一种库德里阿兹威毕赤酵母及其在馫香型白酒发酵中的应用的制作方法

本发明涉及微生物白酒发酵
技术领域：
，具体涉及一种库德里阿兹威毕赤酵母及其在馫香型白酒发酵中的应用。
背景技术：
：馫香型白酒是湖北稻花香酒业股份有限公司开发一种创新型酒体，融合了“清酱浓”三香生产工艺。它的酿造工艺包括糖化培菌、高温堆积、入窖发酵等过程，有效地结合了小曲清香型白酒的糖化培菌，酱香型白酒的高温堆积以及浓香型白酒泥窖发酵的工艺特点，进而形成了独特的馫香型白酒生产工艺，具体为：蒸煮后的高粱加小曲进行培菌糖化，随后糖化好的酒醅配糟后加入高温大曲进行高温堆积，最后堆积好的酒醅加入中高温大曲，进入泥窖开始发酵。生产的馫香型原酒色清透明、陈香幽雅、醇厚细腻、香味谐调、绵甜爽净、回味悠长、风味独特。馫香型白酒生产使用了高温大曲、中高温大曲和小曲三种酒曲。大曲是以大麦、小麦、豌豆等为原料，经粉碎、加水混捏、压成曲醅并在人为控制的一定温度和湿度条件下形成大小不一的块状物。作为糖化发酵剂，大曲含有的丰富微生物群落、功能酶系及在制曲过程中形成的风味前体物质，是白酒质量和产量的重要保障。在大曲的制作过程中温度是一项重要的指标，根据品温的不同，大曲可分为低温大曲、中温大曲、中高温大曲和高温大曲。小曲是用米粉、米糠或麸皮，有的添加中草药或观音土，接入定量的母曲，在一定温湿度条件下制成的。小曲作为同样重要的糖化发酵剂，是白酒清香型香气的主要来源。在糖化阶段小曲按一定比例与蒸泡摊凉后的原料混合并加入，促进糖化的顺利进行，具有出酒率高，酒质稳定的优点。酵母菌株在白酒风味成分增强方面的应用科研工作者已经做了一些研究，如中国专利文献cn202010877716.5公开了固态发酵呈花果香味的酵母及其应用，该发明筛选到一株geotrichum属酵母应用于浓香型白酒生产工艺中，生产的白酒品质得到提高，酒的果香味更突出且更持久。cn202010879643.3公开了一种kazachstaniaturicensis在白酒生产中的应用。该酵母对粮食固态发酵环境适应良好,代谢旺盛,其主要挥发性风味物质为乙酸异戊酯。cn201610414698.0的申请中也公开了一株库德里阿兹威毕赤酵母，该菌株具有低产尿素、产风味，耐酒精、耐酸的特征，可以降低发酵食品中有害成分氨基甲酸乙酯的含量，应用于酿造酒、蒸馏酒及其它食品领域，保证食品安全性。上述研究表明，从酿造环境中分离得到功能微生物，经过培养再应用到白酒生产过程中，可以提高白酒中风味物质的含量，使酒的质量得以提高。虽然一株或几株产香微生物应用于白酒生产过程中不能产生白酒的所有风味物质，但对于提高其质量却有重要作用。在实际生产中，由于不同地区自然条件及企业酿造工艺的差别，白酒风味物质产生菌的种类和数量也会有差别。本发明通过分离纯化筛选出一株库德里阿兹威毕赤酵母，扩大培养后加入馫香型酒酒醅中参与微生物发酵，生长迅速，并产生大量生长代谢物，包括酯类、醇类、有机酸以及硫化物等等，这些物质作为影响白酒成品风味香气的关键因素，提高白酒的质量。技术实现要素：本发明的目的在于提供了一种库德里阿兹威毕赤酵母pichiakudriavzeviidhx19，该菌株的保藏编号为：cctccno：m2021172，该菌株具有较强的乙酸乙酯和己酸乙酯的产生能力。本发明的另一个目的在于提供了库德里阿兹威毕赤酵母在馫香型白酒发酵中的应用。为了实现上述目的，本发明采取以下技术措施：库德里阿兹威毕赤酵母dhx19，通过以下步骤筛选得到：从湖北稻花香酒业股份有限公司馫香型白酒酿造车间取糖化酒醅样品，稀释10倍，在30℃摇床中处理15min使得酵母菌活化，适当稀释后涂平板，在平板中加入氨苄抗生素，抑制细菌生长，后根据菌落形态挑取典型单菌落。通过生理生化及26srdna序列鉴定，最终筛选到一株库德里阿兹威毕赤酵母(pichiakudriavzevii)，该菌株已于2021年02月01日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：库德里阿兹威毕赤酵母pichiakudriavzeviidhx19；保藏编号：cctccno：m2021172，地址：中国武汉武汉大学。dhx19菌株具有典型的毕赤酵母生理生化特征：该菌株在酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(ypd)培养基上繁殖生长形成的菌落为近圆形，菌落白色、无光泽，中央隆凸，边缘钝齿状，灰白色，3.5-5.0mm。化能异养；嗜温；趋酸；兼性厌氧。细胞菌体杆状，紧密排列，单个、双个或成串，3.0-4.5×5.5-8.0μm。假丝酵母型菌丝；无性繁殖方式为多边芽殖。产β-葡聚糖酶。库德里阿兹威毕赤酵母在馫香型白酒发酵中的应用，所述的应用包括馫香型白酒的发酵，用于制备白酒发酵酒曲；或是直接用于发酵生产乙酸乙酯、己酸乙酯、乙缩醛、异丁醇或乙酸。与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明提供的库德里阿兹威毕赤酵母(pichiakudriavzevii)dhx19具有耐乳酸、耐盐，产酯能力强，产酸种类多，生长温度范围广等生物学特性，尤其与众不同的是该库德里阿兹威毕赤酵母dhx19产生乙酸乙酯和己酸乙酯能力强，高粱汁发酵液中两种酯含量分别可达6771.0±23.5和288.1±19.15μg/ml。本发明提供的库德里阿兹威毕赤酵母(pichiakudriavzevii)dhx19还具有四甲基吡嗪的产生能力，能赋予白酒产品保健功能。附图说明图1为库德里阿兹威毕赤酵母pichiakudriavzeviidhx19的菌落照片(左)和菌体显微照片(右)。具体实施方式本发明实施例中实验方法及条件如无特别说明，均为常规方法，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。实施例1：库德里阿兹威毕赤酵母dhx19的获得：从湖北稻花香酒业股份有限公司取糖化酒醅样品，稀释10倍，在30℃摇床中处理15min使得酵母菌活化，适当稀释后涂平板，在平板中加入氨苄抗生素，抑制细菌生长，后根据菌落形态挑取典型单菌落(乳白色扁平菌落，随着菌龄的增加，菌落表面变粗糙，边缘呈锯齿状延伸。菌体为卵圆形至长卵圆形，菌体出芽生殖后形成莲藕状连接的假丝。)。菌株具体有典型的毕赤酵母生理生化特征：该菌株在酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(ypd)培养基上繁殖生长形成的菌落为近圆形，菌落白色、无光泽，中央隆凸，边缘钝齿状，灰白色，3.5-5.0mm(图1)。化能异养；嗜温；趋酸；兼性厌氧。细胞菌体杆状，紧密排列，单个、双个或成串，3.0-4.5×5.5-8.0μm。假丝酵母型菌丝；无性繁殖方式为多边芽殖。产β-葡聚糖酶。生理生化特征：好氧，耐8％nacl。最适温度28～32℃，最高温度50℃。通过上述生理生化及26srdna序列鉴定，确定该菌株为库德里阿兹威毕赤酵母，该菌株已于2021年02月01日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：库德里阿兹威毕赤酵母pichiakudriavzeviidhx19；保藏编号：cctccno：m2021172，地址：中国武汉武汉大学。ypd培养基的配方(1l)：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，葡萄糖20g，ph自然；固体培养基再加琼脂15g。实施例2：库德里阿兹威毕赤酵母(pichiakudriavzevii)dhx19的放大培养：按葡萄糖20g/l、酵母膏10g/l、蛋白胨10g/l、nacl5g/l、kh2po43g/l(ph自然)，以65％(v/v)装液量配制发酵液，经121℃高温蒸汽消毒30min，降温至30℃，向其中接种菌龄10h的库德里阿兹威毕赤酵母种子液1％(v/v)，在30℃培养，控制搅拌转速维持溶氧(do值30％-90％)。发酵48h放罐，平板计数库德里阿兹威毕赤酵母dhx19活菌量为3.8×108cfu/ml，获得库德里阿兹威毕赤酵母(pichiakudriavzevii)dhx19发酵液。实施例3：库德里阿兹威毕赤酵母(pichiakudriavzevii)dhx19最适生长温度测定：将供试菌株按照2％接种量，接种于10ml灭菌的ypd液体培养基中，以不接种试管作空白对照，设置25℃、30℃、37℃、40℃、45℃、50℃培养24h，测定od600值，以30℃od600值为100％计算相对菌体浓度，得到菌株的最适生长温度。菌株最适生长温度为25-37℃，但在50℃菌数仍有11.1％的菌数，表现了该菌株良好的耐温能力。存活率(％)＝不同培养温度下的od600值/30℃培养温度下的od600值表1菌株在不同温度下的生长情况温度(℃)2530374550存活率(％)91.310073.719.611.1实施例4：库德里阿兹威毕赤酵母(pichiakudriavzevii)dhx19耐受乙醇性质测定：将供试菌株按照2％接种量，接种于10ml灭菌ypd液体培养基中，将培养基的乙醇浓度分别调节至0％(对照组)、2％(体积比，其余同)、5％、8％、9％、10％、12％、16％，30℃培养24h，测定od600值，作为依据分析比较每组生长情况，得到菌株的乙醇耐受情况如下：存活率(％)＝含有不同乙醇浓度的培养基培养后的od600值/不含乙醇的培养基培养后的od600值。表2菌株在不同乙醇浓度下的生长情况乙醇(％)2589101216存活率(％)94.188.256.915.51.71.11.0实施例5：库德里阿兹威毕赤酵母(pichiakudriavzevii)dhx19对乳酸的耐受力测定：将供试菌株按照2％接种量，接种于10ml灭菌ypd培养基中，使用乳酸将ypd培养基的ph值调至：3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，在最适温度30℃下培养24h，测定od600值，作为依据比较每组生长情况，得到菌株的酸耐受情况。该菌株在ph3.0-7.0范围内都表现出良好的生长性能。存活率(％)＝在培养基不同ph下培养后的od600值/培养基ph为5.0下培养后的od600值。表3菌株在乳酸调节不同ph值下生长情况ph3.04.05.06.07.0存活率(％)79.18810093.990.8实施例6：库德里阿兹威毕赤酵母(pichiakudriavzevii)dhx19产有机酸测定取高粱粉：水＝1：4(质量比)，100℃蒸2h，冷却至65℃加入葡萄糖淀粉酶(5u/ml),液化4h，加入糖化酶(5u/ml)，糖化3h，过滤离心，5000r/min离心15min，取上清液稀释糖度至10°brix，分装121℃灭菌30min即为高粱汁培养基。将库德里阿兹威毕赤酵母种子液按照1％(v/v)的接种于上述高粱汁培养基中，静置发酵5d，5000r/min离心15min取发酵上清液进行后续实验。取上述发酵上清液，12000r/min，离心5min后用0.22μm微孔滤膜对上清液进行过滤，利用安捷伦液相系统uitimate3000；设置：色谱柱c184.6×150mm，5μm；流动相20mmol/lkh2po4，ph＝2.7；进样量10μl；流动速度1.00ml/min；检测器uv210，nm；柱温：25℃系列系列参数，测定发酵上清液中有机酸含量表4.菌株产有机酸含量(μg/ml)实施例7：菌株产白酒相关挥发性物质测定取实施例6中的发酵上清液50ml，用蒸馏仪蒸馏,取5ml馏液于10ml比色管内，加入三种内标混合液(叔戊醇，乙酸正戊酯，二乙基正丁酸)200μl,摇匀，采用安捷伦7890a气相色谱仪定量分析。色谱柱型号：安捷伦cp-wax57cb；规格：50mm×0.25mm×0.20μm。仪器参数：色谱条件柱温40℃6分钟，5℃每分钟升至200℃5分钟，进样量1微升，分流比1：10，进样品温度220℃，检测器200℃。流动相为.氮气：30ml/min氢气：30ml/min；空气：300ml/min。检测结果如表5所示。表5菌株产挥发性物质含量(μg/ml)结果显示：该菌株在发酵过程中，产生大量的乙酸乙酯达到6771μg/ml，占白酒中酯类物质的主要组成部分，除此之外，产生一些醛类、醇类以及其它类型的酯类成分物质也具有较高的比重，是影响白酒风味的主要成分。实施例8：顶空固相微萃取-气质联用检测菌株挥发性香味物质含量测定：精准吸取实施例6中的发酵上清液6ml和20μl二烯丙基二硫醚稀释液(20μg/ml)一起加到15ml顶空瓶中，用盖子密封好，放入60℃水浴锅中平衡5min，将已经老化的萃取头置于瓶子的顶空部分，萃取30min。gc条件：用db－5ms型弹性石英毛细色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)进行分离；升温程序为初始温度40℃，以3℃/min的速度升至120℃，并保持2min；以10℃/min的速度升温至250℃，并保持3min；以15℃/min的速度升温至300℃；并保持2min。载气为高纯氦气(1.0ml/min)，不分流进样。ms条件：质谱采用电子轰击电离源：电子能量70ev；离子源温度230℃扫描范围35-350m/z。表6顶空固相微萃取-气质联用检测菌株挥发性香味物质(μg/ml)实施例9：库德里阿兹威毕赤酵母dhx19在馫香型白酒发酵中的应用：粮醅糖化、堆积发酵完成后，摊凉至18-21℃，按不同比例加入实施例2制备的库德里阿兹威毕赤酵母dhx19发酵液，投入量分别为粮醅量的0.01％、0.05％、0.1％(质量比)，拌匀后入池发酵，与未投入菌种的3个窖池做对比。发酵90d后，开窖检测酒醅水分、酸度、还原糖、淀粉、酒精含量及乙酸乙酯等指标，结果如表7所示，表7中的百分数为质量分数。表7库德里阿兹威毕赤酵母dhx19在馫香型白酒的应用结果显示：添加阿兹威毕赤酵母dhx19窖池酒醅中乙酸乙酯、己酸乙酯等酯类大量生成，赋予产品良好酯香味。当前第1页12