用于检测塔卡里伯病毒和太米阿米病毒的引物探针组合、试剂盒及方法与流程

1.本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及用于检测塔卡里伯病毒和太米阿米病毒的引物探针组合、试剂盒及方法。


背景技术：

2.沙粒病毒由外膜和核衣壳组成，呈圆形，含有脂质(外)胞膜，直径约为50
‑
300nm(平均110
‑
130nm)。外膜表面覆盖有一种蛋白组成的、长度约10nm的纤突，内部可见不同数量的来自宿主细胞的核糖体，在电镜下形如沙粒样，沙粒病毒因此而得名。病毒基因组由双向分节段的单股负义链rna组成，较大的为l片段，长度约7400个核苷酸，编码rna依赖的rna聚合酶l蛋白和具有转录复制调节功能的z蛋白；较小的为s片段，长度约3400个核苷酸，编码核蛋白np和糖蛋白gp。l和s片段在病毒粒子中并非等量，而是以2：1的摩尔比存在。每个片段上的基因分别被含有发卡结构非编码区隔开，5’端无帽状结构，3’端序列保守。由于s片段较l片段更为保守，因此常用s片段进行病毒进化研究和分类鉴定。
3.根据ictv(国际病毒学分类委员会)2018年最新颁布病毒分类(https://talk.ictvonline.org/taxonomy/)，沙粒病毒科分为4个属：antennavirus、hartmanivirus、mammarenavirus和reptarenavirus，包含43个种。哺乳动物沙粒病毒属(mammarenavirus)中35个种，可分为旧世界沙粒病毒和新世界沙粒病毒，旧世界沙粒病毒中，代表病毒是淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒简称lcmv病毒。新世界沙粒病毒主要包括有4个clade，clade a有pirital，pichinde，flexal，parana和alloahuayo virus五种病毒；clade b有junin,machupo,guanarito,amapari,tacaribe,sabia,cupixi和chapare viruses八种病毒；clade c有oliveros和latino两种病毒；clade a/rec包括有whitewater arroyo,tamiami和bear canyo三种病毒；系统进化树显示lujo virus属于新世界沙粒病毒，但不在四个clade中。对人致病的沙粒病毒主要有拉沙病毒(lassa virus)引起拉沙热，胡宁病毒(junin virus)引起阿根廷出血热，马秋波病毒(machupo virus)和查帕雷病毒(chapare virus)引起玻利维亚出血热，卢约病毒(lujo virus)引起卢约出血热，瓜纳瑞托病毒(guanarito virus)引起委内瑞拉出血热，萨比亚病毒(sabid virus)引起巴西出血热，淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)引起淋巴细胞脉络丛脑膜炎。
4.塔卡里伯病毒(tacaribe virus)于1956年在特立尼达的果蝠(oryzomys gaeldi)中首次被发现，已有实验室工作者通过接触实验室气溶胶感染而致病，该病毒主要在特立尼达地区的蝙蝠中传播；太米阿米病毒(tamiami virus)于1970年在美国佛罗里达州棉鼠(sigmodon hispidus)中首次被发现，病毒主要局限在美国佛罗里达州地区的啮齿类动物中传播。
5.病毒病实验室检测主要依靠于病毒分离、血清学检测和病毒核酸检测。病毒核酸检测主要是基于pcr技术，实时荧光定量rt
‑
pcr有着快速、高灵敏度和特异度的优点，是目前运用较多的实验室检测方法。该方法基于荧光共振能量迁移的原理，通过对荧光强度变
化监测产物量的变化，随着反应时间的进行，将监测到的荧光信号的变化绘制一条曲线。该方法全程闭管操作，降低了污染的风险；对pcr产物除了可以进行定性分析，也可通过绘制标准曲线进行定量分析。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种灵敏、特异，可分别检测塔卡里伯病毒和太米阿米病毒的实时荧光定量rt
‑
pcr引物探针组合、试剂盒及方法。
7.为实现上述目的，本发明的技术方案如下：在ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy)等数据库中检索下载塔卡里伯病毒和太米阿米病毒的基因组序列，选择具有较明确分离日期和地区的较完整病毒基因组序列、标明标准株的基因组序列的病毒基因组序列。评估病毒基因组序列的方向是否需要矫正，去除个别质量差的n碱基序列，查阅相关条目信息资料，确定序列纳入标准为有清楚的病毒分离年代、地区等资料。将序列文件进行整体和局部比对分析，确定各基因序列的分类。根据序列比对分析结果，同时结合病毒基因组序列中dna聚合酶优先结合位点和最优变性温度的分析，筛选确定在各病毒基因型中高度保守的靶序列，根据靶序列分别设计特异性引物和探针，经大量筛选和人工优化获得序列分别如seq id no.1
‑
4、seq id no.5
‑
6所示的分别针对塔卡里伯病毒和太米阿米病毒的两对特异性引物和两条特异性探针，获得检测塔卡里伯病毒和太米阿米病毒检测的实时荧光定量rt
‑
pcr的引物探针组合。
8.具体而言，本发明的技术方案如下：
9.本发明提供用于塔卡里伯病毒和太米阿米病毒的实时荧光定量rt
‑
pcr检测的靶序列组合，其含有两条靶序列，所述靶序列具有如seq id no.7
‑
8所示的核苷酸序列。
10.上述靶序列组合中，塔卡里伯病毒的靶序列如seq id no.7所示，太米阿米病毒的靶序列如seq id no.8所示。上述序列在各病毒的不同基因型中具有高度的保守性且易于进行pcr扩增，可适用于各病毒不同基因型的高效检测。
11.本发明提供用于塔卡里伯病毒和太米阿米病毒的实时荧光定量rt
‑
pcr检测的引物探针组合，其含有两对特异性引物和两条特异性探针，其中，所述特异性引物的序列如seq id no.1
‑
4所示，所述特异性探针的序列如seq id no.5
‑
6所示。
12.上述特异性引物和特异性探针中，针对塔卡里伯病毒的特异性引物的序列如seq id no.1
‑
2所示，特异性探针序列如seq id no.5所示；针对太米阿米病毒的特异性引物的序列如seq id no.3
‑
4所示，特异性探针序列如seq id no.6所示。
13.作为优选，所述特异性探针分别标记产生不同荧光色的荧光基团，所述荧光基团包括荧光报告基团和荧光猝灭基团，所述荧光报告基团为选自fam、hex、texas red、cy5、tet、joe、cy3、tamra、rox、lc red640、lc red705中的任一种；所述荧光猝灭基团为选自bhq1、bhq2、bhq3、dabcyl中的任一种。
14.进一步优选地，序列如seq id no.5所示特异性探针的5’端标记fam荧光报告基团，3’端标记b h q 1荧光淬灭基团；序列如seq id no.6所示的特异性探针的5’端标记hex荧光报告基团，3’端标记bhq1荧光淬灭基团。
15.作为优选，所述试剂盒还包含塔卡里伯病毒和太米阿米病毒的阳性对照标准品。
16.所述塔卡里伯病毒的阳性对照优选为如seq id no.7所示的dna序列对应的rna或
者塔卡里伯病毒rna。所述太米阿米病毒的阳性对照优选为如seq id no.8所示的dna序列对应的rna或者太米阿米病毒rna。
17.进一步优选地，所述试剂盒还包含其它为实现实时荧光定量rt
‑
pcr检测的试剂，包括但不限于反应缓冲液、酶和水等。
18.本发明所述引物探针组合或所述试剂盒在进行分别实时荧光定量rt
‑
pcr检测时的反应程序可根据所使用的逆转录酶和聚合酶的特性确定。
19.作为优选，所述引物探针组合或所述试剂盒在进行实时荧光定量rt
‑
pcr检测时的反应程序为：50℃逆转录30min；95℃预变性10min，95℃变性15s、60℃退火60s运行40个循环。
20.采用上述反应程序，能够更好地保证塔卡里伯病毒和太米阿米病毒的高效扩增检测。
21.本发明所述引物探针组合或所述试剂盒在进行实时荧光定量rt
‑
pcr检测时的反应体系中，上游引物、下游引物和探针的摩尔比为2:2:1。更优选地，在进行实时荧光定量rt
‑
pcr检测时的25μl反应体系为：2
×
缓冲液12.5μl，10μm上游引物0.5μl,10μm下游引物0.5μl，10μm探针0.25μl，酶1μl，模板5μl，无rna水解酶的去离子水补足至25μl。
22.本发明提供的引物探针组合可在不同的反应体系中分别进行塔卡里伯病毒和太米阿米病毒的检测，以上所述的上游引物为seq id no.1、3所示引物中的任一条，下游引物为seq id no.2、4所示引物中的任一条，探针为seq id no.5、6所示的探针中的任一条。
23.本发明还提供所述的引物探针组合或所述的试剂盒在检测塔卡里伯病毒和太米阿米病毒中的应用。
24.比如，在一些实施方案中，可以通过检测人或动物的离体样本，来判断其是否感染塔卡里伯病毒和/或太米阿米病毒。在一些实施方案中，还可以检测食品(尤其是动物源性食品)或其他可能感染上述病毒的样本，以利于塔卡里伯病毒和太米阿米病毒的监测工作及流行病学研究。
25.本发明还提供一种利用实时荧光定量rt
‑
pcr分别检测塔卡里伯病毒和太米阿米病毒方法，其为以待测样品的rna为模板，利用如seq id no.1
‑
4所示的特异性引物和如seq id no.5
‑
6所示的特异性探针进行实时荧光定量rt
‑
pcr检测，根据扩增曲线判断待测样品中是否含有塔卡里伯病毒和太米阿米病毒。
26.上述提取病毒总rna的方法可采用本领域常规方法，如离心柱提取法。
27.作为优选，所述实时荧光定量rt
‑
pcr的反应程序为：50℃逆转录30min；95℃预变性10min，95℃变性15s、60℃退火60s运行40个循环。。
28.作为优选，在进行实时荧光定量rt
‑
pcr检测时的反应体系中，上游引物、下游引物和探针的摩尔比为2:2:1。更优选的，所述实时荧光定量rt
‑
pcr的25μl反应体系为：2
×
缓冲液12.5μl，10μm上游引物0.5μl,10μm下游引物0.5μl，10μm探针0.25μl，酶1μl，模板5μl，无rna水解酶的去离子水补足至25μl。
29.作为优选，上述根据扩增曲线判断待测样品中是否含有塔卡里伯病毒和太米阿米病毒的方法如下：
30.有效结果判定：阳性对照(或检测管内标)ct≤35且有扩增曲线，阴性对照管无扩增曲线或ct值>38；
31.若检测样品管中所测病原体对应荧光通道有扩增曲线且ct<35，则可判断对应的该病原体检测阳性；若检测样品在检测通道无扩增曲线或ct>38，可判样品为该病毒检测阴性；若检测样品在检测通道35<ct<38，为可疑，建议复检，若复检结果ct<38则可判样品为阳性，若复检结果无扩增曲线或ct≥38，可判样品为阴性；
32.无效结果的判定：若检测样品为阴性，则反应体系的阳性对照(或检测管内标)必须为阳性，否则该检验管结果无效，需进行复检。
33.上述结果判定中，塔卡里伯病毒的阳性对照优选为如seq id no.7所示的dna序列对应的rna或者塔卡里伯病毒rna。所述太米阿米病毒的阳性对照优选为如seq id no.8所示的dna序列对应的rna或者太米阿米病毒rna。
34.本发明所述的塔卡里伯病毒和太米阿米病毒的实时荧光定量rt
‑
pcr检测反应体系适用于所有的实时荧光定量pcr仪。
35.本发明的有益效果在于：
36.本发明结合相关病原体出现的几率、流行的风险和实验室检测过程的可操作性，形成以塔卡里伯病毒和太米阿米病毒为检测靶标的新的组合检测方案。
37.本发明通过大量序列比对分析确定了塔卡里伯病毒和太米阿米病毒高度保守的靶序列，针对确定的靶序列通过大量筛选和优化，分别获得了适用于实时荧光定量rt
‑
pcr检测的特异性引物和探针，该引物和探针在塔卡里伯病毒和太米阿米病毒的各个基因型中具有很好的普适性。
38.本发明建立了检测塔卡里伯病毒和太米阿米病毒的单独或同时实时荧光定量rt
‑
pcr检测方法。该方法在一个实时荧光定量rt
‑
pcr反应体系内，引入分别或同时针对塔卡里伯病毒和太米阿米病毒的两对特异性引物和不同标记的探针，通过实时荧光信号的动态变化，对未知样本进行定性分析；也可通过标准参考品的检测，绘制标准曲线，实现对未知模板的定量分析。与其它检测方法相比，本发明提供的检测方法具有高灵敏性和特异性、操作简便、检测时间短、所需样本量少、低污染等优点，可直接对未知样本里提取的rna进行检测，在病毒的快速检测中具有较高的应用价值。在人兽共患病发生率不断提高的形势下，本发明在疾病的早发现、早诊断方面具有重要意义。
附图说明
39.图1为本发明实施例4中实时荧光定量rt
‑
pcr检测不同浓度的塔卡里伯病毒体外转录rna模板的扩增曲线图。
40.图2为本发明实施例4中实时荧光定量rt
‑
pcr检测不同浓度的太米阿米病毒体外转录rna模板的扩增曲线图。
具体实施方式
41.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
42.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
43.实施例1塔卡里伯病毒和太米阿米病毒的特异性引物和探针的设计
44.1、引物和探针的设计和筛选
45.在ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy)等公开数据库中检索下载塔卡里伯病毒和太米阿米病毒的基因组序列。选择具有较明确分离日期和地区的较完整病毒基因组序列、标明标准株的基因组序列的病毒基因组序列。评估病毒基因组序列的方向是否需要矫正，去除个别质量差的n碱基序列，查阅相关条目信息资料，确定序列纳入标准为有清楚的病毒分离年代、地区等资料。将序列文件进行整体和局部比对分析，确定各基因序列的分类，根据序列比对分析结果筛选确定在塔卡里伯病毒和太米阿米病毒的各个基因型中高度保守的靶序列。
46.针对上述靶序列设计特异性引物和探针，同时结合病毒基因组序列中dna聚合酶优先结合位点和最优变性温度的分析进行特异性引物和探针的设计和筛选。本发明经过大量设计、筛选和对比实验发现，并非单单满足普通引物设计原则或采用引物设计软件所设计出的引物就能够实现高效特异灵敏的实时荧光定量rt
‑
pcr检测塔卡里伯病毒和太米阿米病毒。本发明针对引物、探针与靶序列的亲和力和错配率、引物之间的二级结构以及引物与靶序列之间的二级结构以及引物的gc含量、tm值、长度和扩增片段长度等进行了大量人工优化设计和筛选，最终得到如下分别针对塔卡里伯病毒和太米阿米病毒的特异性引物对和特异性探针：
47.塔卡里伯病毒：
48.特异性引物：
49.tacaribe
‑
f：5
’‑
agggtgagcagtgtcttatc(seq id no.1)
‑3’
50.tacaribe
‑
r：5
’‑
tgccttgagagtccttcctac(seq id no.2)
‑3’
51.特异性探针：
52.tacaribe
‑
p：5
’‑
attcaacctgaagactggccgactgactg(seq id no.5)
‑3’
53.太米阿米病毒：
54.特异性引物：
55.tamiami
‑
f：5
’‑
ataacctccaatatccacaccc
‑3’
(seq id no.3)
56.tamiami
‑
r：5
’‑
tgtcgtttcccacagcatc
‑3’
(seq id no.4)
57.特异性探针：
58.tamiami
‑
p：5
’‑
ttgtgagagccaggaggattctcagtttcttc
‑3’
(seq id no.6)。
59.2、引物和探针的合成
60.上述引物和探针均由上海生工生物工程有限公司合成。其中，序列如seq id no.5所示的特异性探针的5’端标记fam荧光报告基团，3’端标记black hole quencher 1荧光淬灭基团；序列如seq id no.6所示的特异性探针的5’端标记hex荧光报告基团，3’端标记black hole quencher 1荧光淬灭基团。
61.实施例2实时荧光定量rt
‑
pcr检测塔卡里伯病毒和太米阿米病毒的检测方法的建立
62.1、病毒核酸的提取收集待测病毒的细胞培养上清，采用qiaamp viral rna mini kit提取病毒核酸。
63.2、阳性标准品的制备
64.对于两种病毒，通过合成两种病毒基因的保守区(如seq id no.7
‑
8所示)作为阳
性标准品，将合成的目的基因克隆至pet
‑
28a(+)载体中，酶切位点为ndeⅰ和xhoⅰ，基因合成与质粒克隆由北京天一辉远生物公司完成。用thermo公司2
×
pcr mix试剂对克隆质粒中含有的目的基因进行普通pcr扩增，扩增引物用通用引物t7(taatacgactcactataggg，seq id no.9)和t7t(acatccactttgcctttctc，seq id no.10)。体外转录为rna，纯化回收定量而获得。采用qian公司gel extraction kit试剂盒回收纯化pcr产物，nanodrop紫外可见分光光度计对回收的dna模板定量。采用promega公司ribomaxtm large scale rna production system
‑
sf6 and t7试剂盒进行目的基因的rna体外转录，qian公司rneasy mini kit对rna体外转录产物回收。琼脂糖凝胶电泳分析体外转录获得的rna模板(sftsv
‑
np)的纯度后，使用depc处理水进行稀释后，采用nanodrop分光光度计进行3次测量，保证测量的值在100
‑
300ng/μl之间，取测量的平均值计算各纯化后rna产物的质量浓度后，采用下列公式，计算各自的拷贝数浓度：
65.y(copies/μl)＝[x(g/μl)/核苷酸的转录长度
×
340]
×
6.02
×
10
23
。
[0066]
上述操作均按照试剂盒说明进行。
[0067]
3、实时荧光定量rt
‑
pcr检测
[0068]
采用agpath
‑
id one step rt
‑
pcr kit(ambion)试剂盒进行实时荧光定量rt
‑
pcr反应，利用实施例1最终获得的特异性引物(序列如seq id no.1
‑
4所示)和探针(序列如seq id no.5
‑
6所示)进行实时荧光定量rt
‑
pcr检测。
[0069]
本发明通过优化实施例1获得的用于两种病毒检测的特异性引物和探针的反应条件，使其能够实现高效的组合检测，具体反应条件如下：
[0070]
25μl反应体系为：2
×
缓冲液12.5μl，10μm上游引物0.5μl,10μm下游引物0.5μl，10μm探针0.25μl，酶1μl，模板5μl，无rna水解酶的去离子水补足至25μl；
[0071]
反应程序为：50℃逆转录30min，95℃预变性10min，95℃变性15s、60℃退火60s运行40个循环。
[0072]
4、结果分析和判断
[0073]
检测结果需根据反应体系中所设置的阳性对照(或检测管内标)、用无rna水解酶的去离子水作为阴性对照的扩增结果和扩增曲线进行判断。
[0074]
有效结果判定：阳性对照(或检测管内标)ct≤35且有扩增曲线，阴性对照管无扩增曲线或ct值>38。
[0075]
若检测样品管中所测病原体对应荧光通道有扩增曲线且ct<35，则可判断对应的该病原体检测阳性；若检测样品在检测通道无扩增曲线或ct>38，可判样品为该病毒检测阴性；若检测样品在检测通道35<ct<38，为可疑，建议复检，若复检结果ct<38则可判样品为阳性，若复检结果无扩增曲线或ct≥38，可判样品为阴性。
[0076]
无效结果的判定：若检测样品为阴性，则反应体系的阳性对照(或检测管内标)必须为阳性，否则该检验管结果无效，需进行复检。
[0077]
实施例3实时荧光定量rt
‑
pcr检测方法的特异性分析
[0078]
以塔卡里伯病毒和太米阿米病毒体外转录合成的rna标准品作为阳性对照，将汉城病毒、汉滩病毒、发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒、登革病毒1～4型病毒，鸠宁病毒、sabia病毒、拉沙热病毒、马秋波病毒、瓜纳瑞托病毒、查帕雷病毒、卢约病毒和淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒共8种沙粒病毒rna，和100份健康人血清rna提取物作为对照病毒，对实施
例2提供的检测方法进行特异性分析。
[0079]
采用实施例2的检测方法进行实时荧光定量rt
‑
pcr检测，具体处理组设计如下：以塔卡里伯病毒和太米阿米病毒体外转录合成的rna标准品(浓度为1
×
108copies/ul)为阳性对照；以汉城病毒、汉滩病毒、发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒、登革病毒1～4型病毒，鸠宁病毒、sabia病毒、拉沙热病毒、马秋波病毒、瓜纳瑞托病毒、查帕雷病毒、卢约病毒和淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒共8种沙粒病毒rna，和100份健康人血清rna提取物进行特异性验证。
[0080]
结果如下表1所示。
[0081]
表1.三种沙粒病毒实时荧光定量rt
‑
pcr检测方法特异性分析
[0082][0083][0084]
实施例4实时荧光定量rt
‑
pcr检测方法的灵敏度(检测限)分析
[0085]
对上述提取获得的塔卡里伯病毒和太米阿米病毒体外转录的rna进行定量，根据如下公式计算rna拷贝数：y(copies/μl)＝x(g/μl)
×
6.02
×
10
23
/transcript length in nucleotides
×
340，其中y为rna拷贝数，x为rna的浓度。对上述已知浓度的rna进行10倍系列稀释，对体外转录的塔卡里伯病毒和太米阿米病毒标准品rna稀释成1
×
108copies/μl至1
×
101copies/μl共8个浓度梯度。
[0086]
以上述梯度稀释的不同浓度的rna为模板，采用实施例2中的检测方法进行实时荧
光定量rt
‑
pcr检测，，确定实施例2的检测方法的检测限。
[0087]
各病毒各浓度的扩增曲线如图1和图2所示，在图1
‑
2中，由左至右的曲线分别依次为1
×
108copies/μl至1
×
101copies/μl8个浓度梯度的扩增结果。以不同浓度样本的拷贝数为横坐标，循环阈值(ct)为纵坐标，制作标准曲线，通过所得标准曲线获得两种病毒各自的单重实时荧光rt
‑
pcr，结果如下表2所示，说明实施例2的检测方法具有良好的灵敏度。
[0088]
表2塔卡里伯病毒和太米阿米病毒的单重实时荧光定量rt
‑
pcr结果
[0089][0090]
实施例5实时荧光定量rt
‑
pcr检测方法的可重复性分析
[0091]
分别选取稀释度为1
×
106copies/μl、1
×
104copies/μl、1
×
102copies/μl的三个不同浓度梯度的塔卡里伯病毒和太米阿米病毒体外转录rna标准品为模板，分别进行5次平行重复实验验证实施例2提供的检测方法的稳定重复性。
[0092]
如表3所示，塔卡里伯病毒和太米阿米病毒各次检测实验的标准差均控制在0.5以内，变异系数1％以下，说明实施例2的检测方法具有较好的稳定性和可重复性。
[0093]
表3塔卡里伯病毒和太米阿米病毒实时荧光定量rt
‑
pcr检测方法的稳定性评价
[0094][0095]
上文中用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。