无毒、预期的药物组合物的赋形剂，包括兽医用途以及人类药物用途可接受的赋形剂。这种赋形剂可以是固体、液体、半固体，或者在气溶胶组合物的情况下为气态。
[0045]“药学上可接受的盐和酯”是指药学上可接受并具有所需药理学性质的盐和酯。这些盐包括可以在化合物中存在的酸性质子，能够与无机或有机碱反应下形成的盐。合适的
无机盐包括用碱金属形成的无机盐，例如钠、钾、镁、钙、铝。合适的有机盐由有机碱如胺碱形成，例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、n-甲基葡糖胺等。此类盐还包括用无机酸(例如盐酸和氢溴酸)和有机酸(例如乙酸、柠檬酸、马来酸以及烷烃和芳烃磺酸如甲磺酸和苯磺酸)形成的酸加成盐。药学上可接受的酯包括由化合物中存在的羧基，磺酰氧基和磷酸氧基形成的酯，例如c
1-6
烷基酯。当存在两个酸性基团时，药学上可接受的盐或酯可以是单酸单盐或酯或二盐或酯；类似地，当存在两个以上酸性基团时，可以盐化或酯化一些或全部的这些基团。本发明中的化合物可以以未盐化或未酯化的形式或以盐化和/或酯化的形式存在，化合物的命名旨在包括原始(未酯化和未酯化)化合物及其药学上可接受的盐和酯。此外，本发明中某些化合物可以以多种立体异构形式存在，这些化合物的命名旨在包括所有单一立体异构体和这种立体异构体的所有混合物(包括外消旋或其他形式)。
[0046]
术语“药学上可接受的”、“生理上可耐受的”及其语法变体是指组合物、载体、稀释剂和试剂可互换使用，这些材料可以施用于人，且不产生阻止组合物施用的不良生理效应。
[0047]“治疗有效量”是指治疗疾病时，施用于受试者且足以治疗该疾病的量。
[0048]
本文中使用的术语“组合”是指使用一种以上的预防剂和/或治疗剂。术语“组合”的使用不限制患有病症的受试者施用预防剂和/或治疗剂的顺序。可以在向患有病症的受试者施用第二预防剂或治疗剂之前(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之前)、伴随或之后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之后)施用第一预防剂或治疗剂。
[0049]
免疫耐受是免疫系统对能够在给定生物体中引发免疫反应的物质或组织无反应的状态。致耐受性方案或制剂是诱发对目的抗原的耐受性的方案或制剂，例如对髓鞘碱性蛋白等自身抗原的耐受性。致耐受性剂量是足以减少对靶抗原的不良免疫反应的药剂的剂量，例如肽、改变的肽配体、dna 载体等。致耐受性dna 构建体是编码致耐受性肽的dna构建体，所述肽可减少对靶抗原的不良免疫反应。致耐受性肽是能够减少对靶抗原的不良免疫反应的肽。
[0050]
可以通过开发用于激活针对抗原的抑制性免疫反应的免疫方案来诱发耐受。根据最初诱发状态的位置——胸腺和骨髓(中枢)或其他组织和淋巴结(外周)，耐受被分类为中枢耐受或外周耐受。
[0051]
免疫耐受涵盖机体因此减少或消除对特定药剂的免疫反应的一系列生理机制。它用于描述符合以下条件的现象：作为区分自身和非自身的基础；抑制过敏反应；允许慢性感染而非排斥和消除；以及防止母体免疫系统对胎儿的攻击。
[0052]
在t细胞和b细胞成熟并进入外周组织和淋巴结后，产生外周耐受。它是由许多部分重叠的机制确立的，这些机制主要涉及t细胞水平的控制，尤其是cd4+辅助性t细胞，其能够协调免疫反应。对某些抗原的反应性可以通过在重复暴露或暴露于某些环境后诱发耐受来降低。在这些情况下，在外周组织或附近淋巴组织(淋巴结、黏膜相关淋巴组织等)中，初始cd4+辅助性t细胞可能分化为诱导性treg细胞(itreg细胞)。
[0053]
其他调节性免疫细胞包括与treg细胞相似但表型不同的t细胞亚群，包括产生il-10但不表达foxp3的tr1细胞、分泌tgf-β的th3细胞以及其他表征不良的有助于建立局部耐
受环境的细胞。
[0054]
病状
[0055]
在一些实施例中，本发明的方法包含治疗、诊断处于患上炎性疾病的“风险”下或处于炎性疾病“早期”的个体或从所述个体中分离出细胞群体。处于患上炎性疾病的“风险”下包括：(1)个体患上炎性疾病的风险增加，以及(2)个体展现“临床前”疾病状态，但不满足炎性疾病的诊断准则(且因而未被正式视为患有炎性疾病)。
[0056]
处于患上炎性疾病的“较高风险”下(也称为处于患病“风险”下)的个体是与一般群体相比患上炎性疾病或炎症相关疾病的可能性较高的个体。此类个体可以基于其展现或具有以下各项中的一项或更多项来鉴别：炎性疾病家族史；存在使个体易感染此类炎性疾病的某些基因变体(基因)或基因变体组合；存在身体表现、实验室检查结果、影像学表现、与患上炎性疾病相关的标志物检测结果(也称为“生物标志物”检测结果)或与患上代谢疾病相关的标志物检测结果；存在与炎性疾病有关的临床征象；存在与炎性疾病有关的某些症状(但个体往往无症状)；存在炎症标志物(也称为“生物标志物”)；以及指示个体在其生命过程中患上炎性疾病或炎症相关疾病的可能性较高的其他表现。处于患上炎性疾病或炎症相关疾病的较高风险之下的大部分个体是无症状的，并且未经历与所述疾病有关的使其处于较高患病风险之下的任何症状。
[0057]
处于患上炎性疾病或炎症相关疾病的较高风险之下的个体群组包括但不限于展现“临床前疾病状态”的个体。疾病前状态可以基于发展症状、身体表现、实验室检查结果、影像学结果和导致个体满足炎性疾病的诊断准则且因而被正式诊断的其他表现加以诊断。患有“临床前疾病”的个体展现表明个体处于患上炎性疾病的过程中的表现，但未展现包括症状、临床表现、实验室表现和/或影像学表现等满足正式诊断炎性疾病的诊断准则所必需的表现。在一些实施例中，展现临床前疾病状态的个体具有基因变体或基因变体组合，这使得所述个体与不具有所述基因变体或所述基因变体组合的个体相比处于较高的患病风险之下。在一些实施例中，这些个体具有使其处于患上炎性疾病的较高风险之下的实验室结果、身体表现、症状或影像学表现。在一些实施例中，具有临床前疾病状态的个体是无症状的。在一些实施例中，具有临床前疾病状态的个体展现某些基因表达、某些蛋白质、炎症标志物、代谢标志物和其他标志物的水平增加或降低。
[0058]
在某些实施例中，本发明涉及治疗患有确定的炎性疾病或炎症相关疾病的个体。炎性疾病可根据个体展现的症状、病征、临床特征、实验室检查结果、影像学检查结果、生物标志物结果和使得医师能够正式诊断所述个体患有炎性疾病的其他表现加以诊断，所述表现可包括检测由本文所揭示的交叉反应抗原肽活化的cd4+ t细胞。
[0059]
在一些实施例中，确立的炎性疾病是个体已被医师正式诊断为患有所述疾病超过6个月的炎性疾病。在确立的炎性疾病中，疾病的病征或症状与例如被诊断为早期炎性疾病的个体的症状相比可能更严重。在确立的炎性疾病中，疾病过程可能造成组织或器官损伤。如本文所述，在某些实施例中，在患有确立疾病的个体中测定炎症可包括分析个体中至少一种指示存在炎症的标志物的存在。
[0060]
炎性疾病被视为展现诸如可见炎症(包括疼痛、肿胀、发热和发红)之类的临床表现(异常临床标志物)的疾病，并且对于本发明，炎性疾病将涉及作为病原体的抗原特异性病理性cd4+ t细胞。炎性疾病包括但不限于自身免疫性疾病，并且可以进一步包括涉及特
定t细胞介导成分的疾病。
[0061]
特别受关注的是中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病，包括但不限于多发性硬化(ms)、视神经脊髓炎(no)和实验性获得性脑炎(eae)。脱髓鞘疾病可能由髓鞘相关蛋白肽引发，例如mog、mbp、mag等。周围神经系统炎性脱髓鞘疾病包括格林-巴利综合征(gbs)及其亚型急性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病、急性运动轴索型神经病、急性运动感觉性轴索型神经病、米勒-费希尔综合征和急性全自主神经障碍；慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(cidp)及其亚型经典型cidp、cidp合并糖尿病、cidp/意义未明的单克隆丙种球蛋白病(mgus)、感觉型cidp、多灶性运动神经病(mmn)、多灶性获得性髓鞘性感觉运动神经病或刘易斯-萨姆纳综合征、多灶性获得性感觉运动神经病以及远端获得性脱髓鞘性感觉神经病。als尽管传统上未归类为炎性疾病，但患此病时cd49e巨噬细胞数量增加，并且可以采用本文所述的方法加以治疗。
[0062]
多发性硬化的特征在于中枢神经系统功能障碍的各种症状和体征，伴有缓解及复发加重。采用本发明的方法进行分析的目的分类包括复发缓解型ms(rrms)、原发进展型ms(ppms)和继发进展型ms(spms)。最常见的症状是一肢或多肢、躯干或面部一侧的感觉异常；腿或手无力或笨拙；或视觉障碍，例如，一只眼睛部分失明和疼痛(眼球后视神经炎)、视力模糊或暗点。其他常见的早期症状是导致双重视野(复视)的眼部麻痹、一肢或多肢的短暂性无力、肢体轻微僵直或异常易疲劳、轻微步态功能障碍、膀胱控制困难、眩晕和轻度情绪障碍；它们均表明分散的中枢神经系统受累，并且经常在疾病被确认之前数月或数年发生。过热可能加重症状和病征。
[0063]
视神经脊髓炎(nmo)或德维克病是一种视神经和脊髓受累的自身免疫性炎性疾病。虽然炎症可能影响大脑，但与多发性硬化不同，这种疾病对治疗有着不同的反应模式，也可能有着不同的自身抗原模式和不同淋巴细胞亚群参与。
[0064]
德维克病的主要症状是视力和脊髓功能丧失。对于视神经炎的其他病因，虽然视野缺损或色觉丧失可能在孤立时或在正式丧失视力之前发生，但视力障碍通常表现为视力下降。脊髓功能障碍可导致肌肉无力、感觉减退或膀胱和肠道控制丧失。脊髓损伤范围从炎性脱髓鞘到白质和灰质坏死性损伤。德维克病的炎性病变被归类为ii型病变(补体介导的脱髓鞘)，但其与ms ii型病变的不同之处在于其主要分布于血管周围。因此，炎症模式通常与ms中所见的截然不同。
[0065]
交叉反应抗原肽的鉴定
[0066]
可从患者中分离出参与自身免疫反应的t细胞。阳性免疫选择利用与诸如t淋巴细胞表面上的cd3、cd4等选择性结合的试剂。任选地进行阴性免疫选择以耗尽其他谱系的细胞，例如b细胞标志物、单核细胞标志物等。大小(例如前向散射)可用于排除除淋巴细胞之外的血细胞。在一些实施例中，在混合物或单独的阴性选择等中使用两种、三种、四种、五种或更多种阴性免疫选择试剂。在一些实施例中，谱系混合物包含用于对髓样细胞、b细胞、cd8
+ t细胞等中的每一种进行阴性选择的试剂。在采用阴性分离的情况下，通常在阳性选择之前进行阴性分离，以去除所述细胞群体中的非预期细胞，然后进行阳性选择。
[0067]
将特异性结合成员(通常是抗体或mhc/肽四聚体)加入细胞悬液中，并孵育一段足以与所述可用抗原结合的时间。所述孵育时间通常至少约为2分钟，且可短于约30分钟。所述反应混合物中需要有足够浓度的抗体，使得分离效率不受试剂缺乏的限制。通过滴定确
定所述适当浓度。
[0068]
分离其中的细胞的所述培养基是任何能维持所述细胞活力的培养基。多种培养基均可在市场上购得，且可以根据所述细胞的性质使用，包括dulbecco改良eagle培养基(dmem)、hank碱性盐溶液(hbss)、dulbecco磷酸盐缓冲盐水(dpbs)、rpmi、iscove培养基、含5mm edta的pbs等。可以将所述细胞置于培养物中，并加以配制以用于治疗、冷冻等。
[0069]
由此获得的组合物在临床治疗、研究、开发和商业中具有多种用途。例如，出于治疗目的，可以任选地在于培养物中扩增之后，施用治疗有效剂量以选择性地抑制非预期致病性t细胞反应。
[0070]
培养物中的扩增或活化可以利用细胞因子和/或抗原呈递细胞(apc)进行。所述接触可以在合适的培养基中进行。如有，apc可以负载合适的肽抗原或蛋白，然后将其呈递于细胞表面。如有，在任何情况下，t细胞与apc的比例范围可以是约1:20至约20:1，并且只要apc的数量不受限制，所述比例便不重要。至多8天、至多10天、至多12天、至多14天的时间可能较为适当(参见，例如，dudley等人，jco 2005；23(10)：2346-2357)。因此激发的t细胞可用于任何预期目的，包括与确定抗原特异性、细胞因子谱等有关的实验目的，以及用于体内传递。
[0071]
可用于体外扩增的细胞因子包括但不限于一种或更多种使cd8+ t细胞增殖增强的细胞因子，其可以包括但不限于i型ifn(ifnα和ifnβ)、il-1、il-2、il-6、il-7、il-12、il-15、il-18、il-21、il-25、il-27、il-33等。可以在常规营养培养基中培养细胞。市售培养基如ham's f10(sigma)、最低必需培养基((mem),sigma)、rpmi 1640(sigma)和dulbecco改良eagle培养基((dmem),sigma)适用于培养所述细胞。这些培养基中的任何一种都可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(例如hepes)、核苷(例如腺苷和胸苷)、抗生素、微量元素和葡萄糖或等效能源。任何其他必需的补充剂也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包括在内。培养条件，例如温度、ph等，是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的培养条件，并且对于普通技术人员而言是显而易见的。
[0072]
离体t细胞活化可以通过本领域公认的程序实现，包括基于细胞的t细胞活化，基于抗体的活化或使用各种基于珠子的活化试剂的活化。基于细胞的t细胞活化可以通过将t细胞暴露于抗原呈递细胞如树突细胞或人造抗原呈递细胞如经照射的k562细胞来实现。用可溶性抗cd3单克隆抗体基于抗体的t细胞表面cd3分子活化也支持在il-2存在下的t细胞活化。
[0073]
t细胞可以是与表面接触的培养物，所述表面提供刺激cd3 tcr复合物相关信号的试剂(例如抗cd3抗体)和刺激t细胞表面上的共刺激分子的试剂(例如抗cd28抗体)。可以使用市售的t细胞活化试剂实现基于磁珠的t细胞活化，所述t细胞活化试剂包括但不限于ctscd3/28(life technologies,inc.carlsbad ca)或miltenyigmp expact treg磁珠或miltenyi macs gmp transact
tm cd3/28磁珠(miltenyibiotec,inc.)。适合于t细胞培养的条件在本领域中是众所周知的。lin等人(2009)，细胞疗法，11(7)：912-922；smith等人(2015)，临床与转化免疫学，4：e31，2015年1月16日线上发布。将靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如适当的温度(例如37℃)和环境(例如空气和5％co2)。
[0074]
所述选择的t细胞可用作编码tcr的序列来源，其是针对抗原特异性疾病提供的。所述tcr编码序列可以通过任何适宜的方法分离，例如示例中详述的方法。
[0075]
目的tcr可以可溶形式表达，并多聚化以用作选择性结合剂。所述可溶性蛋白可以是单链，或者更多情况下是异二聚体。在一些实施例中，可溶性tcr通过在一种多肽的c端添加生物素受体肽序列来修饰。在所述受体肽处进行生物素化后，所述tcr可以通过与生物素结合配偶体(例如，亲和素、链霉亲和素、traptavidin、中性亲和素等)结合来实现多聚化。所述生物素结合配偶体可包含可检测标记(例如荧光团、质量标记等)，或者可与颗粒(例如顺磁性颗粒)结合)。与所述tcr结合的配体可通过本领域已知的流式细胞术、磁选等加以选择。
[0076]
所述tcr多聚体用于结合测定不同肽抗原组成的文库。所述肽配体的长度为约8至约20个氨基酸，通常为约8至约18个氨基酸、约8至约16个氨基酸、约8至约14个氨基酸、约8至约12个氨基酸、约10至约14个氨基酸、约10至约12个氨基酸。应当理解，完全随机文库代表着非常多的可能组合。在一些方法中，将所述肽锚定于所述mhc结合结构域的残基(在本文中称为mhc锚定残基)处的多样性较为有限。所述锚定残基在所述肽中所处的位置由所述特定mhc结合结构域决定。结合研究表明，其他位置的多样性也较为有限，例如在tcr锚点处。所述文库中存在至少106种、至少107种、更多情况下至少108种不同的肽配体。
[0077]
所述文库中使用的所述mhc蛋白可以源自任何哺乳动物或鸟类；特别受关注的是人hla蛋白。所述hla蛋白包括ii类亚基hla-dpα、hla-dpβ、hla-dqα、hla-dqβ、hla-drα和hla-drβ，尤其是hla-dr15。
[0078]
所述mhc肽结合结构域可以所述正常膜结合蛋白的可溶形式表达。所述可溶形式是通过删除所述跨膜结构域，从而由天然形式衍生而来。为方便起见，截短了蛋白，删除了细胞质和跨膜结构域。在一些此类实施例中，所述结合结构域已经历诱变并针对氨基酸改变进行选择，所述氨基酸改变可提高所述单链多肽的溶解度，而不改变所述肽结合接触点。所述跨膜结构域包括不超过约10个，通常不超过约5个，优选为零个氨基酸。所述删除不会干扰所述结构域与肽配体结合的能力。
[0079]
产生由不同序列组成的文库，并将其插入适合于目的宿主细胞的载体中，其中所述载体可以(但不限于)适合于在酵母细胞中表达，并且其中所述酵母细胞可以经诱导以表达所述多肽文库。引入所述宿主细胞后，诱导所述文库的表达，并使所述细胞维持一段足以使所述文库中的所述多肽实现细胞表面展示的时间。
[0080]
通过将多聚化tcr与表达所述文库的宿主细胞群体组合来选择与所述tcr结合的肽。进行多轮选择，直到所述选定的群体具有高于背景的信号，通常至少进行三轮选择，更多情况下至少进行四轮选择。
[0081]
在最后一轮选择之后，将多核苷酸从所述选定的宿主细胞中分离出来，并确定所述选定肽配体的序列，通常通过高通量测序确定。
[0082]
可用于本发明的测序平台包括但不限于：焦磷酸测序、边合成边测序、单分子测序、第二代测序、纳米孔测序、边连接边测序或边杂交边测序。优选的测序平台是可从illumina(rna-seq)和helicos(数字基因表达或“dge”)处商购获得的测序平台。“下一代”测序方法包括但不限于由以下各方商业化的方法：1)454/roche lifesciences，包括但不限于以下出版物中所述的方法和装置：margulies等人，自然(2005)，437：376-380(2005)；
第7,244,559、7,335,762、7,211,390、7,244,567、7,264,929、7,323,305号美国专利；2)helicosbiosciences corporation(cambridge,ma)，相应方法请见以下出版物：序列号为11/167046的美国专利申请案以及第7501245、7491498、7,276,720号美国专利；编号为us20090061439、us20080087826、us20060286566、us20060024711、us20060024678、us20080213770和us20080103058的美国专利申请出版物；3)applied biosystems(例如，solid测序)；4)dover systems(例如，polonator g.007测序)；5)illumina，相应方法请见以下出版物：第5,750,341、6,306,597和5,969,119号美国专利；6)pacific biosciences，相应方法请见以下出版物：第7,462,452、7,476,504、7,405,281、7,170,050、7,462,468、7,476,503、7,315,019、7,302,146、7,313,308号美国专利；编号为us20090029385、us20090068655、us20090024331和us20080206764的美国申请出版物。所有参考文献均以引用方式并入本文。此类方法和装置在本文中通过举例的方式提供，并非旨在进行限定。
[0083]
如示例所示，如此鉴定的所述肽抗原可以是所述个体中的天然肽；或者可以是特异性地活化致病性t细胞的交叉反应肽。所述肽可用作筛选工具可用作激活耐受性的治疗剂。
[0084]
肽(包括本文所揭示的交叉反应肽)通常包含至少约8个氨基酸、至少约9个氨基酸、至少约10个氨基酸、至少约11个氨基酸、至少约12个氨基酸、至少约13个氨基酸、至少约15个氨基酸或更多，并且其长度可以是约8个氨基酸至约40个氨基酸、约8至约30个氨基酸、约8至约25个氨基酸、约8至约20个氨基酸、约8至约18个氨基酸。肽可以，例如，包含序列号：1-4或序列号：23-75中任一项所示的所提供的氨基酸序列，并且除所述提供的序列外，可以进一步包括本领域已知的融合多肽，其中所述融合配偶体并非天然蛋白序列。可用于本发明的肽还包括天然存在的肽的衍生物、变体和生物活性片段等。所述肽可以，例如，包含1个氨基酸取代、2个氨基酸取代、3个氨基酸取代。所述肽序列可以是因所述不同肽文库的诱变而衍生的设计序列。所述tcr的特异性可能为构象特异性，因此活化目的t细胞的肽可能具有与天然肽基本无关的序列。
[0085]
肽可以加以修饰，例如，与多种其他寡肽或蛋白连接以用于多种目的。例如，翻译后修饰，例如通过异戊二烯化、乙酰化、酰胺化、羧化、糖基化、聚乙二醇化等实现。此类修饰还可包括糖基化的修饰，例如，在多肽的合成和加工中或在进一步加工步骤中，修饰多肽的糖基化模式；例如，将多肽暴露于可影响糖基化的酶，例如哺乳动物糖基化酶或去糖基化酶。在一些实施例中，本发明的变体包括具有磷酸化氨基酸残基的变体，例如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸。
[0086]
如本文提供的示例所示，可以通过诸如所述肽诱导对活化病理性淋巴细胞的细胞毒性作用的能力等来确定肽调节淋巴细胞活性的能力。
[0087]
在一些实施例中，肽以融合蛋白形式提供，例如与第二多肽框内融合。在一些实施例中，所述第二多肽能使所述融合蛋白的大小增加，例如，由此使得所述融合蛋白不会迅速从循环中清除。在一些其他实施例中，所述第二多肽是fc区的一部分或全部。在一些其他实施例中，所述第二多肽是与诸如使得大小增加和/或与ig分子额外结合或相互作用的fc基本相似的任何合适的多肽。这些融合蛋白可促进纯化，且体内半衰期增加。另外，相较于单独的单体分泌蛋白或蛋白片段，具有二硫键连接的二聚体结构(由于所述igg产生)的融合蛋白在结合与中和其他分子方面更为有效。
[0088]
在一些其他实施例中，本发明的肽变体包括经进一步修饰以提高其对蛋白水解的抗性或优化溶解特性或增强其作为治疗剂的适用性的变体。例如，本发明的变体进一步包括含有除天然存在的l-氨基酸以外的残基的类似物，例如含有d-氨基酸或非天然存在的合成氨基酸。d-氨基酸可以取代一些或全部氨基酸残基。
[0089]
可使用本领域已知的常规方法，通过无细胞翻译系统或体外合成途径制备所述多肽。目前有多种市售的合成仪器，例如，applied biosystems,inc.、foster city、calif.、beckman等提供的自动合成仪。可利用这些合成仪，用非天然氨基酸取代天然存在的氨基酸。对于具体的序列以及制备方法，将根据便利程度、经济实用性、所需纯度等进行确定。
[0090]
还可根据重组合成的常规方法对多肽进行分离和纯化。可制备表达宿主的裂解物，并采用hplc、排阻色谱法、凝胶电泳、亲和色谱法或其他纯化技术对裂解物进行纯化。在大多数情况下，考虑到产品制备和提纯方法中涉及到的污染物，所使用的组合物重量将至少为目标产品重量的20％，通常至少约为75％，优选地至少约为95％。在以治疗为目的时，通常至少为目标产品重量的99.5％。通常，根据总蛋白计算上述百分比。
[0091]
与交叉反应肽和识别此类交叉反应肽的tcr相关的抗体
[0092]
可以产生针对以下各项的抗体：交叉反应肽；所述交叉反应肽和人mhc蛋白(包括但不限于dr15蛋白)的复合体；或对如本文所述的交叉反应肽有反应的tcr。此类抗体在阻断致病性t细胞活化方面可能具有治疗作用。本发明中使用的术语“表位”是指抗体的互补位结合的抗原上的任何抗原决定簇。表位决定簇通常由具有化学活性的表面分子簇构成，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。
[0093]
术语“抗体”以广义使用，并且具体而言涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，前提是它们表现出所需的生物活性。“抗体”(ab)和“免疫球蛋白”(ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。虽然抗体表现出对特异性抗原的结合特异性，但免疫球蛋白包括抗体和其他缺乏抗原特异性的抗体样分子。例如，后一种多肽由淋巴系统以低水平产生，并且由骨髓瘤以较高水平产生。
[0094]
本文中使用的术语“抗体”是指包括足以使其与特定靶抗原特异性结合的典型免疫球蛋白序列元件的多肽。如本领域所公知，天然产生的完整抗体是约150kd的四聚体药剂，其由两条相同的重链多肽(各约50kd)和两条相同的轻链多肽(各约25kd)组成，这些多肽彼此缔合形成的结构常称为“y形”结构。每条重链由至少四个结构域(每个长度约为110个氨基酸)组成——一个氨基末端可变(vh)结构域(位于y形结构的末端)，接着是三个恒定结构域：ch1、ch2和羧基末端ch3(位于y茎的基部)。被称为“开关”的短区域连接重链可变区和恒定区。“铰链”将ch2和ch3结构域与抗体的其余部分连接。此铰链区中的两个二硫键在完整抗体中将两个重链多肽彼此连接。每条轻链由两个结构域组成——氨基末端可变(vl)结构域，接着是羧基末端恒定(cl)结构域，这两个结构域通过另一“开关”彼此分开。完整抗体四聚体由两个重链-轻链二聚体组成，其中重链和轻链通过单个二硫键彼此连接；另外两个二硫键将重链铰链区彼此连接，使得二聚体彼此连接并形成四聚体。天然产生的抗体也是糖基化的，通常在ch2结构域上。天然抗体中的每个结构域均具有特征在于由在压缩的反向平行β桶中彼此相对包装的两个β折叠结构(例如，3-、4-或5-链折叠结构)形成的“免疫球蛋白折叠”的结构。每个可变结构域均含有称为“互补决定区”(cdr1、cdr2和cdr3)的三个高变环和四个稍微不变的“框架”区(fr1、fr2、fr3和fr4)。当天然抗体折叠时，fr区形成为结
构域提供结构框架的β折叠结构，并且来自重链和轻链的cdr环区在三维空间中聚集在一起，使得它们产生位于y结构顶端处的单个高变抗原结合位点。
[0095]
天然存在的抗体的fc区与补体系统的元件结合，并且与效应细胞(包括例如介导细胞毒性的效应细胞，特别是adcp)上的受体结合。如本领域所公知，fc区对fc受体的亲和力和/或其他结合属性可通过糖基化或其他修饰来调节。在一些实施例中，根据本发明产生和/或利用的抗体包括糖基化的fc结构域，包括具有修饰的或工程化的此类糖基化的fc结构域。出于本发明的目的，在某些实施例中，包括在天然抗体中发现的足够的免疫球蛋白结构域序列的任何多肽或多肽复合体可被称为和/或用作“抗体”，无论此类多肽是天然产生的(例如，由生物体与抗原反应产生)，还是通过重组工程、化学合成或其他人工系统或方法产生的。在一些实施例中，抗体是多克隆抗体；在一些实施例中，抗体是单克隆抗体。
[0096]
在一些实施例中，抗体具有小鼠、兔、灵长类动物或人抗体特有的恒定区序列。在一些实施例中，如本领域所公知，抗体序列元件是人源化的、灵长类化的、嵌合的等。
[0097]
此外，本文中使用的术语“抗体”在适当的实施例中(除非另有说明或从上下文中清楚得知)指任何本领域已知的或开发的构建体或形式，用于在可替代呈递中利用抗体结构和功能特征。例如，在实施例中，根据本发明利用的抗体的形式选自但不限于以下各项：完整igg、ige和igm；双特异性或多特异性抗体(例如等)；单链fvs；多肽-fc融合体；fab；骆驼状抗体；掩蔽抗体(例如)；小模块化免疫药物(“smips
tm”)；单链或串联双抗体vhh；微抗体；锚蛋白重复蛋白或dart；tcr样抗体；microproteins；以及在一些实施例中，抗体可能缺乏天然产生时将具有的共价修饰(例如，聚糖的附着)。在一些实施例中，抗体可以含有共价修饰(例如，聚糖、有效负载(例如，可检测部分、治疗部分、催化部分等)的附着，或其他侧基[例如，聚乙二醇等。
[0098]
示例性抗体药剂包括但不限于人抗体、灵长类化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、人源化抗体、缀合抗体(即与其他蛋白质、放射性标记、细胞毒素缀合或融合的抗体)、小模块化免疫药物(“smips
tm””
)、单链抗体、骆驼抗体和抗体片段。本文中使用的术语“抗体药剂”还包括完整单克隆抗体、多克隆抗体、单结构域抗体(例如，鲨单结构域抗体(例如，ignar或其片段))、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性即可。在一些实施例中，所述术语涵盖订书肽。在一些实施例中，所述术语涵盖一种或更多种抗体样结合肽模拟物。在一些实施例中，所述术语涵盖一种或多种抗体样结合支架蛋白。在一些实施例中，所述术语涵盖单体或adnectin。
[0099]
在许多实施例中，抗体药剂是或包含其氨基酸序列包括由本领域技术人员识别为互补决定区(cdr)的一个或更多个结构元件的多肽；在一些实施例中，抗体药剂是或包含其氨基酸序列包括与参考抗体中所存在的cdr基本上相同的至少一个cdr(例如，至少一个重链cdr和/或至少一个轻链cdr)的多肽。所包括的cdr与参考cdr基本上相同，其中与参考cdr相比，所包括的cdr在序列上相同或含有1-5个氨基酸取代。在一些实施例中，所包括的cdr与参考cdr基本上相同，其中所述包括的cdr与参考cdr的序列同一性至少为85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施例中，所包括的cdr与参考cdr基本上相同，其中所述包括的cdr与参考cdr的序列同
一性至少为96％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施例中，所包括的cdr与参考cdr基本上相同，其中与参考cdr相比，所包括的cdr内的至少一个氨基酸被删除、添加或取代，但所包括的cdr具有以另外的方式与参考cdr的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在一些实施例中，所包括的cdr与参考cdr基本上相同，其中与参考cdr相比，所包括的cdr内的1-5个氨基酸被删除、添加或取代，但所包括的cdr具有以另外的方式与参考cdr相同的氨基酸序列。在一些实施例中，所包括的cdr与参考cdr基本上相同，其中与参考cdr相比，所包括的cdr内的至少一个氨基酸被取代，但所包括的cdr具有以另外的方式与参考cdr的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在一些实施例中，所包括的cdr与参考cdr基本上相同，其中与参考cdr相比，所包括的cdr内的1-5个氨基酸被删除、添加或取代，但所包括的cdr具有以另外的方式与参考cdr相同的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体药剂是或包含其氨基酸序列包括本领域技术人员识别为免疫球蛋白可变结构域的结构元件的多肽。在一些实施例中，抗体药剂是具有与免疫球蛋白结合结构域同源或大部分同源的结合结构域的多肽蛋白。
[0100]“天然抗体和免疫球蛋白”通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由两条相同的轻(l)链和两条相同的重(h)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而不同免疫球蛋白同种型的重链间二硫键数目不同。每条重链和每条轻链也都具有规则排列的链间二硫桥。每条重链在一端均具有可变结构域(vh)，后接多个恒定结构域。每条轻链在一端均具有可变结构域(v
l
)，在其另一端均具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域并列，而轻链的可变结构域与重链的可变结构域并列。据信，特定氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面(clothia等人，分子生物学杂志，186:651(1985)；novotny和haber，美国国家科学院院报，82:4592(1985))。
[0101]
术语“可变的”是指在抗体之间可变结构域的某些部分在序列上有很大差异且用于每个特定抗体对其特定抗原的结合和特异性中。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变结构域中。它集中在轻链和重链可变结构域中称之为互补决定区(cdr)或高变区的三个节段中。可变结构域中更加高度保守的部分称之为框架(fr)。天然重链和轻链的可变结构域均包含四个fr区，它们主要采用b折叠构型，由三个cdr连接，形成环连接且在一些情况下形成b折叠结构的一部分。每条链中的cdr通过fr区紧密连接在一起，并与来自另一条链的cdr共同形成抗体的抗原结合位点(参见kabat等人，免疫目的蛋白序列，第五版，国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出各种效应子功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。
[0102]
抗体经木瓜蛋白酶消化后会产生两个相同的称为“fab”的抗原结合片段和一个残余“fc”片段，每个fab片段具有单个抗原结合位点，fc的名称反映了其容易形成结晶的能力。胃蛋白酶处理产生f(ab')2片段，它有两个抗原结合位点且仍能与抗原交联。
[0103]“fv”是含有完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。在双链fv物种中，此区域由紧密、非共价缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在单链fv物种(scfv)中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可通过柔性肽连接子共价连接，使得所述轻链和重链可以类似于双链fv物种中的“二聚”结构缔合。在此构型中，每个可变结构域中的三个cdr相互作用，以在所述vh-vl二聚体表面界定抗原结合位点。所述六个cdr共同赋予所述抗体抗原结合特异性。然而，尽管亲和力低于整个结合位点，但单个可变结构域(或仅包含三个对抗原具有特异性的cdr的fv的一半)仍具有识别和结合抗原的
能力。有关scfv的综述，请参阅pluckthun，单克隆抗体药理学，第113卷，rosenburg和moore编纂，springer-verlag，纽约，第269-315页(1994)。
[0104]
fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(ch1)。fab'片段与fab片段的不同之处在于在重链ch1结构域的羧基末端添加了少量残基，包括来自抗体铰链区的一个或更多个半胱氨酸。fab'-sh是本文中其恒定结构域的半胱氨酸残基携带游离硫醇基团的fab'的名称。f(ab')2抗体片段最初作为成对的fab'片段生成，它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
[0105]
免疫球蛋白主要有五大类：iga、igd、ige、igg和igm，这些类别中的一些可进一步分为亚类(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1、iga2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定结构域分别称为a、d、e、g和m。不同类别免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是众所周知的。此术语还涵盖免疫球蛋白亚类的工程化变体，包括使免疫效应功能、半衰期或血清稳定性提高或降低的变体。
[0106]
本文中使用的“抗体片段”及其所有语法变体被定义为完整抗体的一部分，其包含完整抗体的抗原结合位点或可变区，其中所述部分不含完整抗体fc区的恒定重链结构域(即，ch2、ch3和ch4，具体取决于抗体同种型)。抗体片段的示例包括fab、fab'、fab'-sh、f(ab')2和fv片段；双抗体；任何抗体片段，即初级结构由连续氨基酸残基的一个不间断序列构成的多肽(本文称为“单链抗体片段”或“单链多肽”)，包括但不限于(1)单链fv(scfv)分子；(2)仅含有一个轻链可变结构域或其片段(含有所述轻链可变结构域的三个cdr)的单链多肽，无相关重链部分；以及(3)仅含有一个重链可变结构域或其片段(含有所述重链可变结构域的三个cdr)的单链多肽，无相关轻链部分；以及由抗体片段形成的多特异性或多价结构。在包含一条或更多条重链的抗体片段中，重链可含有在完整抗体的非fc区中发现的任何恒定结构域序列(例如，igg同种型中的ch1)，和/或可含有在完整抗体中发现的任何铰链区序列，和/或可含有与重链的铰链区序列或恒定结构域序列融合或位于其中的亮氨酸拉链序列。
[0107]
本文中使用的术语“单克隆抗体”(mab)是指从基本上同种的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能少量存在的可能的天然突变外，构成所述群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体具有高度特异性，可针对单个抗原位点。各mab仅针对所述抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，所述单克隆抗体的优势在于它们可在不受其他免疫球蛋白污染的情况下通过杂交瘤培养合成。修饰语“单克隆”表示从基本上同种的抗体群体中获得的抗体的特征，不应解释为需要通过任何特定方法来制备所述抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以在永生化b细胞或其杂交瘤中制备，或者可以通过重组dna方法制备。
[0108]“分离的”抗体是指已经鉴定且从其天然环境的组分中分离和/或回收的抗体。其自然环境的污染物组分是干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施例中，将所述抗体纯化至(1)经lowry法测定，75％以上(按抗体重量计)，最优选80％、90％或99％以上(按重量计)，或(2)根据还原性或非还原性条件下的sds-page及使用考马斯蓝或优选的银染色，达到同质。由于所述抗体的天然环境中至少有一种组分缺失，因此分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常通过至少一个纯化步骤来制备。
[0109]
术语“特异性结合”、“特异性地结合”等是指相对于溶液或反应混合物中的其他分
子或部分，优先与分子非共价或共价结合(例如，抗体相对于其他可用的多肽，与特定多肽或表位特异性结合)。在一些实施例中，一个分子对与其特异性结合的另一种分子的亲和力的特征在于kd(解离常数)为10-5
m或更低(例如10-6
m或更低、10-7
m或更低、10-8
m或更低、10-9
m或更低、10-10
m或更低、10-11
m或更低、10-12
m或更低、10-13
m或更低、10-14
m或更低、10-15
m或更低或10-16
m或更低)。“亲和力”是指结合强度，结合亲和力增加与kd降低有关。
[0110]
本文中使用的术语“特异性结合成员”是指特异性结合对的成员(即，两个分子，通常是两个不同的分子，其中一个分子(例如第一特异性结合成员)以非共价方式与另一个分子(例如，第二特异性结合成员)特异性结合)。
[0111]
治疗和诊断
[0112]
本文所揭示的肽或抗体可以适合于治疗用途的药物组合物形式提供，例如，适于人体治疗的药物组合物。在一些实施例中，药物组合物包括一种或更多种本发明的治疗实体或药学上可接受的盐、酯或其溶剂化物。在一些其他实施例中，本发明的药物组合物包括一种或更多种与另一治疗剂联合施用的本发明的治疗实体。
[0113]
治疗实体通常以包含活性治疗剂和另一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物形式给药。优选的剂型取决于预期的给药方式和治疗应用。基于所需制剂，所述组合物还可以包括药学上可接受的无毒载体或稀释剂，其定义为通常用于配制用于动物或人给药的药物组合物的载体。选择稀释剂以免影响所述组合的生物活性。此类稀释剂的示例是蒸馏水、生理磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和hank’s溶液。另外，所述药物组合物或制剂还可以包括其他载体或无毒、非治疗性、非免疫原性稳定剂等。
[0114]
在一些其他实施例中，药物组合物还可以包括缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多糖如壳聚糖、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚物(例如胶乳官能化的sepharose.tm.、琼脂糖、纤维素等)、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和脂质聚集体(例如油滴或脂质体)。
[0115]
还提供了联合疗法，其中所述联合可提供附加或协同获益。肽或抗体可与选自常用于自身免疫性疾病的非抗原特异性治疗的通用类药物(包括皮质类固醇和疾病修正治疗药物)中的一种或更多种或抗原特异性药剂的第二药剂联合施用。皮质类固醇(例如泼尼松、甲基泼尼松、泼尼松龙、solumedrol等)具有抗炎和免疫活性。它们可以全身给药或局部注射。皮质类固醇可以在等待疾病修正治疗药剂发挥作用时作为临时辅助治疗药物用于早期疾病。皮质类固醇也可用作重症患者的慢性辅助治疗药物。
[0116]
疾病修正治疗药物也可用于联合治疗。这些药剂包括甲氨蝶呤、来氟米特依那西普、英夫利西单抗、阿达木单抗、阿那白滞素、利妥昔单抗、ctla4-ig(阿巴西普)、抗疟药、金盐、柳氮磺胺吡啶、d-青霉胺、环孢素a、环磷酰胺硫唑嘌呤；等等。ms治疗方案可能包括干扰素β、克帕松和抗vla4，这些药物可以降低复发率。ms也用免疫抑制剂治疗，包括甲泼尼龙、其他类固醇、甲氨蝶呤、克拉屈滨和环磷酰胺。
[0117]
联合治疗可以按顺序分阶段进行，可以合用制剂形式提供，或者可在同一时间段内伴随施用。已知治疗药物与本发明的药物组合物“伴随施用”是指在已知药物和本发明的组合物均具有治疗效应的时间施用所述药物和肽。这种伴随施用可能涉及在本发明的化合物施用的同时(即同一时间)、之前或之后施用药物。本领域普通技术人员将难以确定本发明的特定药物和组合物的适当给药时间，顺序和剂量。
[0118]
肽或抗体可作为经配制以用于治疗如上所述的多种病症的药物组合物中的活性
成分。所述活性成分以治疗有效量存在，治疗有效量即为施用时足以治疗疾病或由此介导的医学病症的量，尤其是通过降低炎性淋巴细胞活性加以治疗的量。所述组合物还可以包括多种其他试剂，以增强递送和疗效，例如，以增强活性成分的递送和稳定性。
[0119]
因此，例如，基于所需制剂，所述组合物还可以包括药学上可接受的无毒载体或稀释剂，其定义为通常用于配制用于动物或人给药的药物组合物的载体。选择稀释剂以免影响所述组合的生物活性。这种稀释剂的示例是蒸馏水、缓冲液、生理盐水、pbs、林格氏溶液、右旋糖溶液和汉克氏溶液。另外，所述药物组合物或制剂还可以包括其他载体；无毒、非治疗性、非免疫原性稳定剂；赋形剂；等等。所述组合物还可以包括与生理条件接近的其他物质，例如ph调节和缓冲剂、毒性调节剂、润湿剂和清洁剂。所述组合物还可以包括多种稳定剂中的任何一种，例如抗氧化剂。
[0120]
所述肽可与增强所述多肽在体内的稳定性或以其他方式增强其药理学性质(例如，增加所述多肽的半衰期、降低其毒性、增强溶解度或吸收)的多种众所周知的化合物复合。此类修饰剂或复合剂的示例包括硫酸盐、葡糖酸盐、枸橼酸盐和磷酸盐。组合物中的所述多肽也可与增强其体内属性的分子复合。此类分子包括，例如，碳水化合物、多胺、氨基酸、其他肽、离子(例如钠、钾、钙、镁、锰)和脂质。
[0121]
有关适用于多种给药类型的制剂的进一步指南请参阅以下出版物：雷明顿药学大全，mace publishing company，宾州费城，第17版(1985)。关于药物递送方法的简要综述，请参阅以下出版物：langer，科学，249：1527-1533(1990)。
[0122]
可以施用所述药物组合物进行预防性和/或治疗性治疗。可按照细胞培养和/或实验动物中包括诸如用于确定ld
50
(50％群体致死的剂量)和ed
50
(50％群体中治疗有效的剂量)的程序在内的标准制药程序来确定所述活性成分的毒性和疗效。毒性和疗效之间的剂量比为治疗指数，其可表述为ld
50
/ed
50
比率。优选表现出大治疗指数的化合物。
[0123]
从细胞培养和/或动物研究中获得的数据可用于明确人用剂量范围。所述活性成分的剂量通常在循环浓度范围内，所述范围包括毒性很小或无毒性时的ed
50
。所述剂量可在此范围内根据所用剂型和给药途径而变化。
[0124]
本文所述的药物组合物可以多种不同方式给药。示例包括通过口服、鼻内、直肠、局部、腹膜内、静脉内、肌内、皮下、真皮下、透皮给药方法施用含有药学上可接受的载体的组合物。
[0125]
适合胃肠外给药(例如，通过静脉、肌内、真皮内、腹膜内和皮下给药途径)的制剂包括水和非水等渗无菌注射溶液，此类注射液可含有抗氧剂、缓冲剂、抑菌剂以及使所述制剂与预定的受体血液等渗的溶质；以及水和非水无菌混悬液，此类混悬液可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。
[0126]
用于配制药物组合物的组分优选地具有高纯度且基本上不含潜在有害污染物(例如，至少国家食品(nf)级，通常至少为分析级，更为典型的是至少医药级)。此外，体内使用的组合物优选地为无菌组合物。在须于使用前合成给定化合物的情况下，所得产物优选地基本上不含任何潜在毒性剂，例如在合成或纯化过程中可能存在的任何内毒素。用于胃肠外给药的组合物也优选地为无菌、基本上等渗的组合物，且在gmp条件下制备。
[0127]
所述肽组合物可以单剂量或多剂量给药，通常是在一段时间内多剂量给药，例如每天一次、每隔一天一次、每周一次、每半周一次、每月一次等，持续一段足以使所述炎性疾
病的严重程度降低的时间，所述给药方式可包含1、2、3、4、6、10或更多次剂量给药。
[0128]
可使用常规计算方法，基于动物数据确定治疗或预防有效量。在一实施例中，所述治疗或预防有效量含有约0.1mg至约1g的蛋白。在另一实施例中，所述有效量含有约1mg至约100mg的蛋白。在进一步实施例中，所述有效量含有约10mg至约50mg的蛋白。所述有效剂量至少部分取决于给药途径。所述剂量可以是约0.1μg/kg患者体重、约1ug/kg患者体重、约10ug/kg患者体重至约100μg/kg患者体重。
[0129]
在使用方法中，有效剂量的本发明的药剂单独施用或与另外的活性药剂联合施用，以治疗如上所列的病症。所述有效剂量可以为约1ng/kg体重、10ng/kg体重、100ng/kg体重、1ug/kg体重、10ug/kg体重、25ug/kg体重、50ug/kg体重、100ug/kg体重、250ug/kg体重、500ug/kg体重、750ug/kg体重、1mg/kg体重、5mg/kg体重、10mg/kg体重、25mg/kg体重、50mg/kg体重、75mg/kg体重、100mg/kg体重、250mg/kg体重、500mg/kg体重、750mg/kg体重等。所述剂量可以根据需要多次给药，例如每4小时一次、每6小时一次、每8小时一次、每12小时一次、每18小时一次、每天一次、每2天一次、每3天一次、每周一次等。所述剂量可以口服给药。
[0130]
所述组合物可单剂量或多剂量给药，通常是在一段时间内多剂量给药，例如每天一次、每隔一天一次、每周一次、每半周一次、每月一次等，持续一段足以使所述炎性疾病的严重程度降低的时间，所述给药方式可包含1、2、3、4、6、10或更多次剂量给药。
[0131]
可使用常规计算方法，基于动物数据，确定根据本发明的方法的药剂的治疗或预防有效量。所述有效剂量至少部分取决于给药途径。
[0132]
所述肽以及肽与mhc蛋白的复合体也可用于表征个体免疫特征的方法中，尤其是用于确定疑似患有ms或相关炎症病症的个体中对这些肽和复合体具有特异性的致病性t细胞的存在情况的方法中。所述方法可包含使包含来自所述个体的t细胞的样本与免疫原性交叉反应肽或包含所述肽的mhc复合体接触，并确定t细胞对所述肽或复合体的反应的存在情况。所述样本可以是包含t细胞的任何生物学样本，包括外周血、淋巴结样本、csf等。所述t细胞反应可通过如本领域已知的以下方式确定：直接结合测定；确定与对这些肽抗原的特异性相关的t细胞受体的存在情况；确定t细胞上活化标志物的存在情况；确定频率；确定响应于所述肽或复合体的细胞因子产生增强的存在情况；等等。
[0133]
抗原特异性免疫疗法
[0134]
抗原特异性免疫疗法旨在利用耐受、免疫偏差和treg诱导来促进自身抗原特异性耐受。自身免疫性疾病或许能通过以下方式进行治疗：消除对自身抗原具有特异性的致病性cd4+细胞；或者阻断自身抗原特异性t细胞引导的免疫反应。一些研究表明，免疫偏差与treg生成、肽特异性il-10以及自身抗原施用后ifnγ、il-5、il-13、il-17、il-6、肿瘤坏死因子-α(tnfα)和foxp3水平升高的情况相一致。另一种诱导免疫学变化的方法是通过操纵树突细胞(dc)来实现。dc对于免疫反应的诱导阶段是必不可少的，因此其在确定对抗原的反应是炎性反应还是耐受反应方面至关重要。dc可能对初始t细胞是否会发生缺失、无能或分化造成影响。dc对特异性抗原的反应受组织环境以及与该抗原相关的先天刺激的影响。治疗可以靶向dc以诱导耐受。
[0135]
例如，所述交叉反应性腺病毒肽可以通过致耐受性途径施用，例如通过经口或经鼻施用可溶性或寡聚肽实现。或者，所述交叉反应性腺病毒肽可用作改变的肽配体(apl)的基础。改变的肽配体是衍生自抗原肽的类似物，其在tcr接触残基处包含氨基酸取代，例如
1、2、3个氨基酸的取代。这些改变的肽配体实现的tcr接合会损害正常t细胞功能。改变的肽配体可特异性地拮抗和抑制同源抗原肽诱导的t细胞活化。apl与天然肽就tcr结合进行竞争，但以较低的亲和力与tcr结合，因此可作为拮抗剂或部分激动剂发挥作用。拮抗剂诱导t细胞无能，而部分激动剂无法完全活化t细胞，可诱导免疫偏差。
[0136]
在一些实施例中，配制肽用于免疫，以产生抗原特异性耐受，例如通过皮下或经口施用交叉反应肽实现。在一些实施例中，交叉反应肽被配制成经皮递送。在一些实施例中，诱导免疫耐受的方法包含经皮施用这样配制的交叉反应肽。有效剂量可以是低剂量，例如小于约5mg、小于约2.5mg、小于约1mg、小于约500μg、小于约100μg的剂量。在一些实施例中，将交叉反应肽包封入甘露糖基化脂质体中，以增强树突细胞对肽的摄取。
[0137]
或者，施用衍生自致病性t细胞克隆的tcr的氨基酸序列，以诱导针对表达这些tcr的t细胞的t细胞介导的免疫调节。用于此目的的目的tcr序列包括，例如，序列号：5-22和76-83所示的一条或多条肽序列，具体如图1g和9所示。制剂可以，例如，透皮、皮内、肌内施用等，并且可以例如至多100mg/kg、至多50mg/kg、至多10mg/kg、至多5mg/kg、至多1mg/kg、至多500μg/kg、至多100μg/kg、至多10μg/kg等的剂量施用，而且可以进一步包含佐剂，以增加免疫原性，包括但不限于弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂等。
[0138]
作为肽疫苗接种的替代方案，dna疫苗可以在编码一种或更多种本文所揭示的交叉反应肽的基因工程化dna的耐受载体中配制。可以诸如在经修饰的质粒骨架中配制耐受载体并通过肌内注射施用，所述修饰方式使得其在ms患者中引起有利免疫学变化，例如，免疫刺激性cpg基序的数量减少和免疫抑制性gpg基序的数量增加)。较低的剂量可能是优选剂量，例如小于5mg的剂量，例如小于约5mg、小于约2.5mg、小于约1mg、小于约500μg、小于约100μg的剂量。
[0139]
据证实，dna载体(例如第10,098,935号美国专利中所述的dna载体)提供耐受(即，诱导抗原特异性耐受)。此类载体被称为耐受载体。所述载体可诸如通过局部注射(包括肌内注射)来施用，其中所述载体编码交叉反应性腺病毒肽或包含所述肽的蛋白，并且进一步包含与所述核酸序列可操作地连接的启动子序列；与所述启动子序列和所述核酸序列连接的dna骨架，包含4个或更少的免疫刺激性cpg基序。所述交叉反应肽可以由1、2、3或更多个改变自天然存在的多肽的氨基酸残基进行修饰。
[0140]
为了包括本发明优选的实施方式，已根据发明人发现或提出的特定实施例来描述本发明。本领域技术人员应当理解，根据本发明所述，在不脱离本发明的预定范围的情况下，可对例举的特定实施例做出大量修改和变更。此外，出于对生物功能等效性的考虑，可以在不影响生物作用种类或数量的情况下改变蛋白质的结构。所有这些修改都会包括在所附权利要求的范围内。
[0141]
示例1
[0142]
筛选ms患者cd4+ t细胞显示与腺病毒蛋白交叉反应的抗原特异性
[0143]
在本研究中，我们发现使用先进的重组dna技术，多发性硬化(ms)患者的t细胞受体可与常见的病毒抗原(腺病毒)和主要的髓鞘蛋白(髓鞘碱性蛋白)发生反应。这种肽抗原及其在其他自身免疫性疾病中的等效物可用于ms患者的抗原特异性耐受方案中，并且可以起到改善甚至是治愈作用。本文使用的相同的无偏倚方式也可能适用于其他自身免疫性疾病中的其他致病抗原。
[0144]
分析了18例新诊ms患者pbmc和4例健康对照者(hc)pbmc。起初进行了cytof，以确定hc和ms之间的t细胞群体是否存在差异。结果发现，ms患者的大脑归巢活化t细胞的频率较高。我们对其进行了单细胞分选和配对tcr测序，结果发现，ms cd8 t细胞大量扩增，而ms cd4 t细胞极少扩增。γδt细胞扩增至与hc相同的水平。我们专注于cd4 tcr特异性，因为ms与dr150101高度相关(20-30％易感性)。为了鉴定抗原特异性，我们利用gliph进行cd4 tcr聚类。使用gliph，我们能够鉴定dr150101 ms个体中富集的cd4 tcr聚类。我们挑选了9种基于dr15进行聚类的cd4 tcr用于抗原发现。我们生成了这9种cd4 tcr作为可溶性重组蛋白，并筛选了12mer和15mer dr15酵母文库。在这9种cd4 tcr中，通过筛选，我们发现4种cd4 tcr(ms-1
–
ms-4 tcr)富集(a647-myc)和四聚体(pe-tcr tet)染色。
[0145]
我们生成了ms1-tcr细胞系，将其与负载有酵母文库生成肽的t2-dr15抗原呈递细胞系共培养，并检查其活化情况。cd69用作t细胞活化的标志物。大多数文库富集肽刺激ms-1 tcr细胞系。我们使用酵母文库富集数据来预测适用于ms-1 cd4 tcr的实际肽/抗原(自身或非自身)。令人惊讶的是，我们发现，腺病毒肽(adeno
–
atftsyrswyla)与富集肽几乎相同，它还刺激ms-1 tcr细胞系。
[0146]
除酵母文库肽富集外，还添加了附加层，帮助算法确定野生型肽。基本上，单点突变在最富集的文库肽上发生，我们使用这些位置突变肽t细胞刺激数据来更好地生成取代矩阵，此矩阵反过来可用于算法，以检索人蛋白质组中的实际肽。利用此位置突变/改进的取代矩阵数据，我们能够鉴定出适用于tcr2/ms-1 tcr的3种自身肽。
[0147]
为了检测/确定直接来自ms患者(n＝9)和健康者(n＝9)的腺特异性t细胞，我们生成了pmhc四聚体、富集的以及列举的腺肽特异性cd4。我们能够检测到腺特异性cd4 t细胞，与hc相比，ms患者中的腺特异性cd4 t细胞数量更多。我们还对这些腺特异性cd4 t细胞进行了单细胞分选，对其tcr进行测序，并生成了tcr细胞系(腺特异性tcr)。
[0148]
测试了来自腺四聚体分选的cd4 tcr的tcr细胞系与mbp 85-99肽的交叉反应性。我们还测试了ms-1 tcr与mbp的交叉反应性。用腺肽和mbp刺激腺特异性tcr。tcr2/ms-1 tcr和一些adeno-tcr(adeno-tcr1和9)与mbp肽发生交叉反应。测试了来自ms(n＝28)和hc(n＝10)的血清中的腺病毒滴度。与hc血清相比，ms血清子集的腺病毒滴度更高。对来自8例ms和5例hc的cd3+ t细胞进行分选，并使用10x平台进行tcr和rna-seq。此外，对于8例ms患者中的4例，对来自脑脊液的t细胞进行了测序。对于8例ms患者中的4例，对来自脑脊液的t细胞进行了测序。在每例ms患者的csf内发现cd4+和cd8+ t细胞克隆扩增。
[0149]
生成酵母肽-mhc文库。最近，garcia及其同事开发了用于鉴定αβtcr配体的酵母肽-mhc文库系统。为了探索适用于这些tcr的肽抗原，我们设计了dr15构建体，生成了含有此突变的两个不同肽文库，并诱变了12和15aa插入物，其中主要mhc结合锚定残基处的多样性有限。
[0150]
人体样本。外周血单核细胞(pbmc)通过斯坦福血液中心的健康献血获得。健康人类受试者为男性和女性，年龄为22-47岁。源自多发性硬化患者的pbmc从加州大学旧金山分校(ucsf)的多发性硬化中心获得。ucsf人体研究委员会批准了研究方案，且获得了所有参与者的知情同意。
[0151]
可溶性tcr的生成。如前所述生成可溶性tcr。将含有工程化c结构域二硫键的tcr小鼠可变区-人恒定区(vmch)嵌合体克隆到pacgp67a昆虫表达载体(bd biosciences，
554756)中，该载体编码c端酸性gcn4-拉链-生物素受体肽(bap)-6xhis标签。每条链还在tcr胞外域的c端和gcn4拉链之间编码3c蛋白酶位点，以便切割拉链。通过用cellfectin ii(life technologies，10362-100)共转染bd baculogold线性化杆状病毒dna(bd biosciences，554739)，使sf9细胞中产生针对每种tcr构建体的杆状病毒。tcrα和β链病毒以多种比例在小体积(2ml)的high five细胞中共感染，以确定确保实现1:1α:β化学计量的比例。
[0152]
为了制备可溶性tcr，在28℃下将1l high five细胞用适当比例的tcrα和tcrβ病毒感染48小时。用100mm tris-hcl(ph 8.0)、1mm nicl2、5mm cacl2处理所收集的培养基，并通过离心清除后续沉淀。然后，将培养基与ni-nta树脂(qiagen 30250)在室温下孵育3小时，并在1
×
hbs+200mm咪唑(ph 7.2)中洗脱。接着，通过加入重组bira连接酶、100μm生物素、50mm bicine(ph 8.3)、10mm atp和10mm醋酸镁并在4℃下孵育过夜，对tcr进行位点特异性生物素化。然后，使用aktapurifier(ge healthcare)在superdex 200色谱柱(ge healthcare)上通过尺寸排阻色谱法纯化反应物。合并波峰部分，然后使用sds-page凝胶位移测定进行生物素化检测。蛋白为通常100％生物素化的蛋白。
[0153]
酵母展示dr150101肽文库的生成、标签富集、染色和选择。单链三聚体(sct)dr150101酵母构建体被合成为酵母表面蛋白aga2p的n端融合物。将全长sct构建体克隆至载体pyal中。这些构建体含有aga2p前导序列，然后是12或15mer肽序列、gly-ser(ggggs)3连接子、第二甘氨酸连接子(ggggs)4、dr150101序列、myc或ha表位标签、第三甘氨酸连接子(ggggs)3和aga2蛋白。然后，如前所述，使构建体通过电穿孔进入eby-100酵母中，并在20℃下于sgcaa ph 4.5培养基中诱导表达24-72小时，直到观察到最高程度的表位标签染色(通常为总群体的40％-70％)。如前所述，对全长酵母构建体进行诱变。简而言之，通过易错pcr(genemorph ii试剂盒，agilent 200550)对构建体进行诱变，最终错误率为每kbp约4-5个核苷酸取代，这可通过将易错构建体连接到pyal载体中并对克隆进行测序来判断。通过线性化pyal-cmyc/ha载体的同源重组，电穿孔感受态eby-100细胞，从而构建酵母文库。最终文库含有约5
×
108个酵母转化株。
[0154]
如前所述，采用与易错文库相同的方式构建肽文库，但pmhc构建体可通过使用允许所有20个氨基酸通过nnk密码子的诱变引物沿肽随机化。文库仅允许已知mhc锚定残基处的有限多样性，以最大限度地增加文库中正确折叠和展示的pmhc克隆的数量。对于h2-db，分别使用aac和mts密码子将p5和p9锚点限制为asn(n)和met/ile/leu(m/i/l)。得到的pcr产物用作第二pcr反应的模板，其中向pcr产物的两端添加50个序列与载体同源的核苷酸。然后，纯化50ug第二pcr产物和约10ug线性化载体，用于酵母电穿孔以构建各文库。在基于12mer和15mer pmhc文库进行选择之前，富集了各文库中与之相应的表位标签，以最大限度地提高初始池中酵母所占的百分比，并在其表面呈现正确折叠和展示的pmhc分子。为了实现这一点，分别在20℃下于500ml sgcaa中诱导各文库24-72小时，起始密度为1
×
107个细胞/毫升。观察到最高程度的表位标标签染色时，将约1.4
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109诱导的酵母细胞置于pbs+0.5％bsa和1mm edta(pbe缓冲液)中洗涤一次，并重悬于含200ul miltenyi链霉亲和素微珠(miltenyi，130-048-101)的5ml pbe中。将细胞和磁珠混合物在4℃下旋转孵育1小时，再次置于pbe中洗涤，重悬于5ml pbe中，并使其通过细胞滤网进入预湿macs ld分选柱(miltenyi，130-042-901)。完全排空分选柱后，用2ml pbe洗涤两次并收集流出物。
[0155]
通过离心将细胞从流出物中分离出来，并重悬于含80μl抗cmyc alexafluor647或抗ha alexfluor647抗体(cell signaling，2233和3444)的5ml pbe中，然后分别在4℃下旋转孵育1小时。洗涤细胞，将其重悬于5ml pbe中，加入220μlmiltenyi抗alexafluor647微珠(miltenyi，130-091-395)，并将该混合物在4℃下避光旋转孵育30分钟。然后洗涤细胞，将其重悬于6ml pbe中，并平均分配至两根预湿macs ls分选柱(miltenyi，130-042-401)中。完全排空分选柱后，每根分选柱用3ml pbe洗涤两次并将流出物搁置在一旁。用每根分选柱5ml pbe的用量洗脱分选柱中的细胞。保留小部分洗脱液(5-20μl)，以便比较alexafluor647染色与流出物染色，从而量化标签富集。合并剩余的洗脱细胞，通过离心收集，将其重悬于总共40ml sdcaa培养基中，并通过分光光度计测量在600nm处的细胞密度。然后加入sdcaa，将细胞密度调节至od或更小，并将酵母置于30℃下培养过夜。进行细胞传代，以在sdcaa中进行又一轮过夜生长。
[0156]
为了诱导标签，取洗脱液以便在20℃于500ml sgcaa中培养。为了使用tcr四聚体进行pmhc染色，将生物素化tcr与链霉亲和素(其与alexafluor647、alexafluor488或藻红蛋白偶联)以5:1的比例在冰上孵育5分钟，确保完全形成四聚体。然后，酵母细胞在冰上用250nm四聚体+抗myc-alexafluor488或抗ha-alexafluor488抗体(cell signaling，分别为2279或2350)染色3小时，并在通过流式细胞术(accuri c6流式细胞仪)进行分析之前用冰冷的pbe缓冲液洗涤两次。如前所述，完成酵母文库的所有酵母选择和测序。
[0157]
肽-mhc四聚体形成：如前所述，所有四聚体都是新制备的。简而言之，对于四聚体化，荧光团缀合的链霉亲和素和pmhc单体的量以4:1的摩尔比率混合。在室温下，每10分钟向单体溶液中加入五分之一的荧光团缀合的链霉亲和素的量。
[0158]
富集细胞系中的四聚体阳性t细胞：细胞在室温下用四聚体染色一小时并用facs缓冲液洗涤。在四聚体富集后，细胞在4℃下用抗体混合物表面染色20分钟。使用facs缓冲液洗涤染色细胞，并在lsr ii(becton dickinson)上进行分析或在facs aria fusion sorp(becton dickinson)上进行单细胞分选/批量分选。慢病毒tcr转导的jurkat tcrαβ-/-细胞系在室温下用20nm浓度的四聚体溶于含10μm生物素的facs缓冲液中形成的溶液染色1小时，然后在4℃下用适当的抗体表面染色20分钟。表面染色后，用facs缓冲液洗涤细胞并在lsr ii(becton dickinson)上进行分析。
[0159]
通过慢病毒转导表达tcr。将tcrα、β构建体克隆至慢病毒构建体中。对于tcr表达，将α和βtcr慢病毒构建体分别转染至293x细胞中。转染72小时后，收获病毒并将其转导至jurkatαβ-/-或skwαβ-/-细胞中。通过使用miltenyi抗apc选择(miltenyi，130-090-855)，富集skw或jurkat细胞，以实现tcrαβ的最高表达。
[0160]
t细胞刺激测定。如前所述进行t细胞刺激测定。所有t细胞肽刺激实验均在总体积为200μl的96孔圆底板中进行。t2、k562细胞或bmdc用10-100ug肽脉冲处理45分钟，洗涤一次并铺板(10,000个细胞/孔)。将表达tcr的细胞系(100,000个细胞/孔)与apc共培养18小时。在刺激结束时，收获细胞，洗涤，用tcrβ、人cd3和cd69染色，并在lsr ii(becton dickinson)上分析细胞活化情况。
[0161]
全转录组测序和数据分析。如前所述进行全转录组测序，将t细胞直接批量分选至trizol(qaigen)中。用rneasy plus micro kit(qiagen)提取rna。在2100生物分析仪上进行分析后，在hiseq 4000平台(illumina)上对得到的文库进行测序。对于全转录组测序文
库中的每个样本，从测序仪中获取75碱基对配对末端读数。将每个样本缩分成3份，wt样本除外，其仅形成一个样本。使用fastqc 0.11.4确定读数质量。我们使用tophat v2.0.13将读数与小鼠参考基因组(ncbi/组装grcm38)对齐。平均而言，90％的读数与参考基因组对齐。通过deseq251确定用作热图输入的差异基因表达分析和读数计数归一化。使用rsem v1.3.052计算tpm值。使用r包“pheatmap”生成热图。使用r包“enrichplot”生成基因本体分析图。数据可用性rna-seq数据和酵母p-mhc选择数据存储于基因表达综合(geo)数据库中，登录号为gse130975。
[0162]
序列
[0163]
图1g中的t细胞受体序列。
[0164][0165]
图2中的肽抗原
[0166][0167][0168]
图4中的肽抗原
[0169][0170]
图9中的t细胞受体
[0171][0172]
图9中的肽抗原
[0173][0174]
本说明书中引用的每份出版物均出于所有目的通过引用方式全文并入本文中。
[0175]
应当理解，本发明不限于所述的特定方法、方案、细胞系、动物物种或属以及试剂，因为在实际实施中可能会存在差异。还应当理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，而无意限制本发明构思，本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。
[0176]
本文中使用的单数形式的“一”、“一个”和“所述/该”包括复数指代对象，除非上下文另有明确说明。因此，举例而言，“一个细胞”的指代对象包括多个此类细胞，而“所述培养物”的指代对象包括一种或更多种培养物及所属领域技术人员已知的等效物，等等。除非另有明确定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。