选择性CDK4/6抑制剂型癌症治疗药物的制作方法

选择性cdk4/6抑制剂型癌症治疗药物
1.领域
2.本公开涉及用于抗癌治疗的药学化合物，更具体地，涉及取代的吡咯并嘧啶化合物、取代的吡咯并嘧啶化合物和取代的苯并咪唑化合物，其作为有效的cdk 4/6抑制剂用于治疗、预防和/或改善癌症。
3.背景
4.癌症干细胞(csc)是对常规癌症治疗(如化疗和放疗)具有抗性的肿瘤起始细胞(tic)。因此，csc造成肿瘤复发和远处转移，导致癌症患者的治疗失败和不良临床结果。因此，需要创新的方法来理解如何解决csc问题。从机理上讲，这可能与csc在苛刻条件和不同微环境下存活并茁壮成长的能力有关。由于csc是肿瘤细胞群中特别小的亚群，直到最近，其代谢和表型特性在很大程度上仍未被表征。
5.此外，csc对细胞应激具有惊人的回复能力和高度抵抗力，这使得其能够进行锚定非依赖型生长，尤其是在低附着条件下。因此，其形成3d球体，这保留了csc和干细胞祖细胞的性质。相反，当进行悬浮生长时，大多数“主体”癌细胞通过失巢凋亡(一种特殊类型的凋亡)而死亡。因此，单个csc的克隆繁殖会产生3d球体，并且不涉及癌细胞的自聚集。因此，3d球体形成是上皮癌细胞中干细胞性(stemness)的功能性读出，并允许富集具有干细胞样表型的上皮样细胞群体。当使用乳腺癌细胞(如mcf7等)制备这些3d球体时，这些3d球体也被称为乳腺球。
6.此前，已经从2个不同的er(+)细胞系(mcf7和t47d)生成了3d球体，并进行了无偏无标记的蛋白质组学分析。这项工作开始在分子水平上分析csc的表型反应。将3d球体直接与这些细胞系的单层进行比较，并平行处理。这允许鉴别3d球体相对于单层的蛋白质组学特征，即特征性的csc表型。基于这一分子分析，观察到乳腺球极大地富集线粒体蛋白质。这些线粒体相关蛋白包括参与β-氧化和酮代谢/再利用、线粒体生物发生、电子传递、adp/atp交换/运输、coq合成和ros生成以及抑制线粒体自噬的分子。因此，增加线粒体蛋白合成或减少线粒体自噬可允许csc中线粒体质量累积。
7.鉴于csc的增加，线粒体质量被认为是纯化csc的新代谢生物标志物。使用该整体方法，已经观察到，仅使用mitotracker作为er(+)(mcf7)和er(-)(mda-mb-231)乳腺癌细胞系的单一标志物，就可以极大地富集csc活性。值得注意的是，发现高mitotracker细胞对紫杉醇具有化疗抗性，对紫杉醇诱导的dna损伤反应显示抗性。
8.然而，我们需要的是用于抗癌治疗的新药学化合物，这些药学化合物根除csc，防止或减少转移和/或复发的可能性，并减少或消除癌症对化疗和其他抗癌治疗的抗性。此外，需要的是靶向“最适生长”的csc的治疗策略和抗癌疗法，并消除进一步的癌症生长，包括锚定非依赖型生长、肿瘤复发和远处转移。
9.简要概述
10.癌症干细胞(csc)目前被认为是全球癌症患者治疗失败的主要根源之一。从机理上讲，这可能与csc在苛刻条件和不同微环境下存活并茁壮生长的能力有关。发明人提出了一种理论，即csc可能通过使用升高的线粒体oxphos代谢来“促进”atp生成，从而对传统疗
法产生抗性。与此观点一致，多种线粒体抑制剂成功阻止了3d肿瘤球体形成，包括尤其是i)fda批准的抗生素(多西环素、替加环素、阿奇霉素、恩波维铵、阿托伐醌、贝达喹啉)，ii)天然化合物(放线酰胺素、cape、小檗碱、brutieridin和蜂毒苷)，以及iii)实验化合物(寡霉素和ar-c155858，mct1/2抑制剂)等。
11.细胞周期蛋白依赖性激酶(cdk)4和6是已知的促进正常细胞和癌细胞的细胞有丝分裂和减数分裂的酶。这些酶负责磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白，从而使其失活，该蛋白在细胞周期从g1期进展到s期中起作用。研究发现，癌细胞的异常增加cdk的活性。这种增加的活性导致各种肿瘤抑制基因的失活，从而为癌症干细胞的快速增殖和肿瘤生长铺平了道路。cdk的天然存在的蛋白抑制剂，如p16和p27，已被证明在体外抑制肺癌细胞系的生长。某些cdk抑制剂可以通过其抑制正常未转化细胞的细胞周期进程的能力而可用作化学保护剂。
12.靶向抑制这些酶是抗癌治疗法和治疗药物的一种潜在策略，无论是单独使用还是与其他疗法组合使用。阻断cdk 4/6通路阻止细胞进展到s期，其通过凋亡实现细胞死亡。本文描述了三类cdk抑制剂，主要是cdk 4和cdk 6抑制剂(“cdk 4/6”)，其作为癌症治疗剂具有很强的疗效。第一类抗癌cdk 4/6抑制剂是具有脂肪酸部分的取代的吡咯并嘧啶化合物。下面所示的式是第一类抗癌cdk 4/6抑制剂中的一些实施方案的示例，其中“n”是9-20，更优选12-20的整数。
[0013][0014]
第二类包括具有脂肪酸部分的取代的吡啶并嘧啶。下面所示的式是第二类抗癌cdk 4/6抑制剂中的一些实施方案的示例，其中“n”是9-20，更优选12-20的整数。
[0015][0016]
第三类包括具有脂肪酸部分的取代的苯并咪唑化合物。下面所示的式是第三类抗癌cdk 4/6抑制剂的实施方案的示例，其中“m”是0-4，更优选0-2的整数，“n”是9-20，更优选12-20的整数。
[0017][0018]
第一类、第二类或第三类化合物，包括其盐，可用作用于治疗癌症的药学化合物。示范性的盐包括，尤其是，琥珀酸盐、三氟乙酸盐、酒石酸盐和苹果酸盐，以及本领域一般技术人员将理解的其他盐。本方法还提供了药物制剂，其具有治疗有效量的来自第一类、第二类或第三类的化合物，或在一些实施方案中来自每一类的一种或多种化合物，或其治疗上可接受的盐(多种)，以及其药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。所有这些形式都在当前方法的范围内。应当理解，可以使用本领域已知的药学上可接受的载体。
[0019]
本文所述的化合物可结合治疗哺乳动物(包括人类)的癌症的方法使用，包括向哺乳动物施用一定量的来自第一类、第二类或第三类的化合物，或其药学上可接受的盐，其可有效治疗此类病症或病况。例如，本方法可用于治疗异常细胞增殖，如癌症。本文所述化合物可用于治疗异常细胞增殖病症，特别是选自乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、睾丸癌、食管癌、胃癌、皮肤癌、肺癌、骨癌、结肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、胆道癌、颊腔癌和咽(口)癌、唇癌、舌癌、口腔癌、咽癌、小肠癌、结直肠癌、大肠癌、直肠癌、脑和中枢神经系统、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、角化棘皮瘤、表皮样癌、大细胞癌、腺癌、腺癌、腺瘤、腺癌、滤泡癌、未分化癌、乳头状癌、精原细胞瘤、黑素瘤、肉瘤、膀胱癌、肝癌、肾癌、髓系疾病、淋巴系统疾病、霍奇金病、毛细胞和白血病的癌症，通过向被诊断患有此类癌症的受试者施用治疗有效量的来自第一类、第二类或第三类的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本方法可与其他疗法结合使用和/或用于提高其他疗法的有效性。
[0020]
本方法的一些实施方案可以采用具有以下通式的化合物的形式，
[0021]
其中：
[0022]
r4选自由氢、c
1-c
8-烷基、取代的c
1-c
8-烷基、c
3-c
8-环烷基、取代的c
3-c
8-环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基和取代的杂芳基组成的组；
[0023]
z为crz，其中rz选自由卤素、氢、c
1-c
3-烷基、c
1-c
3-烷氧基、cn、c＝noh、c＝noch3、c(o)h、c(o)c
1-c
3-烷基、c
3-c
8-环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、取代的c
1-c
3-烷基、取代的c
3-c
8-环烷基、取代的杂环基、取代的芳基、取代的杂芳基、-b-nrarb、-b-ora、-b-c(o)ra、-b-c(o)ora、-b-c(o)nrara的组成的组；其中b为键、c
1-c
3-烷基或支链c
1-c
3-烷基；并且ra和rb各自独立地选自由氢、c
1-c
3-烷基、c
3-c
8-环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、取代的烷基、取代的环烷基、取代的杂环基、取代的芳基和取代的杂芳基组成的组；并且
[0024]
n为9-20，且优选12-20的整数。在一些优选的实施方案中，r1是环戊基，且r2是乙酰基。进一步地，在一些实施方案中，n优选是12。
[0025]
在一些实施方案中，本方法可采取药物组合物的形式，该药物组合物包括如本文所述的化合物或其药学上可接受的盐作为活性治疗剂以及药学上可接受的载体。例如，在一些实施方案中，组合物可以是片剂，该片剂具有35％至55％(按重量计)的活性治疗剂的核和药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可为例如，微晶纤维素、交聚维酮a型、低取代羟丙基纤维素、硬脂酸镁和胶体无水二氧化硅。
[0026]
本文所述的化合物和药物组合物对癌症干细胞具有效力和选择性，使其适合于各种抗癌治疗用途。例如，本方法可以采取用于防止或减少癌细胞、癌症干细胞和循环肿瘤细胞中至少一种的增殖的方法的形式，其中向有此需要的患者施用药学上有效量的如本文所述的化合物或药物组合物。
[0027]
本方法可采取用于治疗癌症的方法的形式，其中向有此需要的患者施用药学上有效量的如本文所述的化合物或药物组合物。
[0028]
本方法可采取用于治疗或预防转移性疾病的方法的形式，其中向有此需要的患者施用药学上有效量的如本文所述的化合物或药物组合物。
[0029]
本方法可采取用于治疗或预防肿瘤复发的方法的形式，其中向有此需要的患者施用药学上有效量的如本文所述的化合物或药物组合物。
[0030]
本方法可采取用于降低癌症治疗抗性(例如化疗抗性)的方法的形式，其中向有此需要的患者施用药学上有效量的如本文所述的化合物或药物组合物。
[0031]
本方法可采取用于治疗或预防放疗抗性、化疗抗性和激素治疗抗性中的至少一种的方法的形式，其中向有此需要的患者施用药学上有效量的如本文所述的化合物或药物组合物。
[0032]
应当理解，本领域一般技术人员可以应用本领域已知的常用方法来确定特定实施方案的治疗剂量、剂型和给药时间表。
[0033]
本方法的化合物还可用于制造用于多种治疗用途的药物，例如治疗或预防癌症、治疗或预防转移性疾病以及治疗或预防肿瘤复发。
[0034]
本领域一般技术人员在查阅以下详细描述后，可以识别本方法的实施方案。
[0035]
附图
[0036]
图1显示了在mcf7细胞系上使用乳腺球形成试验比较化合物[1c]与其母体化合物的剂量-反应曲线。
[0037]
图2是在mcf7细胞系上使用乳腺球形成试验比较化合物[2c]与其母体化合物的剂量-反应曲线。
[0038]
图3是在mcf7细胞系上使用乳腺球形成试验得出的化合物[3c]的母体化合物的剂量-反应曲线。
[0039]
图4显示了在mcf7细胞系上使用hoechst染色试验比较化合物[1c]与其母体化合物的剂量-反应曲线。
[0040]
图5显示了在mcf7细胞系上使用hoechst染色试验比较化合物[2c]与其母体化合物的剂量-反应曲线。
[0041]
图6是在mcf7细胞系上使用hoechst染色试验比较化合物[3c]的母体化合物的剂
量-反应曲线。
[0042]
图7显示了在htert-bj1细胞系上使用hoechst染色试验比较化合物[1c]与其母体化合物的剂量-反应曲线。
[0043]
图8显示了在htert-bj1细胞系上使用hoechst染色试验比较化合物[2c]与其母体化合物的剂量-反应曲线。
[0044]
图9是在htert-bj1细胞系上使用hoechst染色试验得出的化合物[3c]的母体化合物的剂量-反应曲线。
[0045]
描述
[0046]
以下描述包括当前预期的执行本方法的示例性实施方案的模式。以下描述不应以限制性意义理解，而是仅用于说明本发明的一般原理。
[0047]
根据本方法，来自三类cdk 4/6抑制剂的化合物可用作抗癌治疗剂。第一类包括具有脂肪酸部分的取代的吡咯并嘧啶化合物。第二类包括具有脂肪酸部分的取代的吡啶并嘧啶化合物。第三类包括具有脂肪酸部分的取代的苯并咪唑化合物。本文所述的化合物具有有用的药物和药用性能。许多化合物表现出显著的选择性cdk 4/6抑制活性，因此在治疗多种临床状况中具有价值，在这些临床状况中cdk 4/6激酶异常升高、激活或以正常数量和活性存在，但都需要抑制cdk来治疗细胞增殖性病症。特别地，这些化合物作为抗癌治疗药物是有前景的。以下定义描述了每类中的化合物，其适用于本方法的实施方案。
[0048]
如本文所用，符号c(o)表示碳-氧双键。本文使用的术语“卤代”是指卤素，且包括氟、氯、溴或碘，如本领域所理解的那样键合。
[0049]
本文使用的术语“烷基”是指饱和脂肪族基团，包括直链烷基(例如，甲基、乙基等)、支链烷基(异丙基、叔丁基等)、环烷基(脂环)基团(环丙基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基)、烷基取代的环烷基、和环烷基取代的烷基。术语“烷基”还包括烯基和炔基。通式可以使用术语“c
n-烷基”，其中n是例如1-20的整数，以指示该基团中特定烷基(直链或支链)的碳的特定范围或数量。例如，术语c
1-c
3-烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基和异丙基。类似地，术语c
3-6-环烷基包括但不限于环丙基、环戊基和环己基。烷基以及环烷基可以是未取代的或取代的。因此，术语烷基包括“未取代的烷基”和“取代的烷基”，后者是指具有替换烃主链的一个或多个碳上的氢的取代基的部分。
[0050]
术语“烯基”包括具有一定长度且可能取代上述烷基但其包含至少一个双键的不饱和脂肪族基团类似物。烯基还包括“未取代的烯基”和“取代的烯基”，后者是指具有替换烃主链的一个或多个碳上的氢的取代基的部分。
[0051]
例如，术语“烯基”包括直链烯基(例如，乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基等)、支链烯基、环烯基(脂环族)基团(环丙烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环辛烯基)、烷基或烯基取代的环烯基以及环烷基或环烯基取代的烯基。术语烯基还包括包含替换烃主链的一个或多个碳的氧、氮、硫或磷原子的烯基。在某些实施方案中，直链或支链烯基在其主链中具有6个或更少的碳原子(例如，直链为c
2-c6，支链为c
3-c6)。同样，环烯基在其环结构中可以具有3-8个碳原子，并且更优选地在环结构中具有5或6个碳。术语c
2-c6包括含有2至6个碳原子的烯基。
[0052]
术语“炔基”包括具有一定长度和可能取代上述烷基但其包含至少一个三键的不饱和脂肪族基团类似物。此外，术语炔基包括“未取代的炔基”和“取代的炔基”，后者是指具
有替换烃主链的一个或多个碳上的氢的取代基的炔基部分。
[0053]
作为实例，术语“炔基”包括直链炔基(例如，乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基、壬炔基、癸炔基等)、支链炔基和环烷基或环烯基取代的炔基。术语炔基还包括包含替换烃主链的一个或多个碳的氧、氮、硫或磷原子的炔基。在某些实施方案中，直链或支链炔基在其主链中具有6个或更少的碳原子(例如，直链为c
2-c6，支链为c
3-c6)。术语c
2-c6包括含有2至6个碳原子的炔基。
[0054]
术语“取代的”旨在描述具有替换分子的一个或多个原子(例如c、o或n)上的氢的取代基的部分。此类取代基可包括例如但不限于，烷基、烷氧基、烯基、炔基、卤代、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧酸根(carboxylate)、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷基硫基羰基、烷氧基、磷酸根(phosphate)、膦酸根(phosphonato)、亚膦酸根(phosphinato)、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷基硫基、芳基硫基、硫代羧酸根(thiocarboxylate)、硫酸根(sulfates)、烷基亚磺酰基、磺酸根(sulfonato)、氨磺酰基、磺酰氨基(sulfonamido)、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基、吗啉基、苯酚、苄基、苯基、哌嗪、环戊烷、环己烷、吡啶、5h-四唑、三唑、哌啶、或芳族或杂芳族部分、及其组合。
[0055]
术语“胺”或“氨基”应指代本领域中通常理解的分子、或部分或官能团，并且可以是伯(primary)、仲(secondary)或叔(tertiary)胺。术语“胺”或“氨基”包括其中氮原子共价键合到至少一个碳、氢或杂原子的化合物。该术语包括例如但不限于，“烷基氨基”、“芳基氨基”、“二芳基氨基”、“烷基芳基氨基”、“烷基氨基芳基”、“芳基氨基烷基”、“烷氨基烷基”、“酰胺”、“氨基”和“氨基羰基”。术语“烷基氨基”包含其中氮键合到至少一个附加烷基的基团和化合物。术语“二烷基氨基”包括其中氮原子键合到至少两个附加烷基的基团。术语“芳基氨基”和“二芳基氨基”包括其中氮分别键合到至少一个或两个芳基的基团。术语“烷基芳基氨基”、“烷基氨基芳基”或“芳基氨基烷基”是指键合到至少一个烷基和至少一个芳基的氨基。术语“烷氨基烷基”是指键合到氮原子的烷基、烯基或炔基，该氮原子还键合到烷基。
[0056]
术语“酰胺”、“氨基”或“氨基羰基”包括含有氮原子的化合物或部分，该氮原子键合到羰基或硫基羰基的碳。该术语包括“烷氨基羰基”或“烷基氨基羰基”，其包括键合到氨基的烷基、烯基、芳基或炔基，该氨基键合到羰基。其包括芳基氨基羰基和芳基羰基氨基，这些基团包括键合到氨基的芳基或杂芳基部分，该氨基键合到羰基或硫基羰基的碳。术语“烷基氨基羰基”、“烯基氨基羰基”、“炔基氨基羰基”、“芳基氨基羰基”、“烷基羰基氨基”、“烯基羰基氨基”、“炔基羰基氨基”和“芳基羰基氨基”包括在术语“酰胺”中。酰胺还包括脲基(氨基羰基氨基)和氨基甲酸根(carbamate)(氧基羰基氨基)。
[0057]
术语“芳基”包括多种基团，包括可包括0至4个杂原子的5-和6-元单环芳族基团，例如苯基、吡咯、呋喃、噻吩、噻唑、异噻唑、咪唑、三唑、四唑、吡唑、噁唑、异噁唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。此外，术语“芳基”包括多环芳基，例如三环、双环，例如萘、苯并噁唑、苯并二噁唑、苯并噻唑、苯并咪唑、苯并噻吩、亚甲基二氧苯基、喹啉、异喹啉、蒽基、菲基、萘啶、吲哚、苯并呋喃、嘌呤、苯并呋喃、脱氮嘌呤或吲哚嗪。在环结构中具有杂原子的那些芳基也可称为“芳基杂环”、“杂环”、“杂芳基”或“杂芳族基团(heteroaromatics)”。芳族环可
在一个或多个环位置被上述这些取代基取代，所述取代基例如烷基、卤素、羟基、烷氧基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧酸根、烷基羰基、烷基氨基羰基、芳烷基氨基羰基、烯基氨基羰基、烷基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、烯基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基硫基羰基、磷酸根、膦酸根、亚膦酸根、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷基硫基、芳基硫基、硫代羧酸根、硫酸根、烷基亚磺酰基、磺酸根、氨磺酰基、磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基或芳族或杂芳族部分。芳基也可以与非芳族的脂环或杂环稠合或桥接，以形成多环(例如，萘满)。
[0058]
如本文所用，术语杂芳基表示每个环中有多达7个原子的稳定单环或双环，其中至少一个环是芳族的，并且包含1至4个选自o、n和s的杂原子。本定义范围内的杂芳基包括但不限于：吖啶基、咔唑基、噌啉基、喹喔啉基、吡唑基、吲哚基、苯并三唑基、呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、喹啉基、异喹啉基、噁唑基、异噁唑基、吲哚基、吡嗪基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、四氢喹啉。正如下面杂环的定义一样，“杂芳基”也被理解为包括任何含氮杂芳基的n-氧化物衍生物。在杂芳基取代基为双环且一个环为非芳族或不含杂原子的情况下，应理解，附着分别经由芳族环或经由含杂原子的环。
[0059]
如本文所用，术语“杂环”或“杂环基”意指含有1至4个选自o、n和s的杂原子的5-至10-元芳族或非芳族杂环，并包括双环基团。因此，“杂环基”包括上述杂芳基及其二氢和四氢类似物。“杂环基”的另外示例包括但不限于以下：苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并呋咱基、苯并吡唑基、苯并三唑基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、咔唑基、咔啉基、噌啉基、呋喃基、咪唑基、吲哚啉基、吲哚基、吲哚嗪基、吲唑基、异苯并呋喃基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、萘啶基、噁二唑基、噁唑基、噁唑啉、异噁唑啉、氧杂环丁烷基、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并吡啶基(pyridopyridinyl)、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、四氢吡喃基、四唑基、四唑并吡啶基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、三唑基、氮杂环丁烷基、1,4-二噁烷基、六氢吖庚因基(hexahydroazepinyl)、哌嗪基、哌啶基、吡啶-2-酮基、吡咯烷基、吗啉基、硫代吗啉基、二氢苯并咪唑基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、二氢苯并噁唑基、二氢呋喃基、二氢咪唑基、二氢吲哚基、二氢异噁唑基、二氢异噻唑基、二氢噁二唑基、二氢噁唑基、二氢吡嗪基、二氢吡唑基、二氢吡啶基、二氢嘧啶基、二氢吡咯基、二氢喹啉基、二氢四唑基、二氢噻二唑基、二氢噻唑基、二氢噻吩基、二氢三唑基、二氢氮杂环丁烷基、亚甲基二氧基苯甲酰基、四氢呋喃基和四氢噻吩基及其n-氧化物。杂环基取代基的附着可以通过碳原子或通过杂原子进行。
[0060]
术语“酰基”包括含有酰基(ch3co-)或羰基的化合物和部分。术语“取代的酰基”包括其中一个或多个氢原子被例如以下的基团取代的酰基：烷基、炔基、卤素、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧酸根、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷基硫基羰基、烷氧基、磷酸根、膦酸根、亚膦酸根、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳氨基、二芳氨基和烷基芳氨基)、酰氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷基硫基、芳基硫基、硫代羧酸根、硫酸根、烷基亚磺酰基、磺酸根、氨磺酰基、磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基或芳族或杂芳族部分。
[0061]
术语“酰氨基”包括其中酰基部分键合到氨基的部分。例如，该术语包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基。
[0062]
术语“烷氧基”包括共价连接到氧原子的取代的和未取代的烷基、烯基和炔基。烷氧基的示例包括甲氧基、乙氧基、异丙氧基、丙氧基、丁氧基和戊氧基，并且可以包括环状基团如环戊氧基。取代的烷氧基的示例包括卤化烷氧基。烷氧基可被诸如以下的基团取代：烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧酸根、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷基硫基羰基、烷氧基、磷酸根、膦酸根、亚膦酸根、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳氨基、二芳氨基和烷基芳氨基)、酰氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷基硫基、芳基硫基、硫代羧酸根、硫酸根、烷基亚磺酰基、磺酸根、氨磺酰基、磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基或芳族或杂芳族部分。卤素取代的烷氧基的示例包括但不限于，氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、氯甲氧基、二氯甲氧基、三氯甲氧基等。
[0063]
术语“羰基”或“羧基”包括含有通过双键连接到氧原子的碳的化合物和部分、及其互变异构形式。含有羰基的部分的示例包括醛、酮、羧酸、酰胺、酯、酸酐等。术语“羧基部分”或“羰基部分”是指诸如其中烷基共价键合到羰基的“烷基羰基”的基团、其中烯基共价键合到羰基的“烯基羰基”基团、其中炔基共价键合到羰基的“炔基羰基”基团、其中芳基共价键合到羰基的“芳基羰基”基团。此外，该术语还指其中一个或多个杂原子共价键合到羰基部分的基团。例如，该术语包括诸如以下的部分：氨基羰基部分(其中氮原子键合到羰基的碳，例如酰胺)，氨基羰基氧基部分，其中氧和氮原子均键合到羰基的碳(例如，也称为“氨基甲酸酯”)。此外，氨基羰基氨基(例如，脲)还包括与杂原子(例如氮、氧、硫等以及碳原子)键合的羰基的其他组合。此外，杂原子可进一步被一个或多个烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、酰基等部分取代。
[0064]
术语“硫基羰基”或“硫基羧基”包括含有通过双键连接到硫原子的碳的化合物和部分。术语“硫基羰基部分”包括类似于羰基部分的部分。例如，“硫基羰基”部分包括氨基硫基羰基，其中氨基键合到硫基羰基的碳原子，此外，其他硫基羰基部分包括氧基硫基羰基(氧键合到碳原子)、氨基硫基羰基氨基等。
[0065]
术语“醚”包括含有键合到两个不同的碳原子或杂原子的氧的化合物或部分。例如，该术语包括“烷氧基烷基”，其是指与氧原子共价键合的烷基、烯基或炔基，该氧原子还共价键合到另一烷基。
[0066]
术语“酯”包括含有键合到氧原子的碳或杂原子的化合物和部分，该氧原子还键合到羰基的碳。术语“酯”包括烷氧基羧基，例如甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、丁氧基羰基、戊氧基羰基等。烷基、烯基或炔基如上文所定义。
[0067]
术语“硫醚”包括含有键合到两个不同的碳或杂原子的硫原子的化合物和部分。硫醚的实例包括但不限于，烷硫基烷基、烷硫基烯基和烷硫基炔基。术语“烷硫基烷基”包括具有与键合到烷基的硫原子键合的烷基、烯基或炔基的化合物。类似地，术语“烷硫基烯基”和烷硫基炔基”是指其中烷基、烯基或炔基键合到共价键合到炔基的硫原子的化合物或部分。
[0068]
术语“羟基(hydroxy或hydroxyl)”包括具有-oh或-o-的基团-。
[0069]
术语“多环基(polycyclyl或polycyclic radical)”包括具有两个或更多个环(例
如，环烷基、环烯基、环炔基、芳基和/或杂环基)的部分，其中两个或更多个碳是两个相邻环共有的，例如，这些环是“稠环”。通过非相邻原子连接的环称为“桥接”环。多环的每个环可被上述这些取代基取代，所述取代基例如卤素、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧酸根、烷基羰基、烷氧基羰基、烷基氨基羰基、芳烷基氨基羰基、烯基氨基羰基、烷基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、烯基羰基、氨基羰基、烷基硫基羰基、烷氧基、磷酸根、膦酸根、亚膦酸根、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷基硫基、芳基硫基、硫代羧酸根、硫酸根、烷基亚磺酰基、磺酸根、氨磺酰基、磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基、烷基芳基或芳族或杂芳族部分。
[0070]
术语“杂原子”包括除碳或氢以外的任何元素的原子。优选的杂原子为氮、氧、硫和磷。
[0071]
此外，短语“其任何组合”意味着可以组合任何数量的所列官能团和分子以创建更大的分子结构。例如，术语“苯基”、“羰基”(或“＝o”)、
“‑o‑”
、
“‑
oh”和c
1-6
(即，-ch3和-ch2ch2ch
2-)可组合以形成3-甲氧基-4-丙氧基苯甲酸取代基。应当理解，当组合官能团和分子以创建更大的分子结构时，可以根据需要移除或添加氢以满足每个原子的价态。
[0072]
如本领域一般技术人员将理解的，本文所述的化合物包括相邻原子和/或氢之间所需要的键以满足每个原子的价态。如有必要，添加键和/或氢原子，以向以下每种类型的原子提供以下总数的键：碳：四个键；氮：三键；氧：两个键；以及硫：二-六个键。
[0073]
术语化合物的“盐”涉及通过使用酸制备的相应盐，所述酸选自无机酸，例如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸，以及有机酸，例如酒石酸、乙酸、三氟乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡糖酸和琥珀酸，以及烷基磺酸，例如甲磺酸、乙磺酸、乙烷-1,2-二磺酸和2-羟基乙磺酸，以及芳基磺酸，例如苯磺酸、2-萘磺酸、对甲苯磺酸和萘-1,5-二磺酸。
[0074]
如本文所用，短语“药学上有效量”表示向宿主或向宿主的细胞、组织或器官施用以实现治疗结果(例如调控、调节或抑制蛋白激酶活性，例如抑制蛋白激酶活性，或治疗癌症)所必需的量。具有本领域普通技能的医师或兽医可以容易地确定和开出所需药物组合物的有效量。例如，医生或兽医可以从在药物组合物中采用低于达到期望的治疗效果所需水平的本发明化合物的剂量开始，并逐渐增加剂量直到达到期望的效果。
[0075]
术语“约”是指使一个值当被本领域普通技术人员考虑时落在平均误差的公认标准范围内。正如所预期的，“约”的含义取决于使用其的上下文。通常，术语“约”可指其述及的值或范围的
±
5％，优选
±
2.5％，且更优选
±
1％。例如，在重量百分比的上下文中，短语“约20％”可能意味着20％
±
5％，优选20％
±
2.5％，更优选20％
±
1％。
[0076]
术语“治疗(treat)”、“治疗的(treated)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”包括减少或减轻至少一种与正在治疗的状态、病症或疾病，特别是癌症相关或由其引起的症状。在某些实施方案中，治疗包括通过本发明的化合物减少和/或减轻与正在治疗的癌症相关或由其引起的至少一种症状。例如，治疗可以是减少癌症的一个或几个症状，或完全根除癌症。
[0077]
本文所述化合物包括本公开所述及的脂肪酸部分。如本文所用，脂肪酸是具有脂
肪族链的羧酸，其可以是饱和的或不饱和的，但是饱和链是优选的。饱和脂肪酸的示例包括月桂酸(ch3(ch2)
10
cooh)、棕榈酸(ch3(ch2)
14
cooh)、硬脂酸(ch3(ch2)
16
cooh)和肉豆蔻酸(ch3(ch2)
12
cooh)。油酸(ch3(ch2)7ch＝ch(ch2)7cooh)是天然存在的不饱和脂肪酸的示例。也可参考脂肪酸的盐或酯以及其脂肪酰胺部分，但为简单起见，这些被包括在本文所用的脂肪酸部分的含义中。例如，肉豆蔻酸可作为肉豆蔻酸酯提及，且油酸可作为油酸酯提及。脂肪酸部分也可以是脂肪酸的羰基，即，通过损失羧酸的羟基形成的基团。在一些实施方案中，脂肪酸部分可通过酰胺键键合到治疗剂。例如，肉豆蔻酸缀合物可具有脂肪酸部分ch3(ch2)
12
co-nh-，其中叔氮键合到治疗剂：且n为1至20的整数，且优选为10至20。当肉豆蔻酸酯部分通过肉豆蔻酰化缀合时，这可形成十四酰胺(或肉豆蔻酰胺)基团。
[0078]
取代的吡咯并嘧啶化合物
[0079]
在本方法的一些实施方案中，第一类抗癌cdk 4/6抑制剂是取代的吡咯并嘧啶化合物及其药学上可接受的盐。应了解，第一类中的一些化合物是母体化合物7-环戊基-n,n-二甲基-2-[(5-哌嗪-1-基吡啶-2-基)氨基]吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺(也称为瑞博西尼)的衍生物。第一类中的一些实施方案具有以下通式[1a]所示的化学结构，其中脂肪酸部分键合到哌嗪。
[0080][0081]
如通式[1a]中所用：
[0082]
r4选自氢、c
1-c
8-烷基、取代的c
1-c
8-烷基、c
3-c
8-环烷基、取代的c
3-c
8-环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基和取代的杂芳基；
[0083]
z为crz，其中rz选自卤素、氢、c
1-c
3-烷基、c
1-c
3-烷氧基、cn、c
═
noh、c
═
noch3、c(o)h、c(o)c
1-c
3-烷基、c
3-c
8-环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、取代的c
1-c
3-烷基、取代的c
3-c
8-环烷基、取代的杂环基、取代的芳基、取代的杂芳基、-b-nrarb、-b-ora、-b-c(o)ra、-b-c(o)ora、-b-c(o)nrara；其中b为键、c
1-c
3-烷基或支链c
1-c
3-烷基；且ra和rb各自独立地选自氢、c
1-c
3-烷基、c
3-c
8-环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、取代的烷基、取代的环烷基、取代的杂环基、取代的芳基和取代的杂芳基；且
[0084]
在脂肪酸部分中，“n”表示9至20，并且优选12至20的整数。
[0085]
应了解，也可使用药学上可接受的盐。如上所述，盐可通过使用例如选自无机酸、有机酸、烷基磺酸、乙磺酸和芳基磺酸的酸来制备。在本方法的一些优选实施方案中，第一类抗癌cdk 4/6抑制剂是具有如下所示通式[1b]的化合物。在这些实施方案中，r4是c
5-环烷基、z是二甲基甲酰胺或乙酰基、且n代表9至20且更优选12至20的整数。该通式的母体化合物是瑞博西尼，一种fda批准的用于治疗hr阳性、her2阴性的晚期或转移性乳腺癌(与芳香
化酶抑制剂一起)的药物。然而，根据式1[a]的本方法的实施方案具有在末端哌嗪处缀合的c
11-c
22
脂肪酸部分。优选地，脂肪酸部分是直链且饱和的。在一些优选的实施方案中，脂肪酸部分是月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸之一。脂肪酸部分显著提高了该化合物的细胞摄取，大大增强了其对癌症干细胞增殖的抑制作用和对肿瘤细胞的选择性。
[0086][0087]
下面示范性实施方案显示了化合物[1c]，其中r4为未取代的c
5-环烷基、z为二甲基甲酰胺，且n为12。结果，该实施方案具有14-碳脂肪酸(即，肉豆蔻酸酯)部分。已合成化合物[1c]所示的化合物，在乳腺球试验中，与已知的抗癌治疗药物瑞博西尼(浓度为1μm至100μm)相比，该化合物对mcf7细胞的抑制作用显著增强，表明脂肪酸部分对该化合物产生了难以置信的影响。在初步实验室评估中，该实施方案在低至1μm的浓度下有效地抑制100％的细胞增殖，显示出极好的抗癌功效。例如，图1显示了化合物[1c]及其母体化合物的剂量-反应曲线，并示出了由于添加脂肪酸部分而导致的改善的csc抑制。应了解，对于少至11个碳和多至22个碳的其他脂肪酸部分，预期会有类似的结果。
[0088][0089]
在本方法的一些实施方案中，第一类抗癌cdk 4/6抑制剂是如下面通式[1d]所示的取代的吡咯并嘧啶化合物。与通式[1a]相比，具有通式[1d]的化合物包括z处的脂肪酸部分。应了解，也可使用药学上可接受的盐。
[0090][0091]
如在通式[1d]中所用：
[0092]
r4选自氢、c
1-c
8-烷基、取代的c
1-c
8-烷基、c
3-c
8-环烷基、取代的c
3-c
8-环烷基、芳
基、取代的芳基、杂芳基和取代的杂芳基；
[0093]
r3选自氢、oh、c
1-c
8-烷基、取代的c
1-c
8-烷基、c
3-c
8-环烷基、c(o)c
1-c
8-烷基、c
1-c
8-卤代烷基、c
1-c
8-氰基烷基、c
1-c
8-烷基-oh、so
2-c
1-c
8-烷基、c
1-c
8-烷基-c
3-c
8-环烷基和c
1-c
8-烷氧基，当r3不是氢时，其可为取代的或未取代的；且
[0094]
在脂肪酸部分中，“n”表示9至20，并且优选12至20的整数。
[0095]
在本方法的优选实施方案中，第一类抗癌cdk 4/6抑制剂是具有如下所示通式[1e]的化合物。在这些实施方案中，r4为c
5-环烷基，r3为氢，且n表示9至20，且更优选10-20，且更优选10-16的整数。具有通式[1e]的化合物是瑞博西尼的衍生物，其中脂肪酸部分取代羧基处的二甲基-氨基。
[0096][0097]
下面示范性实施方案显示了式化合物[1f]，其中r4为未取代的c
5-环烷基、r3为氢，且n为12。结果，该实施方案具有14-碳脂肪酸(即，肉豆蔻酸酯)部分。预期化合物[1f]在乳腺球试验中显示出提高的抑制作用。
[0098][0099]
下表1总结了比较化合物[1c]及其母体化合物(瑞博西尼)的多个试验的结果，并且包含这两种化合物的体外生物学数据。当与母体化合物相比时，化合物[1c]显示在3d乳腺球试验中7倍效力提高(ic
50
为约0.2对比约1.5μm)，同时在2d细胞活力试验中保持类似的活性(两种化合物的ic
50
均为约2μm)。这表明与脂肪酸部分的缀合不仅仅显著提高了3d乳腺球试验中的效力。比较乳腺球单层选择性指数(“si”)表明，缀合也提高了对乳腺球的选择性(si 10对比1.3)。两种化合物在高达90μm的浓度对非肿瘤细胞系htert-bj1无毒，代表对肿瘤细胞系的高选择性。可以看出，根据本方法的化合物导致对肿瘤细胞的效力和选择性的显著提高。
[0100]
[0101]
表1.第一类中的示范性化合物的乳腺球试验结果。
[0102]
如表中所用，“ic
50
(mcf7乳腺球)”是指使用er+乳腺癌细胞系mcf7进行的3d乳腺球试验中最大抑制浓度的一半。术语“ic
50
(mcf7单层)”是指使用er+乳腺癌细胞系mcf7进行2d细胞活力试验中最大抑制浓度的一半。术语“ic
50
(bj1单层)”是指使用永生化非肿瘤成纤维细胞系htert-bj1进行的2d细胞活力试验中最大抑制浓度的一半。术语“si(乳腺球/单层mcf7)”是指乳腺球选择性指数，即在3d和2d试验中针对mcf7比较生物活性得到的ic
50
值之间的比。术语“si(bj1/mcf7单层)”是指癌症选择性指数，即在细胞活力试验中针对mcf7和htert-bj1比较生物活性得到的ic
50
值之间的比。
[0103]
取代的吡啶并嘧啶化合物
[0104]
第二类包含具有脂肪酸部分的取代的吡啶并嘧啶，如下面的通式[2a]所示。应了解，第二类中的一些实施方案包含6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8h-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮(也称为帕博西尼(palbociclib))的衍生物。还应了解，如本领域一般水平的技术人员所理解的，还可使用药学上可接受的盐，例如上文所提到的那些盐。其他示例盐包括苹果酸盐、酒石酸盐、溴化物、溴化氢二水合物、氯化氢、硫酸盐二水合物、樟脑磺酸盐、萘磺酸盐、萘磺酸盐二水合物、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐一水合物、马来酸盐和草酸盐。
[0105][0106]
在通式2[a]中：
[0107]
r1为氢、芳基、c
1-c8烷基、c
1-c8烷氧基、c
3-c7环烷基或c
3-c7杂环基；
[0108]
r2独立地选自氢、卤素、c
1-c8烷基、c
1-c8酰基、c
3-c7环烷基、c
1-c8烷氧基、c
1-c8烷氧基烷基、c
1-c8卤代烷基、c
1-c8羟基烷基、c
2-c8烯基、c
2-c8炔基、腈、硝基、or5、sr5、nr5r6、n(o)r5r6、p(o)(or5)(or6)、(cr5r6)mnr7r8、cor5、(cr4r5)mc(o)r7、co2r5、conr5r6、c(o)nr5so2r6、nr5so2r6、c(o)nr5or6、s(o)nr5、so2nr5r6、p(o)(or5)(or6)、(cr5r6)mp(o)(or7)(or8)、(cr5r6)
m-芳基、(cr5r6)
m-杂芳基和-cr5═
cr6c(o)r7；
[0109]
在每一实例中，r3独立地为氢、卤素、c
1-c6烷基、c
1-c6卤代烷基、c
1-c6羟基烷基或c
3-c7环烷基；
[0110]
r5、r6、r7和r8独立地为氢、c
1-c8烷基、c
2-c8烯基、c
2-c8炔基、芳烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基或杂芳基烷基；m为0至6；且
[0111]
在脂肪酸部分中，n表示9至20，并且优选12至20的整数。
[0112]
下文所示的通式[2b]是根据本方法的第二类的优选实施方案的通式。在通式[2b]中，r1为未取代的c
5-环烷基、r2为c
1-酰基(乙酰基)，r3为甲基、且n表示9至20且更优选12至20的整数。
[0113][0114]
第二类的示范性实施方案如下式化合物[2c]所示，其中r1为未取代的c
6-环烷基、r2为c
1-酰基(乙酰基)，r3为甲基，且n为12。结果，该实施方案具有14-碳脂肪酸(即，肉豆蔻酸酯)部分。已合成化合物[2c]，在乳腺球试验中，与已知的抗癌治疗药物帕博西尼(浓度为1μm至100μm)相比，该化合物对mcf7细胞的抑制作用显著增强。这些结果还表明，对于根据本方法的第二类化合物，脂肪酸部分对化合物的抗癌功效有显著的有益影响。例如，图2显示了化合物[2c]及其母体化合物的剂量-反应曲线，并示出了由于添加脂肪酸部分而导致的改善的csc抑制。应了解，对于少至11个碳和多至22个碳的其他脂肪酸部分，预期会有类似的结果。
[0115][0116]
第二类还包括如下面的通式[2d]所示的具有脂肪酸部分的取代的吡啶并嘧啶。可以看出，式[2d]中的脂肪酸部分在吡啶并[2,3-d]嘧啶处缀合，与式[2a]中所见的哌嗪相对。
[0117][0118]
在通式2[d]中：
[0119]
r1为氢、芳基、c
1-c8烷基、c
1-c8烷氧基、c
3-c7环烷基或c
3-c7杂环基；
[0120]
r2选自氢、卤素、c
1-c8烷基、c
1-c8酰基、c
3-c7环烷基、c
1-c8烷氧基、c
1-c8烷氧基烷基、c
1-c8卤代烷基、c
1-c8羟基烷基、c
2-c8烯基、c
2-c8炔基、腈、硝基、or5、sr5、nr5r6、n(o)r5r6、p(o)(or5)(or6)、(cr5r6)mnr7r8、cor5、(cr4r5)mc(o)r7、co2r5、conr5r6、c(o)nr5so2r6、nr5so2r6、c(o)nr5or6、s(o)nr5、so2nr5r6、p(o)(or5)(or6)、(cr5r6)mp(o)(or7)(or8)、(cr5r6)
m-芳基、(cr5r6)m杂芳基和-cr5═
cr6c(o)r7；
[0121]
在每一实例中，r3独立地为氢、卤素、c
1-c6烷基、c
1-c6卤代烷基、c
1-c6羟基烷基或c3-c7环烷基；
[0122]
r5、r6、r7和r8独立地选自氢、c
1-c8烷基、c
2-c8烯基、c
2-c8炔基、芳烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基或杂芳基烷基；m为0至6；且
[0123]
在脂肪酸部分中，“n”表示9至20，并且优选12至20的整数。
[0124]
下面所示的通式[2e]是根据本方法的第二类的另一优选实施方案的示例。在通式[2e]中，r1为未取代的c
5-环烷基、r2为h，r3为甲基、且n表示9至20且更优选12至20的整数。
[0125][0126]
第二类的示范性实施方案如下式化合物[2f]所示，其中r1为未取代的c
5-环烷基(例如，环戊基)、r2为h，r3为甲基，且n为12。结果，该实施方案具有14-碳脂肪酸(即，肉豆蔻酸酯)部分。
[0127][0128]
下表2总结了比较化合物[2c]及其母体化合物(帕博西尼)的多个试验的结果，并包含了这两种化合物的体外生物学数据。结果表明，与母体化合物帕博西尼相比时，化合物[2c]在3d乳腺球试验中的效力降低(ic
50
为约5.1相比约0.2μm)。然而，高达30μm的浓度化合物[2c]在2d细胞活力试验中无毒，而帕博西尼显示ic
50
为约0.1μm。此外，当比较2d和3dmcf7试验时，帕博西尼是无选择性的。这些结果表明，与正常细胞相反，化合物[2c]对3d乳腺球显示出提高的化合物选择性。因此，应了解，本方法的化合物可用于选择性靶向癌细胞，特别是csc。两种化合物在高达90μm的浓度对非肿瘤细胞系htert-bj1均无毒，，代表对肿瘤细胞系的高选择性。因此，本方法的第二类中的化合物在靶向癌症干细胞方面表现出更高的选择性。
[0129][0130]
表2.第二类中的示范性化合物的乳腺球试验结果。
[0131]
取代的苯并咪唑化合物
[0132]
第三类包括具有如下所示通式[3a]的取代的苯并咪唑化合物。还应了解，如本领域一般水平的技术人员所理解的，还可使用药学上可接受的盐，例如上文所提到的那些盐。应了解，第三类中的一些实施方案包括n-[5-[(4-乙基哌嗪-1-基)甲基]吡啶-2-基]-5-氟-4-(7-氟-2-甲基-3-丙烷-2-基苯并咪唑-5-基)嘧啶-2-胺的衍生物，也称为阿贝西利(abemaciclib)。与前两类中的化合物一样，第三类的化合物也是强效的cdk 4/6抑制剂。
[0133][0134]
在通式3a中，
[0135]
r1为脂肪酸部分其中m为0-4且更优选0-2的整数，使得当m为0时，存在与哌嗪中的氮的直接键，且n为9-20且更优选12-20的整数；
[0136]
r2为h或c
1-c3烷基；
[0137]
r3和r4为h或氟，且r3和r4中的至少一个为氟；
[0138]
r5为c
3-c5烷基、c
3-c5环烷基或环丙基-甲基；
[0139]
r6为h或c
1-c3烷基；且
[0140]
x为键、c
1-c3烷基、o、或s。
[0141]
下文所示的通式[3b]是根据本方法的第三类的优选实施方案的通式。在通式[3b]中，r1为脂肪酸部分其中m为0-4且更优选0-2的整数，使得当m为0时，存在与哌嗪中的氮的直接键，且n为9-20且更优选12-20的整数；r2为h，r3和r4为氟，r5为c3烷基(异丁基)，且r6为甲基。
[0142][0143]
下文所示的化合物[3c]是根据本方法的第三类的示范性优选实施方案的式。在一
般化合物[3c]中，r1是脂肪酸部分其中m为0且n为12，r2为h，r3和r4为氟，r5为c3烷基(异丁基)，且r6为甲基。考虑并计划评估其中n为9至20的实施方案。显示为化合物[3c]的实施方案是阿贝西利的衍生物，一种cdk 4/6抑制化合物，经fda批准用于晚期和转移性乳腺癌治疗。如本文所述，化合物[3c]和具有式[3a]的其他化合物被预期有效抑制cdk 4/6，使其特别适合用作抗癌治疗剂并选择性靶向和抑制癌细胞和csc。
[0144][0145]
第三类化合物的第二示范性实施方案如下式3d所示。在该示例中，r1是脂肪酸部分其中m为0且n为12，r2为h，r3和r4为氟，r5为c3烷基(异丁基)，且r6为甲基。如本文所述的，与化合物[3c]一样，预期该实施方案在cdk 4/6抑制和选择性方面比阿贝西利更有效，并且特别适合用作抗癌治疗剂。
[0146][0147]
下表3显示了阿贝西利的体外生物学数据。可以看出，该化合物在缀合前的3d乳腺球试验中已经具有很高的效力(ic
50
《0.04μm)。正在评估包括多种脂肪酸部分的具有式[3a]的化合物。从表3可以了解到，阿贝西利对csc高度特异和高度有效。因此，阿贝西利可作为用于特异性靶向csc的治疗剂。由于其选择性，阿贝西利可用于治疗和/或预防肿瘤复发和/或转移，以及用于靶向循环肿瘤细胞。
[0148][0149]
表3.阿贝西利的乳腺球试验结果。
[0150]
图1-3是使用乳腺球试验得出的本文所述各种化合物的剂量-反应曲线。使用mcf7细胞系进行该试验。曲线绘制为两个独立实验的平均值，且每个点的标准偏差用竖线表示。抑制百分比显示为浓度(μm)的对数的函数。图1显示了在mcf7细胞系上使用乳腺球形成试验比较化合物[1c]与其母体化合物(瑞博西尼)的剂量-反应曲线。图4显示了在mcf7细胞系上使用hoechst染色试验比较化合物[1c]与其母体化合物的剂量-反应曲线。可以看出，化合物[1c]在每种浓度下对mcf7细胞都更有效。这表明具有通式[1a]的化合物，特别是通式[1b]的化合物，具有作为有效抗癌治疗剂的功效。图7显示了在htert-bj1细胞系上使用
hoechst染色试验比较化合物[1c]与其母体化合物的剂量-反应曲线。母体化合物在大多数测试的浓度下更有效，表明具有通式[1a]，特别是通式[1b]的化合物对csc更具选择性。对于具有通式[1d]的化合物，预期效果类似。
[0151]
此外，尽管本文公开的数据涉及mcf7和htert-bj1细胞系，但本方法的化合物对其他类型的癌症有效。在先前的工作中，发明人证明线粒体生物发生抑制剂成功地抑制了多种肿瘤类型细胞系中肿瘤球体的形成。下表4列出了对线粒体生物发生抑制剂敏感的癌细胞系。鉴于这些结果，本方法对许多癌症类型有效。
[0152][0153]
表4.线粒体生物发生抑制剂对多种癌症类型有效。
[0154]
本方法描述了包含治疗有效量的来自第一类或第二类的化合物或其药学上可接受的盐以及针对其的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。根据本方法的化合物可用作抗癌治疗剂。可根据本领域已知的方法向受试者施用于药物上可接受载体中的药学上有效量的化合物。在一些实施方案中，本方法的化合物可与其他癌症疗法结合使用，例如但不限于化疗剂、线粒体生物发生抑制剂(例如，mitoriboscins、mitoketoscins、repurposcins例如antimitoscins)、放疗、光疗和热量限制(caloric restriction)。
[0155]
应当理解，本领域一般水平的技术人员可以使用本领域常见和已知的方法来开发用于特定实施方案的制剂。在一些实施方案中，药物组合物可为片剂、胶囊或丸剂形式。药物组合物可具有20mg至500mg治疗组合物的剂量。在一些实施方案中，药物组合物可包括具有200mg的治疗性化合物(例如上述化合物，例如化合物[1c])的片剂。片剂可包含至少约35％、40％、45％、50％或55％的治疗性化合物含量，以片剂核的治疗性化合物(作为游离碱(as a free base))的w/w百分比来测量。
[0156]
片剂可具有由微晶纤维素、交聚维酮a型、低取代的羟丙基纤维素、硬脂酸镁、胶体无水二氧化硅形成的核。在第一示范性实施方案中，具有200mg的治疗性化合物(例如化合物[1c])的片剂可包括具有微晶纤维素(67.44mg)、羟丙基纤维素(48.12mg)、交聚维酮
(29.20mg)、胶体二氧化硅(无水)(2.12mg)和硬脂酸镁(6.36mg)的内核，和具有交聚维酮(12.84mg)、胶体二氧化硅(无水)(1.06mg)和硬脂酸镁(8.46mg)的外核。在第二示范性实施方案中，片剂可具有约10％至约45％(w/w)的治疗性化合物(例如，化合物[2c])，且优选约18％至约28％的治疗性化合物；约4％至约18％的水溶性酸；约20％至约75％的稀释剂；约5％至约18％的崩解剂；约0.2％至约10％的润滑剂；以及，任选地，约0％至约5％的助流剂以及约0％至约15％的粘合剂。应了解，本方法的药物组合物可与包括母体化合物的药物组合物非常相似。例如，2016年4月14日提交的国际专利申请公布文本wo2016/166703描述了瑞博西尼片剂制剂的示例，且其全部内容通过引用并入。作为另一个示例，2016年5月24日提交的国际专利申请公布文本wo2016/193860描述了帕博西尼的固体剂型，且其全部内容通过引用并入。
[0157]
片剂可具有膜涂层。膜涂层可包括氧化铁黑、氧化铁红、大豆卵磷脂、聚乙烯醇(部分水解的)、滑石、二氧化钛和黄原胶。根据最终片剂的期望外观，可使用市售的包衣预预混料包覆片剂。例如，(colorcon，harleysville,pa)具有的外观是hpmc(羟丙基甲基纤维素)涂层材料，并且具有以下组成：hpmc(pharmacoat 603)71.4％、聚乙二醇7.15％、滑石7.15％和氧化铁14.3％。
[0158]
对cdk 4/6的选择性抑制还表明本文所述的化合物可用于减少或消除癌症的耐药性和/或治疗抗性。由于其对cdk和其他激酶的抑制活性，本方法的化合物也是用于研究此类激酶作用机制的有用研究工具，并且可在体外和体内使用。
[0159]
本文所述的治疗方法优选通过向需要治疗的受试者施用治疗有效量的第一类或第二类化合物来进行。使用如下所述的反应步骤容易合成这些化合物，或者可以使用替代反应步骤。本领域技术人员在查阅本发明后，容易找到替代反应步骤，并且所述替代反应步骤包括“comprehensive organic synthesis”,trost,fleming,pergamon:1991和“comprehensive organic functionalgroup transformations”,katritky,meth-cohn,rees,pergamon:1995中描述的反应步骤，并且可通过多种途径施用，包括口服和肠胃外，且毒性很小或没有毒性。
[0160]
以下缩略语可用于以下对示例性合成方法的讨论中：n-甲基吗啉(nmm)、二氯甲烷(dcm)、二甲基甲酰胺(dmf)、乙酸乙酯(etoac)、碳酸氢钠(nahco3)、硫酸钠(na2so4)、甲醇(meoh)。在下面的描述中，[m+h]
+
是指质子化分子，且指出的值为质子化分子的质量。rt是指溶质保留时间。
[0161]
分析性lc-ms：waters sunfire c18 30
×
4.6mm柱，梯度洗脱液为3-97％乙腈/含0.05％甲酸的水。时间0-6分钟。制备型hplc：lc柱：phenomenex kinetex 5μm evo c18 100 250
×
21.2mm。梯度洗脱液：含0.1％甲酸的40-95％乙腈/水。
[0162]
在第一合成实施例中，使用帕博西尼(获自lc laboratories,woburn,ma,usa)合成如上所示的化合物[2c]，也称为6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-[[5-(4-十四烷酰基哌嗪-1-基)-2-吡啶基]氨基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮。在室温下将十四烷酸(0.104g,0.46mmol)溶解于亚硫酰氯中。使溶液回流60分钟，减压浓缩，并将残留物在室温下溶解于无水dcm(2ml)中，得到0.227m的酰基氯储备溶液。将酰基氯储备溶液(0.25ml,0.057mmol)添加到dcm(1ml)和dmf(0.5ml)中的6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-[[5-(1-哌嗪基)-2-吡啶基]氨基]-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8h)-酮(0.024g,0.05mmol)和nmm(18μl,0.16mmol)的
搅拌的混合物中。将混合物在室温下搅拌90分钟。在减压下蒸发溶剂，并将残留物溶解在etoac(30ml)中，用饱和nahco3(15ml)和盐水(brine)(15ml)洗涤，然后在na2so4上干燥。干燥剂通过过滤分离，并将滤液减压浓缩以生产粗产物。粗产物用乙醚研磨，通过过滤收集所得浅棕色固体，用乙醚洗涤，并在真空下干燥，得到6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-[[5-(4-十四烷酰基哌嗪-1-基)-2-吡啶基]氨基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮(0.0145g)。lc-ms 658.2[m+h]
+
，rt 4.12分钟。
[0163]
在第二合成实施例中，使用与第一合成实施例中相同的方法合成上述化合物[1c]，也称为7-环戊基-n,n-二甲基-2-[[5-(4-十四烷酰基哌嗪-1-基)-2-吡啶基]氨基]吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺，不同之处在于将将瑞博西尼(获自lc laboratories,woburn,ma,usa)(0,022g,0.05mmol)代替帕博西尼与酰基氯储备溶液反应。粗产物在硅胶(2-4％meoh/dcm)上纯化，得到为浅棕色固体的7-环戊基-n,n-二甲基-2-[[5-(4-十四烷酰基哌嗪-1-基)-2-吡啶基]氨基]吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺(0.0166g)。lc-ms 645.2[m+h]
+
,rt 2.72分钟。
[0164]
在第三合成实施例中，由如下所示的一系列中间化合物合成上文所示的化合物[3c]，也称为1-[4-[[6-[[5-氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-甲基-苯并咪唑-5-基)嘧啶-2-基]氨基]-3-吡啶基]甲基]哌嗪-1-基]十四烷-1-酮。首先，如下所示并被称为4-十四烷酰基哌嗪-1-羧酸叔丁酯的中间化合物[4a]如下合成。在氮气气氛下，在室温向无水dcm(20ml)中的十四烷酸(1.26g,5.5mmol)和nmm(0.73ml,5.5mmol)的搅拌的溶液中添加氯甲酸异丁酯(0.65ml,5.0mmol)。4小时后，向混合物中添加1-boc-哌嗪(0.93g,5.0mmol)的无水dcm(5ml)溶液。将混合物搅拌16小时。在减压下除去溶剂，得到粗产物。将粗产物溶解在etoac(75ml)中，用2m hcl(50ml)、饱和nahco3(40ml)和盐水(30ml)洗涤，然后在mgso4上干燥。过滤后，在减压下蒸发溶剂，得到为白色固体的4-十四烷酰基哌嗪-1-羧酸叔丁酯(1.76g)。lc-ms 397.2[m+h]
+
,rt 4.02分钟。
[0165][0166]
第二，如下所示并被称为1-哌嗪-1-基十四烷-1-酮的中间化合物[4b]如下合成。在氮气气氛下将4-十四烷酰基哌嗪-1-羧酸叔丁酯(0.51g,1.26mmol)在无水dcm(10ml)和三氟乙酸或tfa(10ml)的1:1混合物中的溶液在室温下搅拌90分钟，在减压下去除溶剂，得到粗产物。将粗产物溶解在etoac(30ml)中，用饱和nahco3(15ml)和盐水(15ml)洗涤，并在mgso4上干燥。过滤后，在减压下蒸发溶剂，得到为白色蜡状固体的1-哌嗪-1-基十四烷-1-酮(0.33g)。lc-ms 297.3[m+h]
+
,rt 1.81分钟。
[0167][0168]
第三，如下所示并被称为6-[[5-氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-甲基-苯并咪唑-5-基)嘧啶-2-基]氨基]吡啶-3-甲醛的中间化合物[4c]如下制备。在密封管中将6-氨基吡啶-3-甲醛(0.076g,0.625mmol)、6-(2-氯-5-氟-嘧啶-4-基)-4-氟-1-异丙基-2-甲基苯并咪唑
(0.161g,0.500mmol)、xantphos(0.0276g,0.0476mmol)、氯化钯(0.0056g,0.0315mmol)和k2co3(0.069g,0.500mmol)在2-甲基-2-丁醇(4ml)中的悬浮液在+100℃下加热18小时。将反应混合物冷却至室温，用etoac(30ml)和水(30ml)稀释。通过过滤分离并收集带有水相的沉淀物。用水(30ml)和丙酮(20ml)洗涤浅棕色固体，并在真空下干燥，得到为浅棕色固体的6-[[5-氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-甲基-苯并咪唑-5-基)嘧啶-2-基]氨基]吡啶-3-甲醛(0.125g)。lc-ms 409.0[m+h]
+
,rt 2.07分钟。
[0169][0170]
第四，如下所示并被称为1-[4-[[6-[[5-氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-甲基-苯并咪唑-5-基)嘧啶-2-基]氨基]-3-吡啶基]-甲基]哌嗪-1-基]十四烷-1-酮的中间化合物[4d]，上文也示出为化合物[3c]如下合成。在密封管中将6-[[5-氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-甲基-苯并咪唑-5-基)嘧啶-2-基]氨基]吡啶-3-甲醛(0.050g,0.122mmol)、1-哌嗪-1-基十四烷-1-酮(0.030g,0.100mmol)和三乙酰氧基硼氢化钠(0.212g,1.00mmol)在dce(20ml)中的悬浮液在+60℃下加热90分钟。将反应混合物冷却至室温，用dcm(30ml)稀释，用水(10ml)和盐水(10ml)洗涤，并在mgso4上干燥。过滤后，在减压下蒸发溶剂，得到粗产物(0.1564g)，该粗产物通过制备型hplc纯化，得到1-[4-[[6-[[5-氟-4-(7-氟-3-异丙基-2-甲基-苯并咪唑-5-基)嘧啶-2-基]氨基]-3-吡啶基]甲基]哌嗪-1-基]十四烷-1-酮(0.012mg)。lc-ms 689.2[m+h]
+
,rt 2.44分钟。
[0171][0172]
以下段落描述结合关于本文所述数据和实施方案使用的材料和方法。应了解，在不偏离本方法的情况下，本领域一般水平的技术人员可以使用本领域普遍接受的替代材料和方法。
[0173]
在细胞培养和试剂方面，人乳腺癌细胞系(mcf-7)来自美国典型培养物保藏中心(atcc)。htert-bj1细胞来自clontech,inc.。mcf-7和htert-bj1细胞在补充有10％胎牛血清、glutamax和1％青霉素-链霉素的dmem中生长，并在37℃下在加湿5％co2培养箱中孵育。培养基每周更换2-3次。
[0174]
乳腺球形成试验：使用酶促解聚(1
×
胰蛋白酶-edta，sigma aldrich,cat.#t3924)和手动解聚(25号针)制备单细胞悬浮液。在非粘附条件下，将5000个细胞铺板于涂覆有甲基丙烯酸2-羟乙酯(聚-hema，sigma,cat.#p3932)的六孔板中的乳腺球培养基(dmem-f12/b27/20ng/ml egf/penstrep)中。使细胞生长5天，并在37℃下在大气压下在5％(v/v)二氧化碳/空气的加湿培养箱中保持。5天后，使用配备有分划目镜(graticule eye-piece)的显微镜对直径大于50μm的3d球体进行计数，并计算形成球体的细胞的百分比，并将相对于11(1＝100％mfe，即乳腺球形成效率)归一化。乳腺球试验一式三份进行，并独立
重复三次。
[0175]
根据本方法，使用基于hoechst的活力试验表征化合物的选择性，以优先靶向癌细胞。简言之，将mcf7细胞单层用浓度为1μm至100μm的化合物处理一天的时间。使用hoechst 33342(一种对活细胞中的dna染色的核染料)评估细胞活力。也平行评估了用本文所述的化合物处理的正常人成纤维细胞(htert-bj1)的活力。用读板器进行定量。
[0176]
在描述本方法的实施方案中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在为限制性的。如说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一个/种(a,an)”、和“该(the)”旨在也包括复数形式，除非上下文另有明确指示。本方法包括从以下详细描述中将变得明显的许多替代方案、修改和等效方案。
[0177]
应当理解，尽管本文可以使用术语“第一”、“第二”、“第三”、“a)”、“b)”和“c)”等来描述本方法的各种要素，但是权利要求不应受到这些术语的限制。这些术语仅用于区分本方法的一个要素与另一个要素。因此，下面讨论的第一要素可以称为一个要素方面，并且类似地，在不脱离本方法的教导的情况下，第三要素也可以称为一个要素方面。因此，术语“第一”、“第二”、“第三”、“a)”、“b)”和“c)”等并旨在传达相关要素的必需顺序或其他层次结构，而是仅用于辨别目的。操作的顺序(或步骤)不限于权利要求中呈现的次序。
[0178]
除非另外定义，否则在本文使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与本领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。还应理解，术语如常用字典中定义的那些术语应解释为具有与其在本技术和相关领域的上下文中的含义相符的含义，并且除非在本文中明确如此定义，否则不应以理想化或过于正式的含义进行解释。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献的全部内容都通过引用并入。在术语冲突的情况下，以本说明书为准。
[0179]
此外，如本文所用，“和/或”是指并涵盖一个或多个相关的所列项目中的任一个和所有可能的组合，以及当以替代方式解释时无组合(“或”)。
[0180]
除非上下文另有指示，否则特别期望的是本文描述的本方法的各种特征可以任何组合使用。此外，本方法还设想，在一些实施方案中，可以排除或省略关于示范性实施方案描述的任何特征或特征组合。
[0181]
如本文所用，过渡性措辞“主要由...组成”(和语法变体)应解释为包含所述材料或步骤”以及那些对权利要求的基本和新颖特征没有实质性影响的那些材料或步骤。因此，如本文所用，术语“主要由...组成”不应解释为等同于“包括/含(comprising)”。
[0182]
在这样描述了本方法的某些实施方案之后，应当理解，所附权利要求的范围不受上述描述中所列出的特定细节的限制，因为在不脱离下文所要求保护的精神或范围的情况下，其许多明显的变化显示是可能的。